专利名称：一种从中药虎杖中制备白藜芦醇的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物有效成分提取领域，具体是一种从中药虎杖中制备白藜芦醇的工艺。
背景技术：
白藜芦酉享(又名苗三酹),化学名为3，4, 5,-三轻基二苯乙烯(3，4, 5,-trihydrolystiIbene),是含有芪类结构的非黄酮多 )类化合物。白藜芦醇是植物在受到应激时自身合成的一种抗毒素，具有重要的顺利活性，在抑制癌细胞、降低血脂、预防心血管疾病、抗氧化、延缓衰老等方面有较显著的作用，被喻为继紫杉醇之后又一新的绿色抗癌药物。主要存在于虎杖、葡萄、花生等植物中，研究表明，虎杖中白藜芦醇的含量最高。
查新发现，关于“从虎杖中提取白藜芦醇”方面的文献和专利已有报道。中国专利“从虎杖中制备高纯度白藜芦醇的工艺”(ZL201110125337)公开的是使用有机溶剂萃取，氧化铝柱层析分离纯化白藜芦醇，中国专利“一种从虎杖中提取纯化白藜芦醇的新方法”(ZL200510019788. I)公开的是采用酸催化水解，大孔吸附树脂分离纯化白藜芦醇，中国专利“虎杖苷和白藜芦醇的新制备方法”(ZL200310112538. 3)公开的是采用聚酰胺层析法分离纯化白藜芦醇，中国专利“从虎杖中提取纯化98%以上的白藜芦醇的工艺”(ZL200810032067. 8)是将虎杖先提取后发酵，采用专用的絮凝剂絮凝沉淀，氧化铝层析分离纯化白藜芦醇，目前采用碱水洗脱白藜芦醇的文献未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单，成本低，快速制备白藜芦醇的方法，其工艺步骤如下I)将虎杖药材干燥并粉碎，得虎杖粉；2)加水浸润虎杖粉，在浸润后的虎杖粉中加入复合酶，恒温发酵，使白藜芦醇的类似物虎杖苷转化成白藜芦醇；3)用乙醇回流提取；4)将提取液合并、过滤，浓缩；加入纯净水沉淀，离心，取上清液；5)上清液上大孔吸附树脂，开始用纯净水洗脱至无色，然后用碱水洗脱，收集碱水洗脱液，调pH=2. 5-3. 5，离心，取上清液；6)上清液继续上大孔吸附树脂，第一次用纯净水洗脱至无色，第二次用10%乙醇洗脱，弃去,第三次用50% 95%乙醇洗脱，收集洗脱液；7)将收集的洗脱液浓缩干燥。本发明的优选方案为I)将虎杖药材干燥并粉碎，得虎杖粉；2)加水浸润虎杖粉，在浸润后的虎杖粉中加入复合酶，置于温度控制在35°C 60°C的容器内，恒温发酵24 72小时，使白藜芦醇的类似物虎杖苷转化成白藜芦醇；
3)加入虎杖药材重量6 12倍的40-95%乙醇，回流提取；4)将提取液合并、过滤，浓缩回收乙醇至无醇味，加入I 3倍水沉淀，离心，取上
清液；5)上清液上大孔吸附树脂，开始用纯净水洗脱至无色，然后用O. 4% 1%的碱水洗脱，收集碱水洗脱液，用稀盐酸调pH=2. 5-3. 5，离心，取上清液；6)上清液继续上大孔吸附树脂，第一次用纯净水洗脱至无色，第二次用10% 35%乙醇洗脱2 3BV，弃去，第三次用50% 95%乙醇洗脱，收集3 6BV洗脱液；7)将收集洗脱液浓缩干燥。本发明提供的更优选技术方案为 (I)干燥虎杖药材粉碎到通过80目筛> 90% ；·(2)加水浸润虎杖粉；在复合酶中加入水，复合酶与水的比例为I (g) =150-250(ml)，调pH=3-5，然后加入到浸润后的虎杖粉中，置于温度控制在50°C 60°C的容器内，恒温发酵50 60小时，使白藜芦醇的类似物虎杖苷转化成白藜芦醇；(3)加入虎杖药材重量8 12倍的80%乙醇，回流提取两次，每次I 2小时；(4)将两次虎杖提取液合并、过滤，浓缩回收乙醇至基本无醇味，加入I 3倍水沉淀，离心，取上清液；(5)上清液上大孔吸附树脂，开始用纯净水洗脱至基本无色，然后用O. 4% O. 5%的碱水洗脱，收集碱水洗脱液，用O. 5mol/L稀盐酸调pH=3，离心，取上清液；(6)上清液继续上大孔吸附树脂，第一次用纯净水洗脱至基本无色，第二次用20% 25%乙醇洗脱2 3BV，弃去，第三次用50% 60%乙醇洗脱，收集3 6BV洗脱液；(7)将收集的洗脱液浓缩干燥。