专利名称：一种难溶于水的三维丝素蛋白支架及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种三维丝素蛋白支架及其制备方法，特别涉及一种难溶于水的三维丝素蛋白支架及其制备方法与应用。
背景技术：
蚕丝是强度最好的天然纤维之一，由7(Γ80%的丝素蛋白和2(Γ30%的丝胶蛋白组成。丝素蛋白的氨基酸序列主要由“甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸一甘氨酸-丝氨酸”(GAGAGS)的重复单元构成，其中甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸占总氨基酸含量的85%以上。该重复序列绝大多数位于丝素蛋白的结晶区，并自组装成反向平行折叠链构象(anti-parallel β -sheet)结构。这些结构赋予丝素蛋白具有良好力学和缓慢降解速率的 特性。丝胶蛋白在体内会引起炎症反应,在使用前需要需进行脱胶处理(degummed)。丝素蛋白由分子量为325KD和25KD两种蛋白组成，其降解产物为氨基酸。大量的研究表明丝素蛋白具有良好的生物相容性，其体内炎症反应(inflammatory responses)要远低于胶原和聚乳酸等常用生物材料。丝素蛋白纤维作为外科缝线已有悠久的历史，经编织后作为人工韧带和组织补片已在研究领域应用。但在目前的生物材料研究领域应用更多的是再生型丝素蛋白。即丝素蛋白经过脱胶、溶解、提纯后，再通过物理、化学的方法，形成海绵状、膜状、凝胶状、微球状等形态。在丝素蛋白多孔支架制备方面，中国发明专利“丝素蛋白海绵状三维多孔材料制备方法”(CN 1262579C)中，在丝素蛋白溶液中加入醇类有机溶剂作为变性剂，经冷冻和解冻获得乳白色多孔材料，材料经醇类溶液浸洗，再冷冻、干燥获得所需材料。中国发明专利“一种丝素蛋白微孔支架的制备方法”(CN 102133432A)中，将丝素蛋白溶液与有机溶剂混合，注入模具内，获得丝素蛋白凝胶，用热水洗去凝胶中的有机溶剂，再冷冻干燥获得所述支架。中国发明专利“一种多孔蚕丝丝素蛋白材料的制备方法”(CN 101864177A)中，将丝素蛋白溶液与促凝胶剂(羧酸、聚乙二醇)混合，获得凝胶，在热干燥法获得支架。中国发明专利“一种难溶于水的丝素蛋白多孔材料及其制备方法”(CN 101857729A)中，将丝素蛋白溶液与盐溶液混合，经冷冻干燥、湿热蒸汽处理、水洗等步骤获得所需的支架。中国发明专利“一种医用微孔海绵及其制备方法”(CN 101967254A)中，将丝素蛋白溶液与PVA溶液混合，在缓慢加热过程中加入甲醛水溶液，固化成型、脱模洗涤、冷冻干燥得所述支架。中国发明专利“一种三维丝素蛋白多孔支架材料的制备方法”(CN101596327A)中，在搅拌状态的丝素蛋白溶液中加入氯化钠颗粒，静置后取沉淀部分，经模具内压缩成型、烘干、浸洗步骤获得所述支架。现有丝素蛋白海绵状支架的制备方法，基本使用了变性、促凝、交联剂等，这些添加剂在后续的步骤中洗去，或者成为支架的一部分。以氯化钠颗粒作为变性和成孔方式为例，形成的丝素蛋白凝胶沉积在氯化钠颗粒的间隙，由于间隙的不均一性，导致多孔支架孔壁厚度的不均一性，从几微米到几百微米不等，形成的丝素蛋白支架力学较高，降解速率缓慢，但完全洗去支架中少许被丝素蛋白完全包裹的氯化钠微粒并不容易。那么制备厚度为纳米级孔壁、微米级孔径、分布均匀的丝素蛋白海绵，将有良好的应用前景。针对上述问题，本发明专利期望通过最简单和最经济的工艺，获得一种难溶于水的三维丝素蛋白支架。
发明内容
