专利名称：解淀粉芽孢杆菌Ba168及其发酵培养方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于利用有益微生物对植物病害进行生物防治的领域，具体涉及解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylolquefaciens)Bal68菌株，以及该菌株的发酵生产及其发酵产物对防治植物病原菌的作用。
背景技术：
植物病害的流行不但引起作物减产，给人类造成重大经济损失，甚至带来灾难性后果。植物病害的危害还会导致农产品品质低劣，不堪使用或加工，甚至导致人畜中毒。为防治植物病害，化学农药因为具有成本低、见效快、省时省力等优点曾一度成为人们的首选，但是，化学农药一般不可降解，随着化学农药的大量使用，引发了环境污染、生态破坏、食品污染等事件。这使研究开发利用生物农药成为植物保护工作者的重要研究课题。生物农药是指利用生物活体或其代谢产物针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂，具有安 全、高效、无污染等特点，与保护生态环境和社会协调发展的要求相吻合，是未来农药发展的必然趋势。微生物农药是生物农药中应用最为广泛的一类，也是生物防治的重要材料。微生物源农药的主要成分是微生物活体及其次生代谢产物，由于微生物种类多样，其活性也很广泛，包括杀虫、杀菌、除草以及植物生长调节作用等。自然界中用于生防细菌的，主要有芽孢杆菌属、假单胞菌属。特别是近几年，利用微生物防治植物真菌性病害由于对环境安全，可以减缓病原菌产生抗药性，已经成为当前防治植物病害的主流方法。解淀粉芽孢杆菌是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，其生理特征多样，该菌在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。解淀粉芽孢杆菌不仅可以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在，而且是植物体内常见内生细菌，尤其是在植物的根、茎内部。解淀粉芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，改变其周围菌群环境和种类，与病原菌竞争植物周围的位点，并且分泌多种抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到改良土壤和生防的目的。尖孢镰刀菌是一类既可侵染植物又可在土壤中生存的兼性寄生真菌，用化学农药难于防治，属于顽固性病害。该类病菌和其他植物病原菌一样，存在着种下分化，可侵染许多寄主植物，具有多种专化型。其中，侵染中草药的块根、块茎的一部分专化型为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum Shl,该菌可引起常见中草药的根腐病等病害,而块根、块莖和鳞莖等恰好是许多名贵中药材的药用部位，经济价值高，而尖孢镰刀菌的侵染使中药材的药用价值下降，另外，病原菌可以在病残体和土壤中过冬，一旦发病，笠年仍会引起作物病害，持续影响作物产量，给我国中药材产业造成巨大的损失。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种解淀粉芽孢杆菌Bal68 CGMCC No. 6462。
本发明的第二个目的在于公开了解淀粉芽孢杆菌Bal68的发酵方法，以及由该方法制备所得的发酵液。本发明的第三个目的在于公开了解淀粉芽孢杆菌Bal68杀菌剂及其制备方法。本发明的第四个目的在于公开了上述解淀粉芽孢杆菌Bal68、由解淀粉芽孢杆菌Bal68制备所得的发酵液以及解淀粉芽孢杆菌Bal68杀菌剂在制备防治由尖孢镰刀菌属引起的作物根腐病药物中的应用。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种解淀粉芽孢杆菌Bal68，CGMCC No. 6462，该解淀粉芽孢杆菌Bal68的16SrDNA如序列表I所示。