专利名称：通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组dna的方法
技术领域：
本发明涉及通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
浓香型白酒的生产过程与微生物菌群的演化交替密不可分，酒醅是白酒酿造过程中微生物生长基质，主要原料包扩高粱、糯米、小麦、玉米糠壳等根据不同工艺和传统其原料成分不同，其中含有大量醇、酸、酯等白酒风味物质和其他淀粉、多糖、色素等物质。微生物与窖池微生态环境相互作用并在窖池中进行复杂的物质能量代谢，积累了丰富多样的代谢产物，这些代谢产物是浓香型白酒酒体风味与口感形成的重要物质基础，探讨发酵过程中浓香型白酒酒醅微生物群落特性的差异及其变化规律对浓香型白酒生产有着重要的指导意义。运用分子生物学相关方法进行酒醅环境中微生物生态研究，能克服经典培养方法 的不足以及引起种群丢失等局限，可以更加可靠、快速地获得环境样品中各种微生物的菌落指纹，确定微生物的多样性及其分类地位，揭示和丰富生态环境的微生物资源。高质量DNA提取是采用分子生物学方法进行微生物种群研究的基础，能否快速成功提取酒醅样品多种微生物的DNA以及所提DNA质量的高低直接影响整个实验的成败。目前提取酒醅中微生物基因组DNA方法大多使用商品化的试剂盒。商品化的试剂盒适用范围比较专一，存在特异性的局限。试剂盒大多针对他对某一类菌提取效果好，且在多菌种存在的酒醅中试剂盒不能保证提取丰度和效果的稳定。虽然在PCR扩增可通过稀释模板浓度来降低杂质对实验操作的影响，但也会影响扩增效果，不利于后续分析(微生物的鉴定、多样性分析等)工作的进行。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法。本发明的技术方案是通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法，包括如下步骤酒醅样品的预处理，微生物基因组DNA的提取；其中，所述酒醅样品的预处理包括如下步骤取酒醅样品，加入玻璃珠，加入磷酸缓冲液，涡旋，4°C低速离心，取上清液，重复操作3飞次；合并所有上清，4°C高速离心，收集菌体沉淀。进一步的，所述玻璃珠与酒醅样品的质量比为I : f 2，玻璃珠的直径为f 2mm。进一步的，所述酒醅样品与磷酸缓冲液的质量比为I : 3 5。进一步的，所述磷酸缓冲液成分为13(Tl40mM NaCl，2 3mM KCl，l(Tl2mM Na2HPO4,I 2mM KH2PO4, pH 为 7. 0 8· O。进一步的，所述的低速离心是指200 400g离心3 5min。进一步的,所述的高速离心是指9000 14000rpm离心5 lOmin。进一步的，所述的微生物基因组DNA的提取采用商品化试剂盒、SDS高盐提取法及其衍生方法、CTAB提取法及其衍生方法中的一种。本发明还提供了上述方法在制备基因组DNA提取试剂盒中的用途。本发明方法简单快捷，易于操作，成本低廉。采用本发明方法进行预处理后，不仅没有影响用以提前基因组DNA的微生物的多样性，反而使提取基因组DNA纯度高，杂质少。本发明方法适于酒醅微生物的鉴定、分类、多样性研究等。
图I、未经预处理提取获得酒醅样品DNA扩增16S rDNA的琼脂糖电泳图；1为上层酒醅样品；2为中层酒醅样品；3为下层酒醅样品；Nr为空白样；Mr为DNA Maker。图2、经预处理后提取获得酒醅样品DNA扩增16S rDNA的琼脂糖电泳图；1为上层酒醅样品；2为中层酒醅样品；3为下层酒醅样品；Nr为空白样；Mr为DNA Maker。
图3、未经预处理提取获得酒醅样品DNA扩增16S rDNA的变性梯度凝胶电泳图；I为上层酒醅样品；2为中层酒醅样品；3为下层酒醅样品。图4、经预处理后提取获得酒醅样品DNA扩增16S rDNA的变性梯度凝胶电泳图；1为上层样酒醅品；2为中层酒醅样品；3为下层酒醅样品。图5、未经预处理提取获得酒醅样品DNA扩增18S rDNA的琼脂糖电泳图；1为50年样品；2为100样品；3为200样品；4为300年样品；Nr为空白样；Mr为DNA Maker。图6、经预处理提取获得酒醅样品DNA扩增18S rDNA的琼脂糖电泳图；I为50年样品；2为100年样品；3为200年样品；4为300年样品；Nr为空白样；Mr为DNA Maker。图7、未经预处理提取获得酒醅样品DNA扩增18S rDNA的变性梯度凝胶电泳图；I为50年样品；2为100年样品；3为200年样品；4为300年样品。图8、经预处理提取获得酒醅样品DNA扩增18S rDNA的变性梯度凝胶电泳图；I为50年样品；2为100年样品；3为200年样品；4为300年样品。
