专利名称：临床样本中结核分枝杆菌及吡嗪酰胺耐药性联合检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于荧光定量PCR及无细胞体外蛋白表达系统用于临床样本中结核分枝杆菌和吡嗪酰胺耐药性联合检测的方法，可用于检测和确认临床样本中的结核分枝杆菌及其批嗪酰胺耐药性。
背景技术：
结核病是威胁人类健康的重大传染病，目前用于一线治疗的药物有吡嗪酰胺、异烟肼、利福平和乙胺乙醇。随着药物化疗的推广，耐药性结核菌也随之大量出现，极大地影响了结核病人的治疗。结核病的有效诊断以及耐药检测对于指导临床治疗结核病有着非常重要的意义。但目前这两方面都面临着一些重要的问题，特别是结核分枝杆菌的吡嗪酰胺耐药性检测，极大地限制了结核病的防控能力，急需解决。在结核病的诊断方面，实验室结核分枝杆菌诊断主要有细菌学、免疫学及分子生物学三类技术。在细菌学检测中，痰涂片抗酸性染色镜检是结核检测最基本的方法。优点是操作简单、费用低廉、检测周期短，一般当天就可以出结果。但敏感性低，平均检出率只有25%-35%，无法区分死菌、活菌；特异性差，各种抗酸杆菌均可着色，需进一步试验才可确定是否为结核菌。结核菌的分离培养是目前鉴定结核分枝杆菌的金标准。由于结核分枝杆菌的繁殖受STPK (Ser/tHR蛋白激酶包括PknA、PKnB、PKnd)的控制，经常处于休眠状态和稳定期，因而生长缓慢，需2-8周才能出结果。分枝杆菌快速培养系统BACTEC 460TB和后来的BACTEC MGIT960，由于使用液体培养基，较好解决了结核菌生长缓慢这一问题。它具有检测周期短、敏感性高、自动化强、初代分离率高等优点。阳性检出时间由常规培养的8周缩短到3-14天，也能用于结核杆菌的耐药性检测，极大促进了结核细菌学诊断的发展，许多国家将此作为结核病诊断的标准参照系统。但是BACTEC 460TB和BACTEC MGIT960仪器昂贵、试剂依赖进口，操作复杂，阻碍了该方法的推广。结核分枝杆菌感染的免疫反应既有T细胞介导的细胞免疫反应，也发生较强的体液免疫反应。在免疫学检测中，利用体液反应的酶联(ELISA)等方法，在鉴别诊断结核分枝杆菌感染与卡介苗(BCG)接种及非致病性分枝杆菌感染等方面存在特异性差等。此外，常用的结核菌素试验(tuberculin skin test, TST)和IFN-Y释放试验(interferon- Y release assay, IGRA)等免疫学方法,在结核杆菌感染率高的国家和地区并不适合用于诊断结核病人。近年来随着分子生物学技术的发展，越来越多的新方法，如荧光定量PCR、等温扩增等，用于结核分枝杆菌的检测和鉴定，为结核疫情的防控提供了有效的途径。但目前大多数的分子检测手段都是只扩增结核分枝杆菌基因组中的某个特异型片段，着重于实现结核分枝杆菌检测这一单一目的，还未有与耐药性检测等联合起来的报道。结核分枝杆菌的耐药性检测，对于指导临床正确用药和有效控制结核病具有非常重要的作用。目前使用的用于治疗结核病的临床药物中，吡嗪酰胺是一线抗结核药物之一。目前临床上检测吡嗪酰胺的耐药性方法主要可以分为表型检测(细菌培养)和基因检测两类，并以前者为主。由于结核分枝杆菌生长缓慢，不仅需要长达I 2个月时间，而且对吡嗪酰胺的耐药性检测需要在酸性培养基中进行，对培养基的PH值控制要求高，往往导致即使是同一实验室不同时间测定的结果也不一致。而基因检测的方法主要是测定与吡嗪酰胺耐药性产生密切相关的吡嗪酰胺酶基因(PncA)的位点突变。