解淀粉芽孢杆菌Bal68的发酵方法，其中，所述发酵方法是以权利要求I所述的解淀粉芽孢杆菌Bal68为原料,包括下述步骤 (I)、菌种活化将解淀粉芽孢杆菌Bal68菌种接种到LB试管斜面上面，于30°C活化培养48h，所述LB培养基配方为酵母浸膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15 20g，水1000ml, pH 7. 4 7. 6，连续转接3代，确保菌株纯度后，再接种到种子液中使用。(2)、种子液的制备从斜面上挑取菌接种到装有LB培养基的三角瓶中，于恒温振荡培养箱中振荡培养，即得到种子液，所述的LB培养基配方为蛋白胨10g，NaCl 10g，水1L，酵母浸膏5g, pH7. O ；(3)、发酵培养将种子液先后进行种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养，得到发酵液；其中种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养步骤如下种子罐发酵培养FJ液体培养基，装料系数O. 7，培养条件26 28°C，48h，接种量9%，通气量2. 5L/min，搅拌转速200r/min ；大规模工业发酵培养FJ液体培养基(2(Γ36Τ)，装料系数O. 7，培养条件26 28°C，60 70h，接种量9%，通气量2. OL/min，搅拌转速150r/min ；所述的FJ液体培养基配方为黄豆饼粉2%，葡萄糖1%，淀粉I. 5%，CaCO3O. 25%，K2HPO4O. 05%, MgSO4 · 7H20 O. 25%，FeSO4 · 7H20 O. 25%，其余为水，所列百分比为质量分数。由上述技术方案所述的解淀粉芽孢杆菌Bal68发酵方法制备所得的发酵液。解淀粉芽孢杆菌Bal68杀菌剂的制备方法，其中，所述制备方法是以由上述技术方案所述的解淀粉芽孢杆菌Bal68发酵液为原料，包括下述步骤(I)、过滤浓缩发酵液用草酸调节pH至4. 5^5. O后，将发酵液通过截留分子量4000(Tl00000k的无机陶瓷超滤膜过滤分离，操作温度为25 45°C，膜通量为5(T60LMH，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为6-7倍；(2)、喷雾干燥向浓缩后的发酵液中添加发酵液质量I. 0%的白炭黑、微细滑石粉、轻质碳酸钙或2500目超细重钙填料；再将芽孢溶液经喷雾制成粉末，即得到解淀粉芽孢杆菌Bal68杀菌剂，其中喷雾干燥的进口温度为17(Tl90°C，出口温度为65 85°C，进料速度 60mL/min，喷头压力 O. IOMPa0解淀粉芽孢杆菌Bal68发酵液，其中，所述解淀粉芽孢杆菌Bal68发酵液由上述技术方案所述的解淀粉芽孢杆菌Bal68发酵所得。解淀粉芽孢杆菌Bal68杀菌剂，其中，所述解淀粉芽孢杆菌Bal68是以由上述技术方案所述的解淀粉芽孢杆菌Bal68发酵液为原料，通过下述方法制备所得
(I)、过滤浓缩发酵液用草酸调节pH至4. 5^5. O后，将发酵液通过截留分子量4000(Tl00000k的无机陶瓷超滤膜过滤分离，操作温度为25 45°C，膜通量为5(T60LMH，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为6-7倍；(2)、喷雾干燥向浓缩后的发酵液中添加发酵液质量I. 0%的白炭黑、微细滑石粉、轻质碳酸钙或2500目超细重钙填料；再将芽孢溶液经喷雾制成粉末，即得到解淀粉芽孢杆菌Bal68杀菌剂，其中喷雾干燥的进口温度为17(Tl90°C，出口温度为65 85°C，进料速度 60mL/min，喷头压力 O. IOMPa0上述技术方案所述一种解淀粉芽孢杆菌Bal68、上述技术方案所述的发酵液以及上述技术方案所述的解淀粉芽孢杆菌Bal68杀菌剂在制备防治由尖孢镰刀菌属引起的作物根腐病药物中的应用。根据上述技术方案所述的应用，其中，所述由尖孢镰刀菌属引起的作物根腐病为白术根腐病、西洋参根腐病和三七根腐病。 本发明具有以下有益效果I、本发明的解淀粉芽孢杆菌Bal68 CGMCC No. 6462，环境相容性好，具有很高的生物活性，特别是对由镰刀菌属真菌引起的根腐病具有较好的防效，通过实验证明，该解淀粉芽孢杆菌菌株制剂对西洋参根腐病、白术根腐病菌和三七根腐病菌等都具有很好的防治作用。 2、本发明为防治由镰刀菌属真菌弓I起的根腐病提供了一种新的微生物农药。菌株保藏信息本发明解淀粉芽孢杆菌Bal68，分类命名Bacillusamyloliquefaciens,已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCCNo. 6462，保藏日期为2012年8月21日。
