专利名称：一种利用农杆菌介导的光皮桦转基因方法
技术领域：
本发明涉及一种利用农杆菌介导培养转基因光皮桦的方法。2.背景技术
光皮桦(Betula Iuminifera H. Wink.)为桦木科桦木属的落叶高大乔木,天然分布于我国秦岭、淮河流域以南的14个省区，是木材材质优良的阔叶珍贵用材树种，且具有耐贫瘠、速生、开花早等特性，现已成为中国南方地区杉木、松树地更新的最重要珍贵造林树种，也是良好的林木遗传学研究材料。该树种的育种工作已全面启动，在不同种源区选择了优良单株，并进行杂交创制新种质，建立其转基因技术平台对于开展光皮桦分子育种，创制抗虫、抗旱新种质以及验证已克隆基因的功能等均具有十分重要的作用。
转基因技术指利用分子生物学技术，将某些抗逆、抗病虫等已知功能性状的基因， 通过现代科技手段移植到目标生物体中，从而对植物各种性状进行改良的方法。其常用的方法有农杆菌介导法；基因枪法；电击和聚乙二醇(PEG)法和花粉管通道法。迄今为止， 国内外已得到60种以上转基因植物，其中棉花、烟草和大豆等已大面积种植。通过转基因技术，可以改变光皮桦的遗传物质，提高其抗虫、抗旱和木材品质，从而降低生产成本，提高经济效益。
CN200910113862. 4公开了谌红辉的“光皮桦叶芽组织培养快速繁殖技术”发明专利技术，以光皮桦叶芽为外植体，诱导再生植株，这种方法虽然繁殖系数较高，但选材时间较难，而采用种子和叶片作为外植体采样比较方便且可以多次采集。3.发明内容
本发明要解决的技术问题是建立光皮桦组培体系并利用农杆菌介导培养光皮桦转基因植株。
解决上述技术问题的技术方案是按如下步骤进行
(I)培养基配方
预培养培养基配方MS+TDZ0.4mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5. 5g/ L (PH5. 9)
共培养培养基配方MS+TDZ0.4mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6g/ L+AS300ymol/L (PH5. 5)
选一培养基配方MS+TDZ0.4mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5. 5g/ L+Carb500mg/L+Hygl0mg/L
(PH5. 9)
选二、选三培养基配方MS+BA0.5mg/L+TDZ0. lmg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5. 5g/ L+Carb500mg/L+Hygl0mg/L
(PH5. 9)
生根培养培养基配方l/2MS+IBAlmg/L+蔗糖 20g/L+ 琼脂 5. 5g/L (PH5. 9)
AS(乙酰丁香酮)、Carb (羧苄青霉素)和Hyg (潮霉素)都在培养基倒板前温度低于50°C时再加入，防止失效。
(2)光皮桦组培苗的准备
A :种子消毒灭菌将收集的光皮桦种子放入50ml无菌离心管中，倒入70%酒精消毒1-2分钟；倒去酒精，加入40ml O. I %升汞溶液，浸泡5min ;倒去升汞溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。
B :小苗诱导与继代培养将灭好菌的种子放在无菌滤纸上吸干水分，置入MS培养基中；操作完毕后用封口膜(MicroporeTM Surgical Tape)封好培养皿，在25°C-28°C下光照培养2周；将发芽的小苗置入继代培养基1/2MS，每瓶3-4株，培养2-3个月(25°C -28°C 下光照培养)。
⑶预培养
选取长势较好的组培苗的叶片为外植体。选取其前3片较幼嫩的叶片，用剪刀在叶片上剪2-3道伤口(深达叶脉)，较大的叶片可剪成O. 5cm大小，接入预培养培养基，每皿 40-50片，暗培养7天。
(4)农杆菌培养
挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100 μ I于5mlYEP (含50mg/LKan 和50mg/LStr)培养基中，28°C，250rpm振荡培养20_36h至饱和，再按O. 2% -O. 3%的比例， 转入含有抗生素的YEP培养基中，相同条件下培养12-16h，当0D600的值为O. 8-1. O时即可用于转化。
