专利名称：一种减少l-亮氨酸发酵过程中副酸的方法
一种减少L-亮氨酸发酵过程中副酸的方法技术领域：
本发明涉及一种减少L-亮氨酸发酵过程中副酸的方法，本发明属于 生化工程领域。背景技术：
黄色短杆菌是工业发酵生产L-亮氨酸的常用菌株。在L-亮氨酸生 产过程中HAc、L-缬氨酸和L-丙氨酸是主要的副酸，这些副酸的大量积累严重抑制菌体活 力，使亮氨酸产量下降，同时这些副酸的存在也对亮氨酸的分离提取造成不利影响。近年来，代谢工程领域的研究结果表明，丙酮酸和乙酰辅酶A是黄色短杆菌合成 L-亮氨酸代谢网络的关键节点，另外HAc、L-缬氨酸和L-丙氨酸是L-亮氨酸分批发酵过 程的主要副产物。当EMP流量超出TCA及L-亮氨酸生物合成途径的代谢能力时，丙酮酸代 谢受阻，从而通过其它途径进一步代谢，导致副产物的生成。因此分批发酵生产L-亮氨酸 的过程中，减弱EMP途径代谢流量，降低副产物HAc、L-缬氨酸和L-丙氨酸的生成以及控制 TCA循环流量是提高L-亮氨酸得率的关键。
发明内容本发明采用在培养基中添加一定量的柠檬酸或其盐的方法来减少黄 色短杆菌生产L-亮氨酸过程中副产物HAc、L-缬氨酸和L-丙氨酸的生成。柠檬酸或其盐能够抑制丙酮酸激酶活性，导致磷酸烯醇式丙酮酸积累，而磷酸烯 醇式丙酮酸又会强烈抑制磷酸果糖激酶，同时柠檬酸可以通过加强ATP的抑制效应抑制磷 酸果糖激酶的活力。由于丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶是EMP途径的关键酶，所以发酵培养 基中添加适量柠檬酸钠可以使得EMP途径代谢流量减弱，从而减少副产物的生成。另外发 酵中后期菌体处于稳定期，HMP途径的主要作用是为L-亮氨酸合成途径的乙酰羟基酸还原 异构酶催化的反应提供还原力NADPH，因此进入HMP途径的碳架最终在GAP节点重新进入 EMP途径。HMP途径流量增加，从而还原力NADPH生成量增加，有利于L-亮氨酸的生成。适 当控制TCA循环流量对于增加L-亮氨酸的合成是必要的。因为柠檬酸合成酶是TCA循环 的限速酶，添加柠檬酸钠会竞争性抑制柠檬酸合成酶的活性。所以添加适量柠檬酸钠可以 限制TCA代谢流量，减少碳架的浪费，从而提高乙酰辅酶A进入L-亮氨酸生物合成的代谢 流，提高了 L-亮氨酸的产量。此方法在不增加额外设备和人力投入的情况下，实现了发酵过程中副酸的减少和 L-亮氨酸产量的提高，适合于工业化生产。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供的一种减少L-亮氨酸发酵过程中副酸的方法，其特征是在发酵培养 基中添加柠檬酸或其盐，使其在培养基中的浓度均为0. 01 16g/L，优选0. 05 10g/L，更 优选0. 1 5g/L。其中所说的柠檬酸盐为柠檬酸钠或柠檬酸钾。本发明根据调整代谢流分配的原理提出了减少黄色短杆菌生产L-亮氨酸过程中 副产物HAc、L-缬氨酸和L-丙氨酸的生成的方法，在发酵培养基中添加适量柠檬酸钠可以 抑制EMP途径关键酶丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活力，使得EMP途径代谢流量减弱，从而 减少副产物的生成。
具体实施方式下面通过实施例对本发明作进一步的说明，所举之例并不限制本发明的保护范 围实施例1:采用的菌株为黄色短杆菌；种子培养基(g/L)葡萄糖30，玉米浆IOmL,豆饼水解液20mL,尿素2. 0，KH2PO4 1. 0，MgSO4 0. 4，MnSO4 0. 01，Met 0. 4，VB1 300 μ g，VH 200 μ g。ρΗ 7· 0 7. 2,0. 075MPa, 20min发酵培养基(g/L)葡萄糖80，玉米浆 43. 5mL，NH4Ac 16. 7，(NH4)2S0417，KH2PO4
1.25，MgSO4 0. 5，MnSO4 0. 01，FeSO4 0. 01，Met 0. 7，Glu 0. 42，lie 0. 06，VB1 160 μ g, VH 50 μ g, CaCO3 20 (分消)，ρΗ 7· 0 7· 2，0. 075MPa, 20min培养方法从生长良好的活化斜面刮一满环菌苔转入装有40mL种子培养基的 500mL无挡板三角瓶中，9层纱布封口，置巡回式摇床(180r/min)上，28°C下振荡培养20h。 按10%的接种量接入含有发酵培养基(含有0. lg/L柠檬酸钠)的5L自动控制发酵罐中，控 制发酵液温度为28°C，通入适当空气，调节适当搅拌转速，采用分阶段供氧模式控制溶氧 0 30h为30 %，30h以后为20 %，通过自动流加液氨控制ρΗ在7. 0，通过流加适量泡敌消 泡，并通过流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在1. 0 2. 0%，发酵至64h停止。 在44h和64h测得L-丙氨酸含量分别为0. 76g/L，3. 94g/L，分别比对照实验(44hL_丙氨酸 含量 0.86g/L，64hL-丙氨酸含量 4. 75g/L)降低了 11. 6%和 17. 1%。实施例2:采用的菌株为黄色短杆菌；种子、发酵培养基(同实施例1)，发酵培养基中中添加 5. Og/L柠檬酸钠；培养方法同实施例1。在44h和64h测得L-缬氨酸含量分别为1. OOg/ L，4. 36g/L，分别比对照实验(44hL-缬氨酸含量1. 58g/L，64hL_缬氨酸含量7. 46g/L)降低 了 36. 7%和 41. 6%。实施例3:采用的菌株为黄色短杆菌；种子、发酵培养基(同实施例1)，发酵培养基中中添 加5. Og/L柠檬酸钠；培养方法同实施例1。在44h和64h测得HAc含量分别为0. 84g/L，
2.62g/L，分别比对照实验(44hHAc 含量 2. 16g/L,64hHAc 含量 10. 09g/L)降低了 61. 和 74. 0%。
权利要求
一种减少L 亮氨酸发酵过程中副酸的方法，其主要步骤为采用黄色短杆菌发酵生产L 亮氨酸过程中在培养基中加入柠檬酸或其盐来减少副酸的产生，其特征在于，在培养基中添加柠檬酸或其盐使其在培养基中的浓度为0.01～16g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是其中所说的柠檬酸盐为柠檬酸钠或柠檬酸钾。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是其中所说的柠檬酸或其盐的浓度为0.05 10g/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是其中所说的柠檬酸或其盐的浓度为0.1 5g/L。
全文摘要
一种减少L-亮氨酸发酵过程中副酸的方法。本发明涉及一种减少发酵法制备L-亮氨酸过程中的副酸的方法。本发明根据调整细胞代谢流分配的原理，采用在培养基中添加柠檬酸或其盐的方法，来有效减少L-亮氨酸发酵过程中HAc、L-缬氨酸和L-丙氨酸等副酸的形成。
文档编号C12P13/06GK101962662SQ201010527450
公开日2011年2月2日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日 公开号201010527450.8
发明者刘淑云, 史建明, 徐庆阳, 谢希贤, 陈宁 申请人:天津科技大学