图I为解淀粉芽孢杆菌Bal68 CGMCC No. 6462的16SrRNA同源序列比对分析树状图。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对镰刀菌属真菌引起的根腐病防治中的应用作进一步的说明。实施例I :解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Bal68的分离与纯化(I)、土样采集从秦岭深山原始森林土壤中选取多个地点，每个地点取3到15cm处土壤,混合过粗筛，取25g做分离用；(2)、培养基平板制备将NA培养基和LB培养基加热融化倒入培养皿内冷却，制成NA培养基和LB培养基平板。所述的NA培养基配方为葡萄糖10g，琼脂15g，牛肉浸膏3g，酵母膏lg，蛋白胨5g，水1L，pH 6. 8 7. O ；LB液体培养基配方为蛋白胨10g, NaCl 10g，水1L，酵母浸膏5g，pH 7. O ；
(3)、细菌的分离 平板接种分别采用涂抹法和混菌法接种。涂抹法分别取上述5个浓度土壤稀释液O. 05ml，分别加入已做好的NA、LB平板上，用灭菌的玻璃刮刀将稀释液均匀的涂布开。放入32°C恒温箱中培养，设三个重复。混菌法分别取上述5个浓度土壤稀释液1ml，加入培养皿中，将已熔化的45飞(TC的NA、LB培养基倒入，轻轻摇转使样品和培养基混合均匀，待培养基凝固后放入培养箱32°C恒温培养，设三个重复；(4)、菌种的纯化随时观察并记录菌株的原始培养结果，统一编号。根据细菌的特征及时挑取单个细菌落至LB平板上，采用划线分离的方法纯化。·
实施例2 :解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Bal68 的鉴定对实施例I所得的解淀粉芽孢杆菌Bal68 CGMCC No. 6462的鉴定过程为(I)、形态特征在LB培养基上菌落呈圆形，表面有明显光泽，不光滑；边缘不规贝U，有扩散，表面褶皱；菌落呈乳白色，不透明，浑浊；具有一定的粘附性；所述的LB培养基配方为蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，琼脂18g，水1000ml, pH为7. O。培养前期(5 12h)菌落呈无色透明液滴，有光泽；后期(24h后)呈白色不透明状，较为暗淡。菌体杆状，长约2 μ m，单生，周生鞭毛，产芽孢。革兰氏染色呈阳性。(2)、生理生化实验通过对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Bal68的生理生化特性试验(如表I所示)并结合该菌株的形态特征，对照《伯杰氏细菌手册》(Buchanan & Gibbons，1984)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英，2001)进行检索，鉴定Bal68菌株为芽孢杆菌属。表I解淀粉芽孢杆菌BA168菌株的生理生化特征
_测试项目_iSM_测试项目_结果
革兰氏染色Gt脂_+
细胞ft径>1μ m-BJJ胶液化+
细胞形状杆状硫化氢 +_形成芽泡_+_MW_+
权利要求
1.一种解淀粉芽孢杆菌Bal68，CGMCC No. 6462，该解淀粉芽孢杆菌Bal68的16SrDNA如序列表I所示。
2.解淀粉芽孢杆菌Bal68的发酵方法，其特征在于所述发酵方法是以权利要求I所述的解淀粉芽孢杆菌Bal68为原料,包括下述步骤 (1)、菌种活化将解淀粉芽孢杆菌Bal68菌种接种到LB试管斜面上面，于30°C活化培养48h，所述LB培养基配方为酵母浸膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15 20g，水IOOOml，pH 7. 4 7. 6，连续转接3代，确保菌株纯度后，再接种到种子液中使用。
