专利名称：一种指甲隐球菌及其分离培养方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种指甲隐球菌及其分离培养方法与应用。
背景技术：
随着实验室诊断技术的不断改进，对隐球菌的分类越来越系统化，一般分为新生隐球菌、浅白隐球菌、指甲隐球菌、罗伦氏隐球菌、黄色隐球菌等。指甲隐球菌是一种带有荚膜的担子菌酵母，既往认为该菌仅引起人类甲真菌病。[Manzano-Gayosso P,Hernandez-Hernandez Fj Mendez-Tovar LJj et al. Onychomycosis incidence in type 2diabetes mellitus patients. Mycopathologia. 2008 Jul;166 (I):41-5.]现有文献也显示指甲隐球菌也能引起脑膜炎或其他真菌感染(参见文献张旭辉，指甲隐球菌脑膜炎I例，《川北医学院学报》，1993年04期，81页；邝俊健等，对I例左·胫腓骨骨折术后指甲隐球菌感染患者的药学监护，《中国药物应用与监测》2011年第I期，32-34页)。但这些研究并未对指甲隐球菌的鉴定方法和药物敏感性进行描述。目前，尚无从脑膜炎患者肺部活检组织和脑脊液中分离培养纯化的指甲隐球菌。
发明内容
本发明的目的在于分离培养纯化一株新的可致人类脑膜炎的指甲隐球菌(Cryptococcus uniguttulatum)菌株,并提供其分离培养纯化方法，以及该菌株在筛选抗真菌药物中的应用。上海长征医院皮肤科在一名37岁男性脑膜炎患者肺部活检组织和脑脊液中分离出一株隐球菌，经ITS测序和核糖体基因D1/D2区测序证实为指甲隐球菌。本发明提供了一株指甲隐球菌(Cryptococcus uniguttulatus),已于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(061 0，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 6017。本发明分离纯化的该株指甲隐球菌，属担子菌门(Basidiomycota),银耳目(Tremellales),线黑粉菌属(Filobasidiella)。本发明还提供了所述的指甲隐球菌的分离培养纯化方法，该方法包括分离纯化步骤，具体是将隐球菌脑膜炎患者肺部活检组织或脑脊液在30°C条件下接种于沙氏琼脂培养基平板和酵母浸出膏蛋白胨(YEPD)琼脂培养基，第2天生长，得到指甲隐球菌菌落。进一步地，该方法包括指甲隐球菌菌种在30°C条件下于沙氏液体培养基和酵母浸出膏蛋白胨(YEPD )液体培养基进行振荡培养用于增菌。所述的指甲隐球菌的分离培养纯化方法，该方法还包括培养和保存步骤，具体是从-70 V冰箱中取出冻存管，立即放置于37°C水浴中并适当摇动30s，打开冻存管，取50 μ I菌液接入沙氏斜面培养基上；保存时将菌液涂布平板，48小时后放入4°C冰箱短期保存或放入含有25%甘油的YEH)液体培养基中_70°C冻存；所述的沙氏斜面固体培养基的组分和重量百分比如下葡萄糖4%、蛋白胨1%、琼脂I. 5%，每1000ml，加200mg氯霉素，121。。10分钟灭菌后备用；所述的YEro液体培养基的组分和重量百分比如下1%酵母浸出膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。本发明对该菌株的形态特征、培养特征、碳源利用作了进一步研究。本发明对该菌株进行鉴定采用指甲隐球菌ITS1、5. 8S rDNA和ITS2区扩增测序方法，具体为合成以下真菌通用引物上游引物ITS5 :5’ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ (如 SEQ ID NO: I 所示);和下游引物ITS4 :5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (如 SEQ ID N0:2 所示)；以基因组扩增，PCR反应体系 50 μ L 10XPCR buffer 5μ L,2. 5mmol/LdNTP 混合 物 8 μ L，IOumoI/L 弓丨物各 Iul，模板 2ul，Taq 酶 O. 5ul，无菌水 32. 5 μ L ;PCR扩增条件94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，55°C退火30秒，70°C延伸2分钟，30个循环；72°C保存10分钟。所得扩增产物由ABI 3730DNA自动测序仪双向测序两次。序列如SEQ ID NO: I所