已报道的方法有基因芯片、基因测序列等方法。所有基因检测方法只能根据已经报道的与耐药性产生有相关性的突变位点来判断是否耐药。但是由于PncA基因的很多位点突变，都会导致吡嗪酰胺耐药性的产生，而且新的突变位点也在不断报道，因此，各种基因检测的结果只能作为参考，对于新的突变位点还需要传统药敏实验进行验证。一系列的研究表明，吡嗪酰胺耐药性产生与结核pncA基因表达的吡嗪酰胺酶的活性丧失有90%以上的相关性。因此也有人报道通过直接测定结核分枝杆菌中的吡嗪酰胺酶活性来测定结核杆菌的吡嗪酰胺耐药性。但由于结核杆菌中吡嗪酰胺酶的含量少，该方法同样需要对结核杆菌进行培养放大后才能进行，需要的时间与传统的药敏时间差不多。基于以上结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的问题，我们之前发展了一种基于体外无细胞表达系统用于快速检测结核分枝杆菌临床分离株吡嗪酰胺耐药性的方法(申请号20111004779. 2结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测方法)。体外蛋白质无细胞表达系统是一种以外源DNA为模板，利用细胞抽提物中的蛋白合成机器、蛋白折叠因子及其他相关酶系，通过添加氨基酸、T7聚合酶和能量物质等来实现蛋白质体外快速表达的系统。经常使用的有兔网织红血球(rabbit reticulocyte)、小麦胚芽(wheat germ)、大肠杆菌(E.coli)的细胞裂解液。利用体外无细胞表达系统表达出吡嗪酰胺酶，吡嗪酰胺酶可以催化吡嗪酰胺转化成吡嗪酸，后者与硫酸亚铁铵反应生成棕红色物质。通过反应液颜色的深浅判断吡嗪酰胺酶的活性高低，依此来检测结核分枝杆菌是否发生耐药性突变。将体外无细胞表达系统引入吡嗪酰胺的耐药检测，不仅具有基因检测耗时短的优点，兼具表型检测可同时检测多位点耐药突变和潜在耐药位点突变的优势，避免假阴性结果的产生，具有更好的特异性和灵敏性。但由于扩增效率问题，该方法还不能很好的用于临床样本中结核分枝杆菌的吡嗪酰胺耐药性检测，只能用于临床分离株。但从临床样本中分离结核分枝杆菌，需要长达一个月的时间。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种临床样本，特别是痰液中结核分枝杆菌及其吡嗪酰胺耐药性联合检测方法，以实现直接从临床样本中检测结核分枝杆菌以及其吡嗪酰胺耐药性，提高结核病诊断和治疗的效率。本发明公开了一种临床样本中结核分枝杆菌及其吡嗪酰胺耐药性的联合检测方法。其特点在于通过在结核分枝杆菌基因组中吡嗪酰胺酶基因基因)上游和下游的保守区域设计荧光定量PCR的特异引物，所采用的引物具有不与/7/7^基因阅读框内任何序列完全匹配及所得PCR产物含有全长基因的特征，利用循环阈值(Ct)值通过标准曲线测定临床样本中结核分枝杆菌后，对检测到含有结核分枝杆菌的样本，再以荧光定量PCR产物为模板，采用含有体外表达元件的引物，所采用的引物具有不与吡嗪酰胺酶基因(抑M)阅读框内除起始密码子ATG以外的任何序列完全匹配及所得PCR产物含有全长基因的特征，再次进行PCR扩增，添加体外表达元件后，利用无细胞表达系统表达吡嗪酰胺酶，测定所表达的吡嗪酰胺酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酰胺酸的酶活性。