具体实施例方式本发明通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法，包括如下步骤酒醅样品的预处理，微生物基因组DNA的提取；其中，所述酒醅样品的预处理包括如下步骤取酒醅样品，加入玻璃珠，加入磷酸缓冲液，涡旋，4°C低速离心，取上清液，重复操作:Γ5次(尽可能多收集菌体细胞减少菌体流失)；合并所有上清，4°C高速离心，收集菌体沉淀。进一步的，所述玻璃珠与酒醅样品的质量比为I : f 2，玻璃珠的直径为广2mm。进一步的，所述酒醅样品与磷酸缓冲液的质量比为I : 3 5。进一步的，所述磷酸缓冲液成分为130 140mM NaCl，2 3mM KC1，10 12mMNa2HPO4,1 2mM KH2PO4, pH 为 7. 0 8· O。进一步的，所述的低速离心是指200 400g离心3 5min。进一步的,所述的高速离心是指9000 14000rpm离心5 lOmin。进一步的，所述的微生物基因组DNA的提取采用商品化试剂盒、SDS (十二烷基磺酸钠)高盐提取法及其衍生方法、CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)提取法及其衍生方法中的一种。本发明还提供了上述方法在制备基因组DNA提取试剂盒中的用途。
本发明中，低速离心主要是沉淀杂质获得菌体上清液，高速离心主要是为了让菌体上清液中菌体细胞沉淀下来。经发明人研究发现，在20(T400g下离心3飞min，可以很好的除去样品中的杂志，获得菌体上清液；经9000 HOOOrpm离心5 10min，能收集到菌体上清液中菌体细胞，同时又不会影响后续操作中菌体细胞的重悬。低温条件(4°C)离心是防止离心过程中DNA降解。本发明中，玻璃珠在使用前最好经灭菌处理，以尽量减少DNA提取过程中杂菌的带入。酒醅样品中加入玻璃珠、磷酸缓冲液后的涡旋相当于研磨过程，主要作用是洗脱菌体。玻璃珠的直径以f 2mm为宜，玻璃珠太大或太小均会让样品研磨不够充分，不能充分洗脱菌体。低速离心主要是沉淀杂质，玻璃珠与杂质一起沉降在下层沉淀中，取上层菌液进行后续操作。磷酸盐缓冲液的效果稳定能且保存时间长，且磷酸缓冲液适于细胞的洗涤等处理，因此在本发明中选用磷酸盐缓冲液。本发明方法通过预处理，将菌体和杂质通过离心分离，最终获得纯净的菌体用于 后续基因组DNA的提取。实施例I采用本发明方法提取酒醅中微生物的基因组DNA将酒醅填入新窖池中，发酵完毕后，取上、中、下层出窖酒醅为样品。本发明方法分别称取O. 5g酒醅样品于50ml离心管，向离心管加入3mL磷酸缓冲液(PBS )(137mMNaCl,2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, ρΗ8· O)和 O. 3g 玻璃珠(直径 2mm)，漩涡震荡5min, 200 X g离心5min,吸取上清液,重复上述操作三次，合并上清液，4°C下12000rpm离心5min，取沉淀作为基因组DNA提取材料。提取基因组DNA采用蛋白酶K与SDS高盐组合方法沉淀中加入ImLDNA抽提液(IOOmmoI/L Tris-HCl pH8. 0,100mmol/L EDTA, IOOmmoI/LNa3PO4,1. 5mol/L NaCl)和5μ 蛋白酶k (20mg/mL), 200r/min摇床37 下30min (—方面给蛋白酶k提供合适的反应温度，另外可以让菌体重悬)，在加入500 μ L10%SDS 65 °C水浴Ih。水浴后的样品4°C下6000 X g离心lOmin，小心吸取上清于2ml离心管，加入等体积酚氯仿异戊醇(25 24 I)抽提一次，12000rpm离心IOmin,取上清加入等体积氯仿:异戍醇(24 : l)12000rpm离心IOmin,取上清，重复两次。上清液加入O. 6体积预冷的异丙醇_20°C沉淀lh, 12000rpm离心IOmin,小心倒掉液体。沉淀用70%乙醇洗涤数次。洗涤后的DNA用吹风吹干后TE溶解，-20°C保存。对照方法直接称取O. 5g酒醅作为基因组DNA提取材料，不做预处理处理直接采用蛋白酶K与SDS高盐组合提取酒醅基因组DNA。使用核酸蛋白仪(Eppendorf公司生产)测定得到的基因组DNA纯度,根据核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，IOD值相当于双链DNA浓度为50 μ g/ml，单链寡核苷酸的含量为30 μ g/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度，通过测定在260nm和280nm的OD值的比值(0D260/0D280)，估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为