/Jn ο将测序结果于NCBI网站进行序列比对(http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast, cgi)，比对结果与指甲隐球菌菌株(ATCC 66033)同源性100%。合成Dl/D2引物上游引物5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’ (如 SEQ ID NO:4 所示);下游引物5’-GGTCCGTCTTTCAAGACGG-3’ (如 SEQ ID NO:5 所示)；以基因组扩增，PCR反应体系 50 μ L 10XPCR buffer 5 μ L，2. 5mmol/LdNTP 混合物 8 μ L，IOumoI/L 弓丨物各 Iul，模板 2ul，Taq 酶 O. 5ul，无菌水 32. 5 μ L ;PCR扩增条件94°C预变性5分钟，94°C变性I分钟，55°C退火30秒，70°C延伸2分钟，30个循环；72°C保存10分钟。所得扩增产物由ABI 3730DNA自动测序仪双向测序两次，序列如SEQID N0:6所
/Jn ο将测序结果于NCBI网站进行序列比对(http: //blast, ncbi. nlm. nih. rov/Blast, cgi)比对结果与指甲隐球菌(TJYlla)同源性99%。本发明还提供了该菌株在筛选抗真菌药物中的应用。所述的抗真菌药物具体为抗人类脑膜炎药物。参照M27-A3 方法(Clinical Laboratory and Standards Institute. ReferenceMethod for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing ofYeasts.Approved standard M27-A3. Wayne, PA:National Committee for Clinical LaboratoryStandards, 2008.),对该指甲隐球菌对两性霉素b、氟胞B密唳、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑和isavuconazole的药物敏感性进行测定。其MIC值分别为O. 125、>64、64、1、0. 5,0. 5和0. 5mg/L。药敏结果显示该菌对氟胞嘧啶和氟康唑耐药。抗该菌株的药物具体为两性霉素b、伏立康唑(voriconazole)、泊沙康唑(posaconazole)和isavuconazole。该菌株将进一步用于筛选新的抗真菌药物。
图I是脑脊液墨汁染色普通显微镜图。微生物保藏信息指甲隐球菌(PWH2010，)，分类命名指甲隐球酵母Cryptococcus uniguttulatus,已于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(061 0，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 6017。
具体实施例方式现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。实施例I :本发明分离得到一株指甲隐球菌(Cryptococcus uniguttulatus)菌株CGMCCNo. 6017。 一、指甲隐球菌(Cryptococcus uniguttulatus)菌株 CGMCC No. 6017本发明的菌株(PWH2011)由上海长征医院皮肤科于隐球菌脑膜炎患者肺组织和脑脊液中分离和检测鉴定。于2012年4月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏登记号为CGMCCN0. 6017。属担子菌门(Basidiomycota)，银耳目(Tremellales),线黑粉菌属(Filobasidiella)。I.形态特征脑脊液墨汁染色可见圆形酵母样细胞，外有厚壁荚膜包绕，如图I所示。2.培养特征该菌可在麦芽浸出培养基(MEA ;0xoid, Basingstoke, UK)、刀豆氨酸甘氨酸溴磨香草酚蓝琼脂培养基(CGB)培养基和L-多巴培养基上生长。该菌可在20°C、25°C和30°C下生长，但是在37°C和40°C未观察到生长。在L-多巴培养基上培养2周菌落不变黑且无法使CGB培养基变色。CGB培养基制备甲液(甘氨酸10g，KH2PO4Ig, MgSO4Ig, thiamine HCllmg, L-canavanin sulphate 30mg, H2O 100ml,溶解各成分，pH 5. 6，0. 22 μ m 滤膜除菌)和乙液(溴百里酚蓝 0. 4g，0. Olmol/LNaOH 64ml, H2O 36ml)。