本发明目的是提供一种难溶于水的三维丝素蛋白支架及其制备方法，制备工艺过程中不接触有毒物质，制备工艺简单，利于大量生产，容易控制支架的整体外形和支架内部的孔隙率、孔径参数，进而产生不同的物理和生物学性能，满足不同用途的需要；该支架的孔壁的厚度为纳米级，孔径大小为微米级，高孔隙率，孔间互通；该支架在37°C生理盐水中的溶失率小于1% ;该支架在体外作为三维细胞培养支架、三维质粒转染载体，在体内组织工程领域作为软骨支架、脂肪支架、骨支架、肌肉支架等将有巨大应用前景。本发明采用的技术方案是一种难溶于水的三维丝素蛋白支架，所述支架按如下方法制备(1)以桑蚕蚕丝为原料，经脱胶、溶解、透析，获得截留液a，将截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心，取滤液或上层离心液得到丝素蛋白溶液；(2)将步骤(I)得到的丝素蛋白溶液的质量浓度用水调整至O.广30%，倒入模具(所述模具可以为各种形状、各种材质的模具，对模具的表面平整度及光滑度没有要求，通常采用塑料材质的方形皿、圆形皿、孔板或管状容器)内，模具于-1(T-80°C冷冻2 40h，再在-4(T-110°C条件下真空冷冻干燥l(T72h，在模具内形成三维丝素蛋白支架；(3)将模具在温度5(TlO(rC，相对湿度7(Γ100%条件下放置2(T200min进行湿热交联，再在2(T60°C烘干2(Tl20min或在-4(T-110°C冷冻干燥5 12h，去除模具，获得难溶于水的三维丝素蛋白支架。进一步，步骤(2)所述模具在-2(T-50°C冷冻5 15h，再在-6(T-110°C条件下真空冷冻干燥16 48h，在模具内形成三维丝素蛋白支架。进一步，步骤(2)所述模具内加入的丝素蛋白溶液体积量为10(T20000ml/m2模具。进一步，步骤(3)所述模具在温度65 70°C，相对湿度8(Γ90%条件下放置10(Tl20min进行湿热交联。进一步，步骤(I)所述截留液a的浓缩液通过下述两种浓缩方法之一获得(a)反渗透法将透析后的透析袋放入质量浓度2(Γ60%的聚乙二醇水溶液中，静置20h进行浓缩，获得截留液a的浓缩液；所述聚乙二醇平均分子量100(T10000 ； (b)溶剂挥发法将截留液a在敞口容器内，于温度1(T60°C，相对湿度1(Γ60%的环境中静置2 30h，获得截留液a的浓缩液。进一步，步骤(I)所述截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心方法为下列之一
a)将截留液a或截留液a的浓缩液于4°C、300(T6000g条件下离心5 20min，弃去沉淀，取上层溶液即为所述的丝素蛋白溶液；b)将截留液a或截留液a的浓缩液用孔径为2 20 μ m的滤器过滤，去除不溶性颗粒，滤液即为所述的丝素蛋白溶液。进一步，步骤(I)所述脱胶、溶解、透析方法为a)脱胶将IOOg桑蚕蚕丝放入4 8L的2M碳酸钠水溶液中，9(Tl00°C水浴2(T60min，纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在2(T60°C烘干，获得干燥后的丝素蛋白；b)溶解将上述干燥后的丝素蛋白溶于9 11M的溴化锂水溶液中，55飞5°C水浴3(T300min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；所述干燥后的丝素蛋白与溴化锂水溶液的质量体积比为O. Γ0. 2:1 ；c)透析将含丝素蛋白的混合液用截留分子量100(Γ20000道尔顿的透析袋进行透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水作为透析液在3天透析1(Γ12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液a。