所测得的酶活性，一方面通过与同样条件下空白对照体外表达液测得的酶活结果比较，判断荧光定量PCR扩增产物是否含有结核分枝杆菌全长PncA片段，另一方面与采用同样方法表达和测定的结核分枝杆菌标准敏感株和耐药株吡嗪酰胺酶活性结果进行比较，进行吡嗪酰胺耐药性检测。整个技术方案的特征在于荧光定量PCR扩增全长基因，体外表达的吡嗪酰胺酶酶活性能反应整个/7/ ^基因阅读框内任意碱基突变引起的酶活性改变，实现了临床样本中结核分枝杆菌的荧光定量及其吡嗪酰胺耐药性联合检测，无需细菌培养和DNA序列测定仪。其步骤是
(O裂解临床样本中结核分枝杆菌并提取其DNA ;其目的是将临床样本中结核分枝杆菌分离出来并破碎其细胞壁，释放出基因组，作为以下PCR检测的模板。(2)根据/7/7C儿GenBank序列号为U59967所述的结核分枝杆菌基因组中卩比嗪酰胺酶基因及其上下游序列的特征，设计特异引物，所采用的引物具有不与吡嗪酰胺酶基因(Md)阅读框内任何序列完全匹配及所得PCR产物含有全长基因的特征，通过荧光定量PCR扩增含有全长吡嗪酰胺酶基因QmcA)的结核分枝杆菌基因组片段来检测临床样本中是否含有结核分枝杆菌；
(3)对于步骤(2)中检测到有结核分枝杆菌的样本，采用设计的含有体外表达元件的引物，所采用的引物具有不与吡嗪酰胺酶基因(Md)阅读框内除起始密码子ATG以外的任何序列完全匹配及所得PCR产物含有全长基因的特征，以(2)中获得的荧光定量PCR产物为模板，再次进行PCR扩增含有全长基因的片段，为基因添加表达元件，使得无细胞体外表达系统能够对加入的PCR产物进行吡嗪酰胺酶的表达；
(4)浓缩步骤(3)中获得的PCR产物并定量；
(5)加入I 20微克的步骤(4)中获得的PCR产物，采用无细胞体外表达系统表达吡嗪酰胺酶，根据需要选择表达时间I到24小时；
(6)取I 50微升表达吡嗪酰胺酶后的体外表达系统液，测定其中所含有的吡嗪酰胺酶的活性；一方面通过与同样条件下空白对照体外表达液测得的酶活结果比较，判断荧光定量PCR扩增产物是否含有结核分枝杆菌全长片段，另一方面通过与同样方法表达标准吡嗪酰胺敏感菌株和耐药菌株基因的吡嗪酰胺酶活性进行比较，判断样本中结核分枝杆菌的Md基因是否发生了耐药突变，实现对其吡嗪酰胺耐药性的检测。本发明提供的检测方法与现有技术相比，具有以下主要优点和效果
I.结核分枝杆菌检测的特异性高
目前有多种基于PCR的方法，包括荧光定量PCR方法，来检测临床样本中的结核分枝杆菌。本荧光定量PCR方法与其它检测结核分枝杆菌PCR方法的显著差异在于扩增的产物为包含有全长的结核分枝杆菌基因的结核基因组片段，扩增的片段比其它PCR方法的都长，同时对阳性扩增样本，采用体外无细胞表达系统表达吡嗪酰胺酶，其酶活的测定可以进一步辅助鉴定荧光定量PCR产物是否为含有全长的基因。由于有机整合了一个鉴定步骤，能排除荧光定量PCR的非特异性扩增结果，提高了结核分枝杆菌检测的特异性。2.结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药检测时间短。传统的结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测方法需要从临床样本中分离到菌之后才能进行药敏实验，检测周期长达一个多月。本方法能实现直接从临床样本中检测结核分枝杆菌的吡嗪酰胺耐药性，能够将结核菌检测及吡嗪酰胺耐药性检测的时间缩短到一天以内，极大地缩短了结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测所需的时间。