专利名称：一种重组亮氨酸氨肽酶的分离纯化方法
技术领域：
一种重组亮氨酸氨肽酶的分离纯化方法，本发明涉及ー种以阴离子交換层析为主要手段的重组亮氨酸氨肽酶的分离纯化方法，属于生物制品分离纯化技术领域。
背景技术：
氨肽酶(aminopeptidases,——APs,EC 3. 4. 11)是ー类能够水解蛋白质和多肽N端氨基酸的外切蛋白水解酶，广泛存在于动植物以及微生物中。氨肽酶根据最易反应底物的不同可以分为亮氨酸氨肽酶、赖氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶等。氨肽酶在蛋白水解液脱苦和蛋白质的深度水解中有着重要作用，目前主要用于食品エ业中，包括鱼肉类加工エ业、植物类加工エ业以及以微生物为原料的加工エ业等，它可以増加游离氨基酸的量，改善风味，提高营养价值，还可以作为酱油酱料等调味品的添加剤。 目前国内的氨肽酶产品生产尚属空白，所用氨肽酶基本为国际产品，纯度较高，价格也较为昂贵，而本发明g在开发出ー种从分泌表达亮氨酸氨肽酶的重组枯草芽孢杆菌发酵液中分离纯化出高纯度、高得率的电泳级氨肽酶的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组亮氨酸氨肽酶的分离纯化方法。本发明的具体步骤如下I)将发酵液离心去除菌体，收集发酵上清液；2)将发酵上清液经过硫酸铵分级沉淀，收集的蛋白沉淀溶解后进行透析；3)将透析后的酶液加入到用Tris-HCl缓冲液A(含50mmol/L Tris, pH 8. 5)平衡好的DEAE阴离子交换柱Hiprep DEAE 16/10Fast Flow中，用Tris-HCl缓冲液B(含50mmol/L Tris, lmol/L NaCl’pH 8. 5)梯度(0-60% )洗脱4个柱体积,流速为 2. 5ml/min,收集各个出峰蛋白；4)分光光度法检测亮氨酸氨肽酶酶活，确定活性蛋白部分。本发明所述发酵液是指出发菌株为重组枯草芽孢杆菌(含连接了来源于枯草芽抱杆菌Zj016氨妝酶基因全序列的PMA5质粒，宿主菌为Bacillus subtilis WB600)。TB发酵培养基，发酵条件37°C，200rpm培养32h。所述枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶基因全序列中开放阅读框序列如SEQ ID NO. I所
/Jn ο本发明的详细的步骤为(I)将重组枯草芽孢杆菌(含连接了来源于枯草芽孢杆菌ZjOie氨肽酶基因全序列的PMA5质粒，宿主菌为Bacillus subtilis WB600)发酵，诱导表达条件为37°C，200rpm培养32h ；(2)将发酵液离心去除菌体，收集发酵上清液；(3)硫酸铵沉淀
向发酵上清液中加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，至饱和度为60%，缓慢搅拌至其完全溶解。调节PH值，使酶液的pH保持在8. 5，静置ー小时后10000 Xg低温离心IOminJg温离心去除蛋白沉淀收集上清液。再向上清液中加入硫酸铵粉末，至饱和度为70%，缓慢搅拌至其完全溶解。调节PH值，使酶液的pH保持在8. 5，静置ー小时后10000 Xg低温离心lOmin，低温离心收集蛋白沉淀。将沉淀溶解在Tris-HCl缓冲液A(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)中并且4°C透析数小时；(4) DEAE离子交换层析将透析后的酶液加入到用Tris-HCl缓冲液A(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)平衡好的 DEAE 阴离子交换柱Hiprep DEAE 16/10Fast Flow 中，用 Tris-HCl 缓冲液B(含 50mmol/L Tris, lmol/L NaCl，pH 8. 5)进行梯度洗脱，0-60%洗脱4个柱体积，流速为2. 5ml/min，收集各个出峰蛋白；(5)分光光度计法检测出峰蛋白酶活
酶活测定条件以L-亮氨酸-对硝基苯胺为底物，在50mM pH 8. 5的Tris-HCl缓冲液中加入稀释一定倍数的酶液和底物(lmM)，50°C水浴反应lOmin，在405nm下测定吸光度；酶活定义在50°C下，Imin分解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生ΙμΜ对硝基苯胺所需的酶量为ー个酶活单位(IU)。本发明的有益效果本发明提供了一种重组亮氨酸氨肽酶的分离纯化方法，该方法エ艺简单，得率高，能得到纯度较高的重组亮氨酸氨肽酶。
图I. DEAE离子交换层析色谱图；图2.重组亮氨酸氨肽酶表达SDS-PAGE图(I、蛋白分子量标准；2、发酵上清液；3、分离纯化的重组亮氨酸氨肽酶)。