本发明所述难溶于水的三维丝素蛋白支架应用于体外三维细胞培养载体或三维质粒转染载体，或者所述难溶于水的三维丝素蛋白支架应用于体内组织工程领域的软骨支架、脂肪支架、骨支架或肌肉支架等，将有巨大应用前景。本发明所述难溶于水的三维丝素蛋白支架，支架的孔隙率、孔径、孔壁厚度等参数主要取决于所用的丝素蛋白溶液浓度，这些参数也受冷冻的温度和冷冻程序的影响。大致趋势是丝素蛋白溶液的浓度越高，获得支架的孔径越小，孔隙率越低，孔壁越厚。缓慢的冷冻过程将获得更均一的内部结构。模具的形状将直接影响支架的整体外形，支架脱模后，仍可以按照切割成需要的形状。本发明所述截留液a和截留液a的浓缩液均为不同浓度的丝素蛋白溶液，为便于表述而命名，字母本身没有含义。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明目的是提供一种难溶于水的三维丝素蛋白支架及制备方法和应用，制备工艺中不接触有毒物质，未使用变性、促凝和交联等添加剂，制备工艺简单，利于大量生产；该支架以丝素蛋白为原料，现有的研究表明丝素蛋白及其降解产物(氨基酸)拥有良好的生物相容性；该支架为纳米级孔壁微米级孔径，在体外应用方面可以作为三维细胞培养载体，利于细胞的生物学研究和扩增，亦可作为三维质粒转染的载体，提高质粒转染效率；在体内应用方面可以作为软骨支架、脂肪支架、骨支架和肌肉支架，具有巨大应用前景。
图I实施例2制备的难溶于水的三维丝素蛋白支架的电镜扫描图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I (丝素蛋白浓度30%)(I)丝素蛋白溶液的制备a)脱胶将IOOg桑蚕蚕丝(浙江华芝丝绸有限责任公司，5A级)放入5L的2M碳酸钠水溶液中，98°C水浴30min，纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在50°C烘干，获得70g干燥后的丝素蛋白，备用；b)溶解将上述干燥后的丝素蛋白以质量体积比O. 2 :1溶于9. 3M的溴化锂(LiBr)水溶液中，60°C水浴90min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液；c)透析将混合液用再生纤维素透析袋(截留分子量4000道尔顿)透析，用10倍混合液体积的无菌纯水在3d透析12次，去除溶液中的LiBr离子，获得截留液a ；d)浓缩将透析后的透析袋放入5倍体积的质量浓度50%聚乙二醇(PEG，分子量7000)水溶液，室温静置浓缩8h，取截留液b，即获得截留液a的浓缩液；e)将截留液b在水平转子5000g，4°C，离心lOmin，除去底部的未溶解丝素蛋白和溴化锂中可能存在不溶性颗粒，取上清液，即获得提纯后的丝素蛋白溶液300ml ；f)浓度测定取提纯后的丝素蛋白溶液10ml，在平皿内烘干，质量差法测得丝素蛋白溶液质量浓度为30%。丝素蛋白溶液4°C保存备用。(2)用纯化水将质量浓度30%的丝素蛋白溶液的浓度调整至20% (先量取30%丝素蛋白溶液在60°C烘干至恒重测量丝素蛋白溶液的含水量，进而计算将其浓度调整至20%时所需的纯化水量)。在模具(24孔板)内加入质量浓度20%的丝素蛋白溶液，每孔I. 5ml,在温度_20°C，静置冷冻10h，再在-80°C，静置冷冻20h，将模具在_80°C冷阱的真空冷冻干燥系统内干燥30h，在模具内形成三维丝素蛋白支架；(3)将模具在 温度70V，相对湿度90%条件下放置150min进行湿热交联，然后在50°C鼓风干燥箱内干燥lOOmin，去除模具，获得难溶于水的三维丝素蛋白支架。实施例2 (丝素蛋白溶液浓度5%)(I)丝素蛋白溶液的制备a)脱胶将IOOg桑蚕蚕丝(浙江华芝丝绸有限责任公司，5A级)放入5L的2M碳酸钠水溶液中，98°C水浴30min，纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在50°C烘干，获得70g干燥后的丝素蛋白，备用；b)溶解将上述干燥后的丝素蛋白以质量体积比O. 2 :1溶于9. 3M的溴化锂(LiBr)水溶液中，60°C水浴90min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液；c)透析将混合液用再生纤维素透析袋(截留分子量4000道尔顿)透析，用10倍混合液体积的无菌纯水在3d透析12次，去除溶液中的LiBr离子，获得截留液a ;d)将截留液b在水平转子5000g，4°C，离心lOmin，除去底部的未溶解丝素蛋白和溴化锂中可能存在不溶性颗粒，取上清液，即获得提纯后的丝素蛋白溶液IlOOml ;e)浓度测定取提纯后的丝素蛋白溶液10ml，在平皿内烘干，质量差法测得丝素蛋白溶液质量浓度为4%。