本发明提供的更优选技术方案中，步骤(2)中的复合酶与水的用量比为复合酶水=1 (g) :200 (ml), PH值调至5 ;复合酶的加入量与虎杖粉的重量比为复合酶虎杖粉=1-3:80-100。最优选复合酶的加入量与虎杖粉的重量比为复合酶虎杖粉=1:100。本发明中所述的碱优选强碱。如氢氧化钠、氢氧化钾等。本发明具有以下优点I、文献只有碱水提取，本发明首次采用碱水洗脱，而且在一定的浓度下，目标成分针对性比较强，杂质干扰少。2、树脂可以是AB_8、D101等对白藜芦醇有吸附的常规树脂，使用范围比较广；3、整个工艺周期短，设备简单，成本低，除了乙醇，没有其它有机试剂。4、产品纯度可达65%以上。
图I是产品的高效液相色谱图。
具体实施例方式图I是产品的高效液相色谱图实施例I :将虎杖药材干燥粉碎成虎杖粉，过80目筛，取虎杖粉100g，加水浸润；lg的复合酶加入200ml水中，调pH=5，然后拌入虎杖粉，50°C水浴上发酵48h。80%乙醇回流提取两次，第一次12倍量，I. 5h，第二次8倍量，Ih,过滤，合并提取液，浓缩至500ml，加入500ml水，离心，取上清液，上DlOl树脂(天津市海光化工有限公司)，纯净水冲洗至基本无色，然后O. 5%NaOH水溶液洗脱，收集3BV，O. 5mol/L稀盐酸调pH=3，离心，取上清液，再上DlOl树脂，第一次用纯净水洗脱至基本无色，第二次用25%乙醇洗脱3BV，第三次用60%乙醇洗脱，收集5BV60%乙醇洗脱液，洗脱液浓缩、干燥，HPLC测定，得纯度60. 2%的白藜芦醇。实施例2 将虎杖药材干燥粉碎成虎杖粉，过80目筛，取虎杖粉100g，加水浸润；Ig的复合酶加入200ml水中，调pH=5，然后拌入虎杖粉，50°C水浴上发酵52h。80%乙醇回流提取两次，第一次12倍量，I. 5h，第二次10倍量，Ih,过滤，合并提取液，浓缩至500ml，加入600ml水，离心，取上清液，上AB-8树脂(西安蓝晓科技有限公司)，纯净水冲洗至基本无色，然后O. 6%Na0H水溶液洗脱，收集3BV，O. 5mol/L稀盐酸调pH=3，离心，取上清液，再上AB-8树脂，第一次用纯净水洗脱至基本无色，第二次用30%乙醇洗脱3BV，第三次用75%乙醇洗脱，收集5BV75%乙醇洗脱液，洗脱液浓缩、干燥，HPLC测定，得纯度61. 1%的白藜芦醇。·实施例3:将虎杖药材干燥粉碎成虎杖粉，过80目筛，取虎杖粉100g，加水浸润；lg的复合酶加入200ml水中，调pH=5，然后拌入虎杖粉，50°C水浴上发酵60h。80%乙醇回流提取两次，第一次12倍量，I. 5h，第二次10倍量，Ih,过滤，合并提取液，浓缩至500ml，加入600ml水，离心，取上清液，上AB-8树脂，纯净水冲洗至基本无色，然后O. 5%Na0H水溶液洗脱，收集3BV, O. 5mol/L稀盐酸调pH=3，离心，取上清液，再上AB-8树脂，第一次用纯净水洗脱至基本无色，第二次用25%乙醇洗脱3BV，第三次用60%乙醇洗脱，收集5BV60%乙醇洗脱液，洗脱液浓缩、干燥，HPLC测定，得纯度65. 1%的白藜芦醇。实施例4 将虎杖药材干燥粉碎成虎杖粉，过80目筛，取虎杖粉80g，加水浸润；Ig的复合酶加入150ml水中，调pH=3，然后拌入虎杖粉，60°C水浴上发酵50h。