(5)转化和共培养
A :取培养好的菌液IOOml分装于50ml离心管中，4000rpm,离心20-30min,去上清。用含300 μ mo I/LAS的IOOmlMS感菌液(PH5. 5)制成悬浮液，使菌液0D600终浓度为
B :将预培养过的光皮桦叶片放入农杆菌悬浮液中侵染20min ；
C :取出叶片，置于无菌滤纸上浙干10_20min ；
D :将叶片置于共培养培养基上，25°C暗培养5天。
(6)选择培养
A :将共培养好的叶片转入选一培养基中，每皿10-12片或每瓶4-5片，25°C -28°C 光照培养3-4周；
B :将选一培养基上长出的带芽原基和微芽的愈伤块，转入选二培养基，每瓶4-5 块，光照培养4周；
C :将选二上未达到生根要求的小苗和愈伤组织继续转入选三培养基，每瓶4-5 块，光照培养4周。
(7)生根培养
将长至Icm以上的小苗，转入生根培养基中培养，每瓶接1-2株。
(8)驯化移栽
A、选取长势较好(根部和茎叶分化的较好)的试管苗，打开盖子，炼苗1-3天；
B、将幼苗取出，洗净小苗根部附着的培养基，然后移栽于温室花盆中(基质由泥炭珍珠岩蛭石按I : I : I配制)，再用1000倍液多菌灵浇透，盖膜一周，每天浇水，保证湿度，促进生根。
本发明的有益效果是(1)利用光皮桦种子和无菌苗叶片作为外植体材料，建立了其较完善的无菌组培快繁体系。(2)在光皮桦组培快繁体系的基础上，建立了其转基因体系(农杆菌介导)，为以后转基因植株的选择创建了基础。4.
图I :光皮桦组培苗；图2 :预培养7天后的叶片；图3 :共培养5天后的叶片；图4 : 选一培养基培养3-4周后长出的愈伤组织；图5 :选二培养基培养4周后长出的小苗；图6 : 选三培养基培养4周后长出的小苗；图7 :小苗生根培养。5.具体实施方式
下面结合实施例作进一步详述
实施 例I23培养阶段选一培养阶段选二培养阶段生根培养阶段培养基MS+TDZO. 4mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖30g/L+琼脂5. 5 g/L +Carb500mg/L+Hygl0mg/LMS+BAO. 5mg/L+TDZ0. lmg/L+蔗糖 30g/L+琼脂 5. 5g/L +Carb500mg/L+Hygl0mg/Ll/2MS+IBAlmg/L+蔗糖 20g/L+琼脂 5. 5g/L培养时间3-4周4周2周培养材料共培养后的愈伤组织选一培养后带芽的愈伤组织筛选培养后得到的小苗成功率%46.856. 86100
实施例I :将共培养5天后的叶片转入选一培养基中，每皿接种10-12片， 250C _28°C下光照培养3-4周，之后统计有效培养数并计算出选一培养阶段的再生率；
实施例2 :选取选一培养基上长出带芽原基和微芽的愈伤块，转入选二培养基，每瓶接种4-5块，25°C _28°C下光照培养4周，之后统计有效培养数并计算出选二培养阶段的成苗率；
实施例3 :将选择培养得到的高于Icm的小苗转接到生根培养基中，在相同培养条件下进行生根培养，待长有5条健壮根系即可进行炼苗移栽。
总之本方法的关键在于接种材料的选择和处理、培养基的成分含量和培养条件及培养时间的选择。
权利要求
1.ー种利用农杆菌介导的光皮桦转基因方法，其技术方案按如下步骤进行 (1)培养基配方 预培养培养基配方MS+TDZO. 4mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5. 5g/L(PH5. 9)共培养培养基配方MS+TDZO. 4mg/L+NAA0. 05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+AS300ymol/L (PH5. 5) 选ー培养基配方MS+TDZO. 4mg/L+NAA0. 05mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂 5. 5g/L+Carb500mg/L+HyglOmg/L (PH5.9) 选 ニ、选三培养基配方MS+BA0. 5mg/L+TDZ0. lmg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5. 5g/ L+Carb500mg/L+Hygl0mg/L (PH5.9) 生根培养培养基配方l/2MS+IBAlmg/L+蔗糖20g/L+琼脂5. 5g/L (PH5. 9) AS(こ酰丁香酮)、Carb (羧苄青霉素)和Hyg (潮霉素)都在培养基倒板前温度低于50°C时再加入，防止失效。