f)浓缩将敞口容器称重，倒入质量浓度为4%的丝素蛋白溶液，于温度50°C鼓风干燥箱内干燥5h，再次称重测算浓缩后丝素蛋白溶液的浓度为12%，丝素蛋白溶液4°C保存备用。(2)将丝素蛋白溶液用纯化水浓度调整为5%，在模具(24孔板)内加入质量浓度5%的丝素蛋白溶液，每孔I. 5ml，在温度-20°C，静置冷冻10h，再在_40°C，静置冷冻20h，其它操作同实施例1，获得难溶于水的三维丝素蛋白支架，扫描电镜图见图I所示。实施例3 (丝素蛋白溶液浓度1%)(I)丝素蛋白溶液的制备a)脱胶将IOOg桑蚕蚕丝(浙江华芝丝绸有限责任公司，5A级)放入5L的2M碳酸钠水溶液中，98°C水浴30min，去离子水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在50°C烘干，获得70g干燥后的丝素蛋白，备用；
b)溶解将丝素蛋白以质量体积比0. 20 1溶于9. 3M的溴化锂(LiBr)水溶液中，60°C水浴90min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液；c)透析将混合液用再生纤维素透析袋(截留分子量2000道尔顿)透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水在3d透析12次，去除溶液中的LiBr离子，获得截留液a ；d)将截留液a用孔径IOym的滤器，除去底部的不溶性颗粒，取滤液即获得提纯后的丝素蛋白溶液1200ml ;e)浓度测定取提纯后的丝素蛋白溶液10ml，在平皿内烘干，质量差法测得丝素蛋白溶液的质量浓度为4%。丝素蛋白液4°C保存备用。(2)将丝素蛋白溶液浓度用纯化水调整为1%，在模具(24孔板)内加入质量浓度1%的丝素蛋白溶液，每孔I. 5ml，在温度-40°C，静置冷冻30h ;将模具在_80°C冷阱的真空冷冻干燥系统内干燥30h，在模具内形成三维丝素蛋白支架；(3)将模具在温度70V，相对湿度88%条件下放置120min进行湿热交联，然后在温度_40°C，静置冷冻IOh ;将模具在-80°C冷阱的真空冷冻干燥系统内干燥24h，去除模具，获得难溶于水的三维丝素蛋白支架。实施例4 (丝素蛋白溶液浓度O. 1%)(I)丝素蛋白溶液的制备同实施例3，获得质量浓度为4%丝素蛋白溶液。(2)将丝素蛋白溶液浓度用纯化水调整为O. 1%，在模具(24孔板)内加入质量浓度O. 1%的丝素蛋白溶液，每孔I. 5ml，在温度_80°C，静置冷冻30h ;将模具在_80°C冷阱的真空冷冻干燥系统内干燥30h，在模具内形成三维丝素蛋白支架；
(3)将模具在温度70V，相对湿度90%条件下放置120min进行湿热交联，然后在温度_40°C，静置冷冻5h ;将模具在_80°C冷阱的真空冷冻干燥系统内干燥20h，去除模具，获得难溶于水的三维丝素蛋白支架。
权利要求
1.一种难溶于水的三维丝素蛋白支架，其特征在于所述支架按如下方法制备(1)以桑蚕蚕丝为原料，经脱胶、溶解、透析，获得截留液a，将截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心，取滤液或上层离心液得到丝素蛋白溶液；(2)将步骤(I)得到的丝素蛋白溶液的质量浓度用水调整至O. I 30%，倒入模具内，模具于-1(T-80°C冷冻2 40h，再在-4(T-110°C条件下真空冷冻干燥l(T72h，在模具内形成三维丝素蛋白支架；(3)将模具在温度5(TlO(rC，相对湿度70 100%条件下放置2(T200min进行湿热交联，再在2(T60°C烘干2(Tl20min或在-4(T-110°C冷冻干燥5 12h，去除模具，获得难溶于水的三维丝素蛋白支架。
