专利名称：一种从鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法
技术领域：
本发明属于胶原蛋白肽制备领域，具体涉及一种从鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法。
背景技术：
胶原蛋白广泛存在于动物体内，约占动物体内总蛋白的30%，对于组织和器官的机械性保护与细胞微环境的调节有极为重要的作用。胶原蛋白的类型比较复杂，已报道的就有27种左右，较为常见的有I型、II型、III型、IV型、V型，其中I型胶原蛋白最有应用价值。I型胶原蛋白在食品加工与包装、生物医学材料、制药、皮革、造纸、影像、生物合成和美容护肤品等领域中都有十分广泛的应用，特别是在美容护肤和生物医学材料方面的应用发展迅 速。鱼鳞占鱼体重量的1_5%，含丰富的蛋白质、卵鳞脂和多种矿物质；其中有机物占41% 55%，而蛋白质占总有机物的70%，主要为胶原蛋白和鱼鳞角蛋白，其中胶原蛋白以I型胶原蛋白为主，其在免疫原性、生物相容性、机械性能、生物可降解性、消化吸收性、保湿性、抗菌性、抗氧性、安全性等方面的性状优良；鱼鳞灰分含量约30%，主要成分是羟基磷灰石，绝大部分集中在骨质层。我国是世界上最大的淡水鱼生产国，据估计每年产生的鱼鳞约达5万吨，目前大部分只作为生活垃圾对待，生产鱼鳞胶原蛋白产品既能有效地解决环境污染问题，又能充分利用生物资源。同时，BSE、TSE、FMD等的爆发使传统上从牛皮、猪皮中提取的胶原蛋白的安全性受到威胁。因此从鱼鳞中提取胶原蛋白变得更有发展前景。提取鱼鳞胶原蛋白的主要方法有酸提取法、碱提取法、酶提取法、联合提取法等。酸碱提取法为传统方法，日本于1993年最早公开的专利就是酸法提取鱼鳞胶原蛋白(JP5155900)。但因其生产周期长，对环境造成污染，因此酶提取法受到重视。鱼鳞骨质层含有主要以羟基磷灰石形式存在的灰分，用酶法提取胶原蛋白肽时需首先破坏骨质层灰分，一般都用盐酸分解法。为减少盐酸对环境的污染，也有报道直接用蛋白酶提取，但存在提取效率低或所用蛋白酶不是常用的蛋白酶而难以工业化的问题。提取鱼鳞胶原蛋白肽一般都用碱处理鱼鳞的油脂和杂蛋白。用蛋白酶提取的鱼鳞胶原蛋白肽一般都有苦味，限制了其在诸如食品等方面的应用，而胶原蛋白肽的脱苦是比较困难的。对酶解产物进行浓缩，以提高胶原蛋白肽的纯度也是一个有待解决的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种从淡水鱼鳞制备胶原蛋白肽的新方法，其主要特点为用盐酸对鱼鳞进行一次性短时间的浸泡脱钙预处理；用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶混合一步提取鱼鳞胶原蛋白肽，不仅降低提取时间、提高胶原蛋白肽提取率，而且解决苦味等风味问题；用膜浓缩酶提取液以提高鱼鳞胶原蛋白肽产品的肽含量和纯度。本发明提供的从鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法，包括如下步骤I)取鱼鳞，用盐酸浸泡脱钙后，清洗至中性，干燥粉碎；
2)取步骤I)得到的脱钙干燥粉碎后的鱼鳞加入酶反应器中，再加入水和混合蛋白酶以酶解提取胶原蛋白肽，提取结束后，灭酶，离心，得酶解液，其中混合蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶 和风味蛋白酶的混合物；
3)步骤2)得到的酶解液进行膜浓缩，浓缩液冷冻干燥后得到鱼鳞胶原蛋白肽粉。作为优选技术方案，步骤I)中鱼鳞用浓度O. 3^1 mol · Γ1的盐酸浸泡脱钙，鱼鳞与盐酸的比为10:100^40:100 g/mL，脱钙时间5 20 h。更优选地，步骤I)中鱼鳞用浓度O. 5 mol · Γ1的盐酸浸泡脱钙，鱼鳞与盐酸的比为1:5 g/mL,脱I丐时间5h。作为优选技术方案，步骤2)中所述脱钙干燥粉碎后的鱼鳞与水的比例为1:100^4:100 g/mL;混合蛋白酶中中性蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的1 6%，木瓜蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的O. 5>/o,风味蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的O. 25 2% ;酶解时间9 20 h ;酶解温度35 50°C、pH 6. 5 7· 5。更优选地，步骤2)中所述脱钙干燥粉碎后的鱼鳞与水的比例为3:100 g/mL。更优选地，所述中性蛋白酶20万U/g，所述木瓜蛋白酶为98万U/g，所述风味蛋白酶为 20 U/mg。进一步优选地，所述中性蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的4%，所述木瓜蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的2%，所述风味蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的1%。作为优选技术方案，灭酶步骤为将酶解液加热到90°C以上。作为优选技术方案，步骤3)中上清液进行二级膜浓缩上清液在组合膜设备中进行浓缩，一级膜选用分子量2000Da的卷式膜，在常温、I. (Tl. 5Mpa下进行浓缩，二级膜选用分子量400Da的卷式膜，在常温、2. 5-3. OMpa下进行浓缩。优选地，所述鱼鳞为淡水鱼鳞。本发明的能够达到以下效果用盐酸一次性短时间处理(O. 5moL · T1HCL浸泡5h)鱼鳞脱钙，省略了鱼鳞的脱脂与脱杂蛋白工艺；用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶一次性酶法提取鱼鳞胶原蛋白肽，不仅降低酶解时间(酶解时间9 h)、提高胶原蛋白肽提取率(72. 72%)，而且解决胶原蛋白肽的苦味等风味问题；用两级膜分离浓缩胶原蛋白肽以提高胶原蛋白肽产品的肽含量和纯度，产品的肽含量> 96%、分子量为400-1000Da肽含量为73. 5%。