具体实施例方式材料和检测方法重组枯草芽孢杆菌(含连接了来源于枯草芽孢杆菌ZjOie氨肽酶基因全序列的ΡΜΑ5 质粒,宿主菌为 Bacillus subtilis WB600)。表达培养基I. 2%胰蛋白胨，2. 4%酵母提取物，O. 4%甘油，17mM KH2P04,72mMK2HP04。氨肽酶酶活測定方法以硝基苯胺为标准品作标准曲线。恒温水浴锅调到50°C，将底物(L-leucine-p-nitroanilide, 4mmol/L) lmL、适当稀释的待测样品 ImL 和 2mLTris-HCl缓冲液(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)混合,放入水浴锅计时IOmin后,在405nm下用分光光度计测定吸光度。酶活力単位定义在50°C下，Imin分解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生I μ M对硝基苯胺所需的酶量为ー个酶活单位(IU)。实施例I重组枯草芽孢杆菌(含连接了来源于枯草芽孢杆菌ZjOie氨肽酶基因全序列的ΡΜΑ5质粒，宿主菌为Bacillus subtilis WB600)种子液按照I %的接种量转接至表达培养基中，37°C，200rpm 培养 32h。实施例2
(I)将发酵液离心去除菌体，收集发酵上清液；(2)硫酸铵沉淀向发酵上清液中加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，至饱和度为60 %，缓慢搅拌至其完全溶解。调节PH值，使酶液的pH保持在8. 5，静置ー小时后10000 Xg低温离心IOminJg温离心去除蛋白沉淀收集上清液。再向上清液中加入硫酸铵粉末，至饱和度为70%，缓慢搅拌至其完全溶解。调节PH值，使酶液的pH保持在8. 5，静置ー小时后10000 Xg低温离心lOmin，低温离心收集蛋白沉淀。将沉 淀溶解在Tris-HCl缓冲液A(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)中并且4°C透析数小时；(3) DEAE离子交换层析将透析后的酶液加入到用Tris-HCl缓冲液A(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)平衡好的 DEAE 阴离子交换柱Hiprep DEAE 16/10Fast Flow 中，用 Tris-HCl 缓冲液B(含 50mmol/L Tris, lmol/L NaCl, pH 8. 5)进行梯度洗脱，0-60%洗脱4个柱体积，流速为2. 5ml/min,收集各个出峰蛋白；(4)分光光度计法检测出峰蛋白酶活恒温水浴锅调到50°C,将底物(L-leucine-p-nitroanilide,4mmol/L) lmL、适当稀释的待测样品ImL和2mL Tris-HCl缓冲液(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)混匀，放入水浴锅计时IOmin后,在405nm下用分光光度计测定吸光度,并计算酶活。
权利要求
1.一种重组亮氨酸氨肽酶的分离纯化方法，是采用阴离子交换柱分离纯化重组亮氨酸氨肽酶。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换柱是HiprepDEAE16/10Fast Flowο
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述亮氨酸氨肽酶由重组枯草芽孢杆菌分泌表达。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌构建方法将编码成熟氨肽酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO. I连接大肠-枯草穿梭载体PMA5后转化枯草芽孢杆菌WB600，获得重组枯草芽孢杆菌。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在干，所述重组枯草芽孢杆菌的表达培养基为I.2%胰蛋白胨，2. 4%酵母提取物，O. 4%甘油，17mM KH2P04,72mM K2HP04。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌表达条件为37°C，200rpm 培养 32h。
7.权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤如下1)将发酵液离心去除菌体，收集发酵上清液；2)将发酵上清液经过硫酸铵分级沉淀，收集的蛋白沉淀溶解后进行透析；3)将透析后的酶液加入到用pH8. 5的Tris-HCl缓冲液平衡好的阴离子交換柱Hipr印DEAE 16/10Fast Flow中，用含氯化钠pH 8. 5的Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱，收集活性部分。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述用于洗脱的含氯化钠的Tris-HCl缓冲液，流速2. 5ml/min，线性范围为0-0. 6mol/L，洗脱柱体积为4个。
全文摘要
本发明公开了一种重组亮氨酸氨肽酶的分离纯化方法，是采用阴离子交换层析纯化重组亮氨酸氨肽酶，属于生物制品分离纯化技术领域。本发明方法工艺简单，得率高，能得到纯度较高的重组亮氨酸氨肽酶。
文档编号C12N9/48GK102827822SQ201210345248
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者周哲敏, 高新星, 田亚平, 崔文璟, 周丽, 丁宁 申请人:江南大学