I.8^1. 9。若比值高于I. 9说明DNA样品中的RNA尚未除尽，若比值低于I. 8，若样品中含有酚和蛋白质等杂质。表I表明，预处理后提取的酒醅微生物基因组DNA的纯度更高。
表I提取得到的酒醅样品中微生物基因组DNA的纯度
OD260/280
上层酒醅样晶中层酒醅样品下层酒醅样晶本发明方法 Γ88L82L82 对照方法 L46 L28 L54以提取得到的酒醅微生物基因组DNA为模板，以细菌16S rDNA V3区的通用引物P2 (SEQ IDNol:5，-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3，)和 P3—GC (SEQ ID No2:5，-CGC CCGCCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’)作为引物，扩增16S rDNA。PCR模板量为10ng，扩增体系为ExTaq(takara公司生产)体系，扩增条件为94°C预变性4min ;94°C变性lmin，应用降落PCR，65°C开始退火，每两轮降低1°C，最终降至 56°C，退火 lmin ;72°C延伸 Imin ;再 94°C变性 lmin ;55°C退火 lmin ;72°C延伸 lmin,共10个循环，72°C终延伸6min。结果见图I、图2，预处理后提取的基因组DNA样品的扩增 产物条带明亮，带型佳，表明扩增效果好。同时将扩增产物经Dcode系统(Bi0-Rad公司生产的变性梯度凝胶电泳系统)进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)，尿素和甲酰胺浓度为3(T50%，200V电压下电泳210min，SYBR(赛伯公司生产的染色剂)染色30min。结果见图3、图4。经预处理后提取的基因组DNA样品的扩增产物的条带明显比未做处理提取的基因组DNA样品的扩增产物的条带更加清晰明亮，条带数目多，能用于单一条带切胶回收进行后续试验，说明获得的基因组DNA能很好反映酒醅中细菌微生物多样性，此外，经过预处理并没有影响用于提取基因组DNA的微生物的多样性。实施例2采用本发明方法提取酒醅中微生物的基因组DNA将酒醅分别填入50、100、200、300年窖龄的浓香型白酒酿造窖池发酵，发酵完毕后取出窖酒醅为样品。分别称取O. 5g出窖酒醅样品于50ml离心管，向离心管加入3mL磷酸缓冲液(PBS)(137mM NaCl, 2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4,ρΗ8· O)和 O. 3g 玻璃珠(2mm)，漩涡震荡5min, 200 X g离心5min,吸取上清液,重复上述操作三次，合并上清液，4°C下12000rpm离心5min，取沉淀。基因组DNA提取采用蛋白酶k与CTAB组合方法沉淀加入ImLCTAB抽提液(2%CTAB, 5moI/LNaCLUmoI/LTris-hcI (ρΗ=8)、0· 5mol/LEDTA)和 20 μ L 巯基乙醇，65 °C恒温混勻仪振荡30min,加入5μ I蛋白酶k (20mg/mL), 55°C恒温混勻仪振荡30min,室温5000rpm离心IOmin,收集的上清加入等体积酹氯仿异戍醇(25 : 24 : I)抽提一次，12000rpm离心IOmin,取上清加入等体积氯仿异戍醇(24 : : I) 12000rpm离心IOmin,取上清，重复两次。上清液加入O. 6体积预冷的异丙醇_20°C沉淀lh, 12000rpm离心IOmin,小心倒掉液体。沉淀用70%乙醇洗涤数次。洗涤后的DNA用吹风吹干后TE溶解。对照方法直接称取O. 5g酒醅作为基因组DNA提取材料，不做预处理直接采用蛋白酶k与CTAB组合提取酒醅基因组DNA。使用核酸蛋白仪(Eppendorf公司生产)测定得到的基因组DNA纯度。结果见表2，结果显示本发明提取获得DNA纯度高，且质量稳定。表I提取得到的酒醅样品中微生物基因组DNA的纯度
OD260/280
50年窖龄 100年窖龄 200年窖龄 300年窖龄 本发明方法 LB2L88L85L81