H2O 880ml，乙液 20ml，琼脂 20g，121°C高压灭菌15min，冷却到48°C后加甲液100ml，充分混合，制成平板或斜面。3.碳源利用试验方法参见工具书廖万清等主编《真菌病学》，人民卫生出版社，1989年。试验结果是可同化葡萄糖、蔗糖、D-葡萄糖醛酸酯。尿素试验阳性。无法同化乳糖、蜜二糖、乙胺。二、菌株的分离培养及保存技术本发明设计的格特隐球菌的菌种分离纯化技术包括隐球菌脑膜炎患者脑脊液接种于沙氏琼脂培养基平板(30°C)和YEH)琼脂培养基，第2天生长，得到指甲隐球菌菌落。菌种在30°C条件下于沙氏液体培养基和YEH)液体培养基30°C条件下进行振荡培养用于增菌。所述指甲隐球菌的斜面培养和保存技术包括从-70°C冰箱中取出保存管，立即放置于37°C水浴中并适当摇动30s，打开冻存管，取I接种环菌液接入新鲜沙氏斜面培养基上。沙氏培养基配方葡萄糖4%、蛋白胨1%、琼脂I. 5%，每1000ml加200mg氯霉素，121°C 10分钟灭菌后备用。保存时将菌液涂布平板，48小时后放入4°C冰箱短期保存或放入含有25%甘油的YEro液体培养基中-70°c冻存。YEro液体培养基配方ι%酵母浸出膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。三、真菌鉴定技术采用指甲隐球菌ITS1、5.8S rDNA和ITS2区扩增测序方法，具体为合成以下真菌通用引物上游引物ITS5 :5’ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ (如 SEQ ID NO: I 所示);和下游引物ITS4 :5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (如 SEQ ID NO:2 所示)；以基因组扩增，PCR反应体系 50 μ L 10XPCR buffer 5 μ L，2. 5mmol/LdNTP 混合物 8 μ L，IOumoI/L 弓丨物各 Iul，模板 2ul，Taq 酶 O. 5ul，无菌水 32. 5 μ L ;
PCR扩增条件94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，55°C退火30秒，70°C延伸2分钟，30个循环；72°C保存10分钟。所得扩增产物由ABI 3730DNA自动测序仪双向测序两次，序列为tccgtaggtgaacctgcgga aggatcatta ttgaatttag ttgtctggct ttcgccgacgacgatatcattatccataacacctgtgcac tgttggatgt ttaatacatc cgttttacactaaacaatat tgttacaaatgtagtcttattataacataa taaaactttc aacaacggatctcttggctc tcgcatcgatgaagaacgcagc (如SEQ ID N0:3所示) 将测序结果于NCBI网站进行序列比对(http://blast, ncbi. nl m. nih. gov/Blast. cgi),比对结果与指甲隐球菌菌株(ATCC66033)同源性
100%o合成Dl/D2引物上游引物5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’ (如 SEQ ID NO:4 所示);下游引物5’-GGTCCGTCTTTCAAGACGG-3’ (如 SEQ ID NO:5 所示)；以基因组扩增，PCR反应体系 50 μ L 10XPCR buffer 5 μ L，2. 5mmol/LdNTP 混合物 8 μ L，IOumoI/L 弓丨物各 Iul，模板 2ul，Taq 酶 O. 5ul，无菌水 32. 5 μ L ;PCR扩增条件94°C预变性5分钟，94°C变性I分钟，55°C退火30秒，70°C延伸2分钟，30个循环；72°C保存10分钟。所得扩增产物由ABI 3730DNA自动测序仪双向测序两次，序列为 taagcggagg aaaagaaact aacaaggatt cccctagtaa cggcgagcgaagcgggaagagctcaaatttgaaatctggt ggcctcaggt catccgagtt gtaatctata gaagtgttttccgtgctggc ccatgtacaagtcccttgga acagggcgtc atagagggtg agaatcccgtccttgacatggactaccagt gctctgtgatacactttcaa cgagtcgagt tgtttgggaatgcagctcaa aatgggtggtaaattccatc taaagctaaatattggcgag agaccgatagcgaacaagta