2.如权利要求I所述的难溶于水的三维丝素蛋白支架，其特征在于步骤(2)所述模具在-2(T-50°C冷冻5 15h，再在-6(T-110°C条件下真空冷冻干燥16 48h，在模具内形成三维丝素蛋白支架。
3.如权利要求I所述的难溶于水的三维丝素蛋白支架，其特征在于步骤(2)所述模具内加入的丝素蛋白溶液体积量为10(T20000ml/m2模具。
4.如权利要求I所述的难溶于水的三维丝素蛋白支架，其特征在于步骤(3)所述模具在温度65 70°C，相对湿度8(Γ90%条件下放置10(Tl20min进行湿热交联。
5.如权利要求I所述的难溶于水的三维丝素蛋白支架，其特征在于步骤(I)所述截留液a的浓缩液通过下述两种浓缩方法之一获得(a)反渗透法将透析后的透析袋放入质量浓度2(Γ60%的聚乙二醇水溶液中，静置f 20h进行浓缩，获得截留液a的浓缩液；所述聚乙二醇平均分子量100(Tl0000 ;(b)溶剂挥发法将截留液a在敞口容器内，于温度1(T60°C，相对湿度1(Γ60%的环境中静置2 30h，获得截留液a的浓缩液。
6.如权利要求I所述的难溶于水的三维丝素蛋白支架，其特征在于步骤(I)所述截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心方法为下列之一 a)将截留液a或截留液a的浓缩液于4°C、300(T6000g条件下离心5 20min，弃去沉淀，取上层溶液即为所述的丝素蛋白溶液；b)将截留液a或截留液a的浓缩液用孔径为2 20 μ m的滤器过滤，去除不溶性颗粒，滤液即为所述的丝素蛋白溶液。
7.如权利要求I所述的难溶于水的三维丝素蛋白支架，其特征在于步骤(I)所述脱胶、溶解、透析方法为a)脱胶将IOOg桑蚕蚕丝放入4 8L的2M碳酸钠水溶液中，9(Tl00°C水浴2(T60min，纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在2(T60°C烘干，获得干燥后的丝素蛋白；b)溶解将上述干燥后的丝素蛋白溶于iTllM的溴化锂水溶液中，55飞5°C水浴3(T300min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；所述干燥后的丝素蛋白与溴化锂水溶液的质量体积比为O. Γ0. 2:1 ；c)透析将含丝素蛋白的混合液用截留分子量100(Γ20000道尔顿的透析袋进行透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水作为透析液在3天透析1(Γ12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液a。
8.如权利要求广7之一所述的难溶于水的三维丝素蛋白支架在三维细胞培养载体、三维质粒转染载体、软骨支架、脂肪支架、骨支架或肌肉支架中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种难溶于水的三维丝素蛋白支架及其制备与应用将质量浓度为0.3~30%的丝素蛋白溶液注入模具内，经冷冻干燥获得三维丝素蛋白支架；将模具在温度50~100℃，相对湿度70~100%条件下湿热交联20~200min，再烘干去除模具，获得难溶于水的三维丝素蛋白支架；本发明以丝素蛋白为原料，生物相容性好；制备工艺无毒环保，易于控制支架形状和支架孔径、孔隙率参数；支架为纳米级孔壁微米级孔径，模拟了细胞外基质微环境，应用于体外作为三维细胞培养载体、三维质粒转染载体；体内组织工程领域作为软骨支架、脂肪支架、骨支架、肌肉支架等方面。
文档编号C12N5/00GK102847197SQ20121034397
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月17日 优先权日2012年9月17日
发明者陈隆坤, 其他发明人请求不公开姓名 申请人:浙江星月生物科技股份有限公司