专利名称：一种快速高效删除质粒上基因片段的方法
技术领域：
一步PCR法快速高效删除质粒上基因片段的方法，本发明涉及一步PCR法快速高效删除质粒上任意位置基因片段的方法，属于微生物基因工程领域。
背景技术：
PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成①模板DNA的变性模板DNA经加热至94°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55°C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列 为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链， 重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”。通过巧妙设计删除引物，使得在质粒中任意位置删除基因片段的技术变得简单有效。设计一对删除引物(正、反向)，用删除引物和模板质粒退火后用高保真DNA聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。之后用DpnI酶切延伸产物，由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的,对DpnI敏感而被切碎(DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次)，而体外合成的已删除目标基因片段的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到基因片段已删除的质粒克隆。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速高效删除质粒上基因片段的方法。本发明的具体步骤如下I)确定删除序列；2)把与删除基因两端相连接的一定长度的序列片拼接在一起，据此设计成一对删除引物；3) PCR扩增步骤与普通PCR —致，但是延伸温度的时间设定与该重组质粒的长度有关，一般含7000bp碱基数的重组质粒延伸时间约为5-8min ；4) PCR扩增步骤与普通PCR —致，但是PCR扩增循环数一般约为15_20次；5) PCR扩增完成后经DpnI酶消化3h后直接转化感受态细胞。6)选择阳性克隆测序本发明所述删除基因片段长度没有限制，只要能进行正常PCR扩增就行。PCR扩增步骤与普通PCR —致，只是延伸温度的时间设定要根据重组质粒的长度而定，PCR扩增循环数也要尽量少一些，一般15-20次为宜，尽量减少引入因PCR扩增循环数过多而引起的其它突变。本发明的详细的步骤为I)确定删除序列；2)把与删除基因片段两端相连接的序列拼接在一起，设计成引物；删除引物设计的时候要注意，删除引物5’端离被删除区域的碱基数比3’端离被删除区域的碱基数要多一些，一般5’端离被删除区域的碱基数为25-30bp，而3’端离被删除区域的碱基数为20-25bp ；3)设定PCR扩增程序； PCR反应条件
预变性94°C4 min
变性94°CI min
退火59°CI min
延伸72°C5-8 min
最后延伸72°C8inin“变性-退火-延伸”这个过程进行18-20个循环。4) PCR扩增完成后经DpnI酶消化3h后直接转化感受态细胞；PCR扩增完成后，跑DNA凝胶电泳检验一下有一定亮度的条带就可以了。然后再用DpnI酶消化3h，之后可直接转化克隆宿主菌或表达宿主菌。5)选择阳性克隆测序。本发明的有益效果本发明提供了一种快速高效删除质粒上任意位置基因片段的方法。
图I. 一步PCR法快速高效删除质粒上任意位置基因片段的原理
具体实施例方式材料和检测方法来源于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida NRRL-18668腈水合酶基因β亚基全序列；重组质粒模板pET-24a_B。实施例I :I)从NCBI上下载GenBank号为U89363. I的序列并且识别SEQ ID NO. I ；2)引物设计把与删除基因片段两端相连接的序列拼接在一起，设计成引物；删除引物设计的时候要注意，删除引物5’端离被删除区域的碱基数比3’端离被删除区域的碱基数要多一些，一般5’端离被删除区域的碱基数为25-30bp，而3’端离被删除区域的碱基数为20-25bp ；上游引物Pl如SEQ ID NO. 2所示；下游引物P2如SEQ ID NO. 3所示。删除序列位于编码腈水合酶β亚基的B基因如SEQ ID NO. I中415位与441位碱基之间。3)设定PCR扩增程序；PCR反应条件
预变性94°C4 min
变性94°CI min
退火59°CI min
延伸72°C8 min
最后延伸72°C8 min“变性-退火-延伸”这个过程进行20个循环。4) PCR扩增完成后经DpnI酶消化3h后直接转化感受态细胞；PCR扩增完成后，跑DNA凝胶电泳检验一下有弱的条带就可以了。然后再用DpnI酶消化3h，之后直接转化E. coli BL21 (DE3)表达宿主菌。5)选择阳性克隆测序。选择阳性克隆送生工生物工程上海股份有限公司测序，结果显示成功删除了目标片段。
权利要求
1.一种一步PCR法删除质粒上基因片段的方法，是采用两个特异性引物片段，通过一步PCR实现删除质粒上任意位置基因片段的方法。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于两个特异性引物的设计，将与删除片段两端相连接的一定长度的序列拼接在一起，据此设计成为特异性引物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，两个引物扩增方向相向。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，一步PCR法扩增得到目的片段已经被删除的质粒，不需要重叠PCR、酶切、连接等传统的构建方法。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR方法与普通PCR方法一致，但PCR延伸时间为延伸整个重组质粒长度的时间，一般含7000bp碱基数的重组质粒延伸时间约为5-8min。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR方法与普通PCR方法一致，但PCR扩增循环数一般约为15-20次。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，PCR扩增完成后经DpnI酶消化3h后直接转化感受态细胞。
全文摘要
本发明公开了一种快速高效删除质粒上基因片度的方法，是采用设计两个特异性引物片段，通过一步PCR获得目标片段已删除的重组质粒的方法，属于基因克隆技术领域。本发明方法操作简单，具有非常高的效率和成功率。
文档编号C12N15/09GK102899311SQ20121034524
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者周哲敏, 杜坤, 崔文璟, 周丽, 葛春蕾 申请人:江南大学