对照方法 L43L62L21L39 以提取得到的DNA为模板，引物为真菌18S rDNA通用引物NS3-GC (SEQ IDNo3:5，-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GGC AAG TCT GGT GCCAGC AGC C-3，)和 YM951r (SEQ ID No4:5，_TTG GCA AAT GCT TTC GC-3，)，扩增 18S rDNA。PCR模板量为10ng，扩增体系为ExTaq体系，扩增条件为95°C预变性4min ;93°C变性lmin，应用降落PCR，55°C开始退火，每两轮降低1°C，最终降至45°C ;退火lmin，72°C延伸3min ;再93°C变性lmin ;45°C退火lmin ;72°C延伸3min，共5个循环，72°C终延伸6min。结果见图5和图6。未处理提取的基因组DNA样品的PCR产物的条带较暗，而预处理后提取的基因组DNA的样品PCR产物的条带清晰明亮，扩增效果明显好于未处理提取的基因组DNA样品。采用伯乐Dcode系统进行变性梯度凝胶电泳，变性浓度为10 50%，200V电压下电泳240min，SYBR染色30min，结果见图7、图8。未处理样品DGGE凝胶图谱条带暗，且条带数目少。而预处理后提取的基因组DNA样品扩增产物DGGE凝胶图谱中的条带清晰明亮，能很好反映不同窖龄窖池酒醅中真菌的群落变化情况，可切胶回收用于后续研究。
权利要求
1.通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法，其特征在于包括如下步骤酒醅样品的预处理，微生物基因组DNA的提取；其中，所述酒醅样品的预处理包括如下步骤取酒醅样品，加入玻璃珠，加入磷酸缓冲液，涡旋，4°C低速离心，取上清液，重复操作3^5次；合并所有上清，4°C高速离心，收集菌体沉淀。
2.根据权利要求I所述的通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法，其特征在于所述酒醅样品与玻璃珠的质量比为I : f 2，玻璃珠的直径为f 2mm。
3.根据权利要求2所述的通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法，其特征在于所述磷酸缓冲液与酒醅样品的质量比为I : 3 5。
4.根据权利要求2或3所述的通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法，其特征在于所述磷酸缓冲液成分为13(Tl40mM NaCl，2 3mM KCl，l(Tl2mM Na2HPO4, T2mMKH2PO4, pH 为 7· 0 8· O。
5.根据权利要求2 4任一项所述的通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法，其特征在于所述的低速离心是指20(T400g离心3 5min。
6.根据权利要求2飞任ー项所述的通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法，其特征在于所述的高速离心是指9000 14000rpm离心5 lOmin。
7.根据权利要求2飞任ー项所述的通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法，其特征在于所述的微生物基因组DNA的提取采用商品化的DNA提取试剂盒、SDS高盐提取法及其衍生方法、CTAB提取法及其衍生方法中的ー种。
8.权利要求f7所述的通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法在制备基因组DNA提取试剂盒中的用途。
全文摘要
本发明涉及通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法，属于分子生物学技术领域。本发明要解决的技术问题是提供一种通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法。本发明的技术方案是通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法，包括如下步骤酒醅样品的预处理、微生物基因组DNA的提取。采用本发明方法提取的酒醅中微生物基因组DNA纯度高，杂质少，可用于酒醅微生物的分类、多样性研究等。
文档编号C12N15/10GK102816757SQ20121034442
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月17日 优先权日2012年9月17日
发明者李德林, 许正宏, 敖宗华, 史劲松, 王松涛, 陆震鸣, 林锋 申请人:泸州品创科技有限公司