ccgtgaggga aagatgaaaagcactttgga aagagagttaaacagtatgtgaaattgttg aaagggaaac gattgaagtc agtcgtgctcaatggactcagccgttctgcggtgtatttc cattgggtgg ggtcaacatc agttttgatcgctggataaaggcaggaggaatgtagcacc cccgggtgaa cttatagcct cttgtcacatacagtggttgggactgaggaacgcagcatg cctttatggc cgggattcgt ccacgtacatgcttaggatgttgacataatggctttaaac gacccgtctt gaaacacg(如 SEQ ID NO:6 所不)。将测
NCBI 网立占进对亍序列比对(http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cri) t匕又寸@果与指甲隐球菌(TJYlla)同源性100%。实施例2 :真菌药敏实验
参照M27-A3 方法(Clinical Laboratory and Standards Institute. ReferenceMethod for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts.Approved standard M27-A3. Wayne, PA:National Committee for Clinical LaboratoryStandards, 2008.),对该指甲隐球菌对两性霉素b、氟胞B密唳、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑和isavuconazole的药物敏感性进行测定。其MIC值分别为O. 125、>64、64、1、
O.5,0. 5和0. 5mg/L。药敏结果显示该菌对氟胞嘧啶和氟康唑耐药。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。·
权利要求
1.一株指甲隐球菌(Cryptococcus uniguttulatus),保藏编号为 CGMCC No. 6017。
2.根据权利要求I所述的指甲隐球菌的分离培养纯化方法，其特征在于，该方法包括分离纯化步骤如下将隐球菌脑膜炎患者肺部活检组织或脑脊液在30°C条件下接种于沙氏琼脂培养基平板和酵母浸出膏蛋白胨琼脂培养基，第2天生长，得到指甲隐球菌菌落。
3.根据权利要求I所述的指甲隐球菌的分离培养纯化方法，其特征在于，该方法包括如下步骤指甲隐球菌菌种在30°C条件下于沙氏液体培养基和酵母浸出膏蛋白胨液体培养基进行振荡培养用于增菌。
4.根据权利要求I所述的指甲隐球菌的分离培养纯化方法，其特征在于，该方法包括培养和保存步骤如下从-70°C冰箱中取出冻存管，立即放置于37°C水浴中并适当摇动30s，打开冻存管，取50 μ I菌液接入沙氏斜面培养基上；保存时将菌液涂布平板，48小时后放入4°C冰箱短期保存或放入含有25%甘油的酵母浸出膏蛋白胨液体培养基中-70°C冻存； 所述的沙氏斜面培养基的组分和重量百分比如下葡萄糖4%、蛋白胨1%、琼脂I. 5%，每1000ml，加200mg氯霉素，121 °C 10分钟灭菌后备用； 所述的酵母浸出膏蛋白胨液体培养基的组分和重量百分比如下1%酵母浸出膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。
5.根据权利要求I所述的指甲隐球菌在筛选抗真菌药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的指甲隐球菌在筛选抗真菌药物中的应用，该抗真菌药物具体为抗人类脑膜炎药物。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种指甲隐球菌及其分离培养方法与应用。本发明提供了一株指甲隐球菌(Cryptococcus uniguttulatus)，已于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.6017。本发明对该菌株的形态特征、培养特征、碳源利用作了进一步研究。本发明还提供了该菌株的分离培养纯化方法，以及在筛选抗真菌药物中的应用。
文档编号C12N1/16GK102864084SQ20121034494
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月17日 优先权日2012年9月17日
发明者廖万清, 潘炜华 申请人:中国人民解放军第二军医大学