图I是鱼鳞的盐酸脱钙进程。图2是本发明的混合酶提取鱼鳞胶原蛋白肽进程。图3是中性蛋白酶提取鱼鳞胶原蛋白肽进程。图4是木瓜蛋白酶提取鱼鳞胶原蛋白肽进程。图5是风味蛋白酶提取鱼鳞胶原蛋白肽进程。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例一鱼鳞预处理
鱼鳞为收集自菜市场的以鲫鱼鱼鳞为主的淡水混合鱼鳞，用自来水清洗干净后用盐酸进行浸泡脱钙，脱钙后用自来水洗涤至中性，然后在60°C下干燥(2Γ48 h)后用粉碎机粉碎。通过检测浸泡液钙浓度分析盐酸脱钙的适宜料液比、盐酸浓度和脱钙时间(浸泡液中钙浓度趋于稳定的时间)，钙浓度采用EDTA滴定法测定。不同实验条件下实验结果如下表I :
表I不同实验条件下鱼鳞脱钙实验结果
权利要求
1.ー种从鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法，其特征在于，包括如下步骤 I)取鱼鳞，用盐酸浸泡脱钙后，清洗至中性，干燥粉碎； 2)取步骤I)得到的脱钙干燥粉碎后的鱼鳞加入酶反应器中，再加入水和混合蛋白酶以酶解提取胶原蛋白肽，提取结束后，灭酶，离心，得酶解液，其中混合蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的混合物； 3)步骤2)得到的酶解液进行膜浓缩，浓缩液冷冻干燥后得到鱼鳞胶原蛋白肽粉。
2.根据权利要求I所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法，其特征在于，步骤I)中鱼鳞用浓度O. 3 I mo I ·じ1的盐酸浸泡脱钙，鱼鳞与盐酸的比为10:100^40:100 g/mL,脱钙时间5^20 ho
3.根据权利要求2所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法，其特征在于，步骤I)中鱼鳞用浓度O. 5 mo I ·じ1的盐酸浸泡脱钙，鱼鳞与盐酸的比为1:5 g/mL，脱钙时间5h。
4.根据权利要求I所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法，其特征在于，步骤2)中所述脱钙干燥粉碎后的鱼鳞与水的比例为1:10(T4:100 g/mL;混合蛋白酶中中性蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的1飞％，木瓜蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的O. 5>/o,风味蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的O. 25 2% ;酶解时间扩20 h ;酶解温度35 50°C、pH 6. 5 7· 5。
5.根据权利要求4所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法，其特征在于，步骤2)中所述脱钙干燥粉碎后的鱼鳞与水的比例为3:100 g/mL。
6.根据权利要求4所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述中性蛋白酶20万U/g，所述木瓜蛋白酶为98万U/g，所述风味蛋白酶为20 U/mg。
7.根据权利要求5所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述中性蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的4%，所述木瓜蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的2%，所述风味蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的1%。
8.根据权利要求I所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法，其特征在于，灭酶步骤为将酶解液加热到90°C以上。
9.根据权利要求I所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法，其特征在于，步骤3)中上清液进行ニ级膜浓缩上清液在组合膜设备中进行浓缩，一级膜选用分子量2000Da的卷式膜，在常温、I. (Tl. 5Mpa下进行浓缩，ニ级膜选用分子量400Da的卷式膜，在常温、2. 5-3. OMpa下进行浓縮。
10.根据权利要求I所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述鱼鳞为淡水鱼鳞。
全文摘要
本发明公开了一种从鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法，其特征在于，包括如下步骤1)取鱼鳞，用盐酸浸泡脱钙后，清洗至中性，干燥粉碎；2)取步骤1)得到的脱钙干燥粉碎后的鱼鳞加入酶反应器中，再加入水和混合蛋白酶以提取胶原蛋白肽，提取结束后，灭酶，离心，得酶解液，其中混合蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的混合物；3)步骤2)得到的酶解液进行膜浓缩，浓缩液冷冻干燥后得到鱼鳞胶原蛋白肽粉。本发明用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶一次性酶法提取鱼鳞胶原蛋白肽，不仅降低酶解时间(酶解时间9h)、提高胶原蛋白肽提取率(72.72%)，而且解决胶原蛋白肽的苦味等风味问题。
文档编号C12P21/06GK102839207SQ20121034340
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月17日 优先权日2012年9月17日
发明者周茂洪, 赵肖为 申请人:温州大学