80%乙醇回流提取两次，第一次8倍量，I. 5h，第二次12倍量，2h，过滤，合并提取液，浓缩至500ml，加入500ml水，离心，取上清液，上AB-8树脂，纯净水冲洗至基本无色，然后O. 4%NaOH水溶液洗脱，收集5BV，O. 5mol/L稀盐酸调pH=3，离心，取上清液，再上AB-8树脂，第一次用纯净水洗脱至基本无色，第二次用20%乙醇洗脱2BV，第三次用50%乙醇洗脱，收集6BV50%乙醇洗脱液，洗脱液浓缩、干燥，HPLC测定，得纯度62. 5%的白藜芦醇。实施例5 将虎杖药材干燥粉碎成虎杖粉，过80目筛，取虎杖粉100g，加水浸润；3g的复合酶加入250ml水中，调pH=4，然后拌入虎杖粉，35°C水浴上发酵24h。40%乙醇回流提取两次，第一次6倍量，I. 5h，第二次12倍量，2h，过滤，合并提取液，浓缩至500ml，加入1500ml水，离心，取上清液，上AB-8树脂，纯净水冲洗至基本无色，然后l%Na0H水溶液洗脱，收集4BV，0. 5mol/L稀盐酸调pH=2. 5，离心，取上清液，再上AB-8树脂，第一次用纯净水洗脱至基本无色，第二次用10%乙醇洗脱3BV，第三次用95%乙醇洗脱，收集3BV95%乙醇洗脱液，洗脱液浓缩、干燥，HPLC测定，得纯度61. 5%的白藜芦醇。实施例6
将虎杖药材干燥粉碎成虎杖粉，过80目筛，取虎杖粉80g，加水浸润；3g的复合酶加入220ml水中，调pH=3. 5，然后拌入虎杖粉，45°C水浴上发酵48h。60%乙醇回流提取两次，第一次8倍量，Ih,第二次10倍量，2h，过滤，合并提取液，浓缩至500ml，加入800ml水，离心，取上清液，上AB-8树脂，纯净水冲洗至基本无色，然后O. 5%Na0H水溶液洗脱，收集5BV，O. 5mol/L稀盐酸调pH=3. 5，离心，取上清液，再上AB-8树脂，第一次用纯净水洗脱至基本无色，第二次用30%乙醇洗脱2BV，第三次用80%乙醇洗脱，收集6BV80%乙醇洗脱液，洗脱液浓缩、干燥，HPLC测定，得纯度62. 5%的白藜芦醇。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。·
权利要求
1.ー种从中药虎杖中制备白藜芦醇的エ艺，其特征在于，包括以下步骤 1)将虎杖药材干燥并粉碎，得虎杖粉； 2)加水浸润虎杖粉，在浸润后的虎杖粉中加入复合酶，恒温发酵，使白藜芦醇的类似物虎杖苷转化成白藜芦醇； 3)用こ醇回流提取； 4)将提取液合并、过滤，浓缩；加入纯净水沉淀，离心，取上清液； 5)上清液上大孔吸附树脂，开始用纯净水洗脱至无色，然后用碱水洗脱，收集碱水洗脱液，调pH=2. 5-3. 5，离心，取上清液； 6)上清液继续上大孔吸附树脂，第一次用纯净水洗脱至无色，第二次用10%こ醇洗脱，弃去,第三次用50% 95%こ醇洗脱，收集洗脱液； 7)将收集的洗脱液浓缩干燥。
2.根据权利要求I所述的ー种从中药虎杖中制备白藜芦醇的エ艺，其特征在于，包括以下步骤 1)将虎杖药材干燥并粉碎，得虎杖粉； 2)加水浸润虎杖粉，在浸润后的虎杖粉中加入复合酶，置于温度控制在35°C 60°C的容器内，恒温发酵24 72小时，使白藜芦醇的类似物虎杖苷转化成白藜芦醇； 3)加入虎杖药材重量6 12倍的40-95%こ醇，回流提取； 4)将提取液合并、过滤，浓缩回收こ醇至无醇味，加入I 3倍水沉淀，离心，取上清液； 5)上清液上大孔吸附树脂，开始用纯净水洗脱至无色，然后用O.4% 1%的碱水洗脱，收集碱水洗脱液，用稀盐酸调pH=2. 5-3. 5，离心，取上清液； 6)上清液继续上大孔吸附树脂，第一次用纯净水洗脱至无色，第二次用10% 35%こ醇洗脱2 3BV，弃去，第三次用50% 95%こ醇洗脱，收集3 6BV洗脱液； 7)将收集洗脱液浓缩干燥。