(2)、种子液的制备从斜面上挑取菌接种到装有LB培养基的三角瓶中，于恒温振荡培养箱中振荡培养，即得到种子液，所述的LB培养基配方为蛋白胨10g，NaCl 10g，水1L，酵母浸膏5g，ρΗ7· O ； (3)、发酵培养将种子液先后进行种子罐发酵培养和大規模エ业发酵培养，得到发酵液；其中种子罐发酵培养和大规模エ业发酵培养步骤如下 种子罐发酵培养FJ液体培养基，装料系数O. 7，培养条件26 28°C，48h，接种量9%，通气量2. 5L/min，搅拌转速200r/min ； 大規模エ业发酵培养FJ液体培养基(2(Γ36Τ)，装料系数O. 7，培养条件26 28°C，60 70h，接种量9%，通气量2. OL/min，搅拌转速150r/min ； 所述的FJ液体培养基配方为黄豆饼粉2%，葡萄糖1%，淀粉I. 5%，CaCO3O. 25%，K2HPO4.O.05%，MgSO4 · 7H20 O. 25%，FeSO4 · 7H20 O. 25%，其余为水，所列百分比为质量分数。
3.由权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌Bal68发酵方法制备所得的发酵液。
4.解淀粉芽孢杆菌Bal68杀菌剂的制备方法，其特征在于所述制备方法是以由权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌Bal68发酵液为原料，包括下述步骤 (1)、过滤浓缩发酵液用草酸调节PH至4.5、. O后，将发酵液通过截留分子量40000 100000k的无机陶瓷超滤膜过滤分离，操作温度为25 45°C，膜通量为5(T60LMH，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为6-7倍； (2)、喷雾干燥向浓缩后的发酵液中添加发酵液质量I.0%的白炭黑、微细滑石粉、轻质碳酸钙或2500目超细重钙填料；再将芽孢溶液经喷雾制成粉末，即得到解淀粉芽孢杆菌Bal68杀菌剂，其中喷雾干燥的进ロ温度为17(Tl90°C，出口温度为65 85°C，进料速度60mL/min，喷头压力 O. IOMPa0
5.解淀粉芽孢杆菌Bal68杀菌剂，其特征在于所述解淀粉芽孢杆菌Bal68杀菌剂由权利要求I所述的解淀粉芽孢杆菌Bal68发酵制备所得。
6.解淀粉芽孢杆菌Bal68杀菌剂，其特征在于所述解淀粉芽孢杆菌Bal68是以由权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌Bal68发酵液为原料，通过下述方法制备所得 (1)、过滤浓缩发酵液用草酸调节PH至4.5、. O后，将发酵液通过截留分子量4000(Tl00000k的无机陶瓷超滤膜过滤分离，操作温度为25 45 °C，膜通量为5(T60LMH，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为6-7倍； (2)、喷雾干燥向浓缩后的发酵液中添加发酵液质量I.0%的白炭黑、微细滑石粉、轻质碳酸钙或2500目超细重钙填料；再将芽孢溶液经喷雾制成粉末，即得到解淀粉芽孢杆菌Bal68杀菌剂，其中喷雾干燥的进ロ温度为17(Tl90°C，出口温度为65 85°C，进料速度60mL/min，喷头压力 O. IOMPa0
7.权利要求I所述ー种解淀粉芽孢杆菌Bal68、权利要求3所述的发酵液以及权利要求6所述的解淀粉芽孢杆菌Bal68杀菌剂在制备防治由尖孢铼刀菌属引起的作物根腐病药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述由尖孢铼刀菌属引起的作物根腐病为白术根腐病、西洋參根腐病和三七根腐病。
全文摘要
本发明公开了解淀粉芽孢杆菌Ba168及其制备方法和应用，其目的是提供一种植物病原菌的生物防治方法。该菌株已于2012年8月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.6462。该菌株从秦岭原始森林土壤中分离获得，经过菌种活化、摇瓶发酵、种子液发酵和大发酵罐发酵得到发酵液，发酵液经过过滤浓缩、超滤膜分离、喷雾干燥和包装后制成杀菌剂。本发明具有对由尖孢镰刀菌引起的白术根腐病、西洋参根腐病和三七根腐病等根腐病害有很好的防治作用的优点。
文档编号C12N1/20GK102839142SQ201210342838
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日
发明者杨轩, 翟枫, 杨长锁, 安德荣 申请人:杨凌绿都生物科技有限公司