(2)光皮桦组培苗的准备 A :种子消毒灭菌将收集的光皮桦种子放入50ml无菌离心管中，倒入70%酒精消毒1-2分钟；倒去酒精，加入40ml0. I %升汞溶液，浸泡5min ;倒去升汞溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。
B :小苗诱导与继代培养将灭好菌的种子放在无菌滤纸上吸干水分，置入MS培养基中；操作完毕后用封ロ膜(MicroporeTM Surgical Tape)封好培养皿，在25°C-28°C下光照培养2周；将发芽的小苗置入继代培养基1/2MS，每瓶3-4株，培养2-3个月(25°C -28°C下光照培养)。
(3)预培养 选取长势较好的组培苗的叶片为外植体。选取其前3片较幼嫩的叶片，用剪刀在叶片上剪2-3道伤ロ(深达叶脉)，较大的叶片可剪成O. 5cm大小，接入预培养培养基，每皿40-50片，暗培养7天。
(4)农杆菌培养 挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液IOOy I于5mlYEP(含50mg/LKan和50mg/LStr)培养基中，28°C，250rpm振荡培养20_36h至饱和，再按O. 2% -O. 3%的比例，转入含有抗生素的YEP培养基中， 相同条件下培养12-16h，当0D600的值为O. 8-1. O时即可用于转化。
(5)转化和共培养 A :取培养好的菌液IOOml分装于50ml离心管中，4000rpm,离心20_30min,去上清。用含300 μ mo I/LAS的IOOmlMS感菌液(PH5. 5)制成悬浮液，使菌液0D600终浓度为I. O ； B :将预培养过的光皮桦叶片放入农杆菌悬浮液中侵染20min ； C :取出叶片，置于无菌滤纸上浙干10-20min ； D :将叶片置于共培养培养基上，25°C暗培养5天。
(6)选择培养 A :将共培养好的叶片转入选ー培养基中，每皿10-12片或每瓶4-5片，25°C _28°C光照培养3-4周； B :将选ー培养基上长出的带芽原基和微芽的愈伤块，转入选ニ培养基，每瓶4-5块，光照培养4周； C :将选ニ上未达到生根要求的小苗和愈伤继续转入选三培养基，每瓶4-5块，光照培养4周。
(7)生根培养 将长至Icm以上的小苗，转入生根培养基中培养，每瓶接1-2株。
(8)驯化移栽 A、选取长势较好( 根部和茎叶分化的较好)的试管苗，打开盖子，炼苗1-3天； B、将幼苗取出，洗浄小苗根部附着的培养基，然后移栽于温室花盆中(基质由泥炭珍珠岩蛭石按I : I : I配制)，再用1000倍液多菌灵浇透，盖膜一周，每天浇水，保证湿度，促进生根。
全文摘要
本发明涉及一种利用农杆菌介导的光皮桦转基因方法，包括下列步骤(1)以光皮桦种子为外植体培养得到组培苗；(2)选取幼嫩的组培苗叶片接入预培养基中，黑暗培养；(3)用MS培养基重悬培养基重悬离心收集的农杆菌菌体制得农杆菌菌液；(4)将预培养的叶片，投入农杆菌菌液中侵染一段时间后取出外植体，转入共培养基培养；(5)共培养后的材料转入筛选培养基中诱导不定芽的再生；(6)生根培养；(7)炼苗移栽。本发明建立了农杆菌介导的光皮桦遗传转化体系，为通过转基因技术深入研究并发掘光皮桦的最佳使用价值奠定了基础。
文档编号C12N15/82GK102978235SQ20121034386
公开日2013年3月20日 申请日期2012年9月17日 优先权日2012年9月17日
发明者童再康, 李美飞, 黄华宏, 楼雄珍, 姜小凤 申请人:浙江农林大学