专利名称：一种快速高效构建两点突变重组质粒的方法
技术领域：
一种快速高效构建两点突变重组质粒的方法，本发明涉及一种快速高效构建点突变重组质粒的方法，属于微生物基因工程领域。
背景技术：
PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成①模板DNA的变性模板DNA经加热至94°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退 火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55°C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”。通过巧妙设计单点突变，将质粒定点突变技术变得简单有效。设计一对包含突变位点的引物(正、反向)，和模板质粒退火后用高保真DNA聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。之后用DpnI酶切延伸产物，由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎(DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次)，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速高效构建两点突变重组质粒的方法。本发明的具体步骤如下I)把两个突变位点分别设计在两条延伸方向相向的引物上；2) PCR扩增步骤与普通PCR —致，但是延伸温度的时间设定与该重组质粒的长度有关，一般含7000b碱基数的重组质粒延伸时间约为5-8min ；3) PCR扩增步骤与普通PCR —致，但是PCR扩增循环数一般约为15_20次；4) PCR扩增完成后经DpnI酶消化模板质粒3h后直接转化感受态细胞；5)选择阳性克隆测序。本发明所述PCR扩增步骤与普通PCR —致，只是延伸温度的时间设定要根据重组质粒的长度而定，PCR扩增循环数也要尽量少一些，一般15-20次为宜，尽量减少因PCR扩增循环数过多而引起的其它突变。本发明的详细的步骤为
I)把两个突变位点分别设计在两条延伸方向相向的引物上突变位点设计的时候要注意，突变引物5 ‘端离突变位点的碱基数比3 ‘端离突变位点的碱基数要多一些，一般5 ‘端离突变位点的碱基数为15-30bp，而3 ‘端离突变位点的碱基数为6-15bp。2)设定PCR扩增程序PCR反应条件
预变性94°C4 min 变性94°CI min
退火59°CI min
延伸72°C5-8 min
最后延伸72°C5 min“变性-退火-延伸”这个过程进行15-20个循环。3) PCR扩增完成后经DpnI酶消化模板质粒3h后直接转化感受态细胞PCR扩增完成后，跑DNA凝胶电泳检验一下有弱的条带就可以了。再用DpnI酶消化模板质粒3h，之后可直接转化克隆宿主菌或表达宿主菌。4)选择阳性克隆测序本发明的有益效果本发明提供了一种快速高效构建两点突变重组质粒的方法。
图I.快速高效构建两点突变重组质粒的原理
具体实施例方式材料和检测方法臆水合酶基因B (GenBank U89363. I)来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRL-18668 ( “A stereoselective cobalt-containing nitrile hydratase”发表在 1997的 Biochemistry)。模板质粒 pET24a(+)_B。实施例II)根据腈水合酶基因序列B(GenBank U89363. I)设计引物2)把两个突变位点分别设计在两条延伸方向相向的引物上突变位点设计的时候要注意，突变引物5 ‘端离突变位点的碱基数比3 ‘端离突变位点的碱基数要多一些，一般5 ‘端离突变位点的碱基数为15-30bp，而3 ‘端离突变位点的碱基数为6-15bp。本实例希望突变腈水合酶第10位的丙氨酸为半胱氨酸和第172位的丙氨酸为半胱氨酸，根据上述引物设计原则，设计上游突变引物5 <-tggcattcacgatactggcggat￡ccatggttat-3> (如 SEQ ID NO. I所示)；下游突变引物5 <-gggctgctcgccctttccgtgtgc￡ca￡gtgtcc-3> (如 SEQ ID NO. 2所示)；下划线的核苷酸为突变位点。
3)设定PCR扩增程序PCR反应条件
预变性94°C4 min
变性94°CI min
退火59°CI min
延伸72°C5-8 min 最后延伸72°C5 min“变性-退火-延伸”这个过程进行15-20个循环。4) PCR扩增完成后经DpnI酶消化模板质粒3h后直接转化感受态细胞PCR扩增完成后，跑DNA凝胶电泳检验一下有弱的条带就可以了。然后再用DpnI酶消化模板质粒3h，之后直接转化E. coli BL21 (DE3)表达宿主菌。5)选择阳性克隆测序选择阳性克隆送生工生物工程上海股份有限公司测序，测序结果(如SEQ ID NO. 3所示)显示成功突变了第10位和第172位两个位点。
权利要求
1.一种快速高效构建两点突变重组质粒的方法，是采用把两个突变点分别设计在两个特异性引物片段上，通过一步PCR获得含两点突变的重组质粒的方法。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，一步PCR扩增得到含两点突变的重组质粒，不需要酶切、连接等传统的质粒构建方法。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，PCR扩增的模板是已经构建好的重组质粒。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，两个突变点分别设计在两个特异性引物上。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，两个引物扩增的方向相向。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR方法与普通PCR方法一致，但PCR延伸时间为延伸整个重组质粒长度的时间，一般含7000bp碱基数的重组质粒延伸时间约为5-8min。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR方法与普通PCR方法一致，但PCR扩增循环数一般约为15-20次。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，PCR扩增完成后经DpnI酶消化模板质粒3h后直接转化感受态细胞。
全文摘要
本发明公开了一种快速高效构建两点突变重组质粒的方法，是采用是把两个突变点分别设计在两个特异性引物片段上，通过一步PCR获得含两点突变的重组质粒的方法，属于基因克隆技术领域。本发明方法操作简单，具有非常高的效率和成功率。
文档编号C12N15/64GK102899345SQ20121034524
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者周哲敏, 刘义, 崔文璟, 周丽, 周月涵 申请人:江南大学