3.根据权利要求2所述的ー种从中药虎杖中制备白藜芦醇的エ艺，其特征在于，包括以下步骤 (1)干燥虎杖药材粉碎到通过80目筛>90% ； (2)加水浸润虎杖粉；在复合酶中加入水，复合酶与水的重量体积比为I:150-250，调pH=3-5，然后加入到浸润后的虎杖粉中，置于温度控制在50°C 60°C的容器内，恒温发酵50 60小时，使白藜芦醇的类似物虎杖苷转化成白藜芦醇； (3)加入虎杖药材重量8 12倍的80%こ醇，回流提取两次，每次I 2小时； (4)将两次虎杖提取液合并、过滤，浓缩回收こ醇至基本无醇味，加入I 3倍水沉淀，离心，取上清液； (5)上清液上大孔吸附树脂，开始用纯净水洗脱至基本无色，然后用O.4% O. 5%的碱水洗脱，收集碱水洗脱液，用O. 5mol/L稀盐酸调pH=3，离心，取上清液； (6)上清液继续上大孔吸附树脂，第一次用纯净水洗脱至基本无色，第二次用20% 25%こ醇洗脱2 3BV，弃去，第三次用50% 60%こ醇洗脱，收集3 6BV洗脱液； (7)将收集的洗脱液浓缩干燥。
4.根据权利要求3所述的ー种从中药虎杖中制备白藜芦醇的エ艺，其特征在于步骤(2)中的复合酶与水的重量体积比为复合酶水=Ig 200ml,调PH值至5。
5.根据权利要求1-4中任ー权利要求所述的ー种从中药虎杖中制备白藜芦醇的エ艺，其特征在于步骤(2)中所述复合酶的加入量与虎杖粉的重量比为复合酶虎杖粉=1-3:80-100。
6.根据权利要求5所述的ー种从中药虎杖中制备白藜芦醇的エ艺，其特征在于步骤(2)中所述复合酶的加入量与虎杖粉的重量比为复合酶虎杖粉=1:100。
7.根据权利要求6中所述的ー种从中药虎杖中制备白藜芦醇的エ艺，其特征在于所述的碱为强碱。
8.根据权利要求7中所述的ー种从中药虎杖中制备白藜芦醇的エ艺，其特征在于所述的碱为如氢氧化钠、氢氧化钾。
9.根据权利要求8中所述的ー种从中药虎杖中制备白藜芦醇的エ艺，其特征在于所述大孔吸附树脂选自的DlOl树脂或西安蓝晓科技有限公司的AB-8树脂。
10.根据权利要求9中所述的ー种从中药虎杖中制备白藜芦醇的エ艺，其特征在于包括如下步骤 取干燥虎杖粉末100g，Ig的复合酶加入200ml水中，调pH=5，然后拌入药材，50°C水浴上发酵60h。80%こ醇回流提取两次，第一次12倍量，I. 5h，第二次10倍量，lh，过滤，合并提取液，浓缩至500ml，加入600ml水，离心，取上清液，上AB-8树脂，纯净水冲洗至基本无色，然后O. 5%NaOH水溶液洗脱，收集3BV，O. 5mol/L稀盐酸调pH=3，离心，取上清液，再上AB-8树脂，第一次用纯净水洗脱至基本无色，第二次用25%こ醇洗脱3BV，第三次用60%こ醇洗脱，收集5BV60%こ醇洗脱液，洗脱液浓缩、干燥，得白藜芦醇。
全文摘要
本发明提供了一种从中药虎杖中制备白藜芦醇的工艺，它包括将干燥虎杖药材粉碎过筛，加水浸润后加入复合酶，在35℃～60℃下恒温发酵24～72h；然后经乙醇提取，洗脱，收集洗脱液，浓缩、干燥而得白藜芦醇。本发明的工艺过程安全、经济、操作简便，并且易于实现从含有虎杖苷和/或白藜芦醇的植物和/或提取物中规模化生产制备高纯度的白藜芦醇。
文档编号C12P7/22GK102838456SQ20121034409
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月17日 优先权日2012年9月17日
发明者邓义德 申请人:湖南希尔天然药业有限公司, 湖南希尔药物研究有限公司