3.结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药检测灵敏度高。与目前的基于PCR分子检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性方法相比，本方法通过荧光定量PCR和体外表达PCR两次扩增模板，临床样本中少量的结核分枝杆菌样本就满足了体外表达所需的模板量，大大提高了耐药检测的灵敏度。4.能检测因结核分枝杆菌基因阅读框内任意碱基突变引起的吡嗪酰胺耐药性。目前的基因突变检测方法(包括DNA测序仪)都只能根据已经报道的与耐药性相关的突变位点来判断是否耐药，对于新发现的碱基突变，不能给出是否耐药的结果，往往需要传统的基于培养的表型耐药检测方法来确认。由于本发明的引物设计具有的不与吡嗪酰胺酶基因(抑“)阅读框内除起始密码子ATG以外的任何序列完全匹配及所得PCR产物含有全长基因的特征，体外表达的吡嗪酰胺酶酶活性能反应整个基因阅读框内任意碱基突变引起的酶活性改变，可同时检测多位点突变或潜在耐药突变，适用性更广。总之，本发明首次将临床样本中结核分枝杆菌检测与吡嗪酰胺耐药性检测有机结合了起来。通过荧光定量PCR首先检测临床样本中是否有结核分枝杆菌，然后再进行吡嗪酰胺的耐药性检测，能快速提供这两种目前结核病诊断和治疗所需的信息，极大地提高了检测效率。
图I为临床样本中结核分枝杆菌荧光定量及其吡嗪酰胺耐药性联合检测示意图。图2为所使用的荧光定量PCR引物对1，体外表达PCR引物对I RpncA基因在结核分枝杆菌基因组中的相对位置示意图。图3为结核分枝杆菌标准菌株荧光定量PCR的典型扩增曲线。图4为凝胶电泳检测荧光定量PCR产物及体外表达PCR产物的示意图。图5为检测痰液样品中结核分枝杆菌荧光定量PCR的典型扩增曲线。图6为检测结核分枝杆菌标准菌株H37Ra荧光定量PCR标准曲线。图7为结核分枝杆菌标准菌株和痰液样本中结核分枝杆菌采用小麦胚芽无细胞表达系统体外表达后的酶活测定显色结果示意图。图8为通过所测定的吡嗪酰胺酶活性检测临床样本药敏实验结果。图9为体外表达PCR时引物添加(体外表达正向引物I)和不添加表达增强子(体外表达正向引物2)对体外表达酶活测定的比较结果。图10为所使用的荧光定量PCR引物对1，体外表达PCR引物对3及基因在结核分枝杆菌基因组中的相对位置示意图。图11为采用大肠杆菌无细胞表达系统体外表达结核分枝杆菌标准菌株吡嗪酰胺酶的酶活测定结果。图12为所使用的荧光定量PCR引物对2，体外表达PCR引物对I及基因在结核分枝杆菌基因组中的相对位置示意图。图13为采用引物对2荧光定量PCR检测结核分枝杆菌标准菌株的典型扩增曲线。
图14为采用引物对2荧光定量PCR扩增后进行小麦胚芽无细胞表达系统体外表达吡嗪酰胺酶活性检测的实验结果。图15为将不含目的基因的引物二聚体进行小麦胚芽无细胞表达系统体外表达吡嗪酰胺酶活性检测的实验结果。
具体实施例方式本发明提供的临床样本中结核分枝杆菌及其吡嗪酰胺耐药性联合检测方法，其检测流程如图I所示。首先利用荧光定量PCR技术检测临床样本中是否含有结核分枝杆菌。如果出现阳性扩增就证明样本中含有结核分枝杆菌，则需要对其则吡嗪酰胺耐药性进行检测。进行吡嗪酰胺耐药性检测时，以上步的荧光定量PCR产物为模板，采用含有体外表达元件的引物，再次进行PCR扩增，添加表达所需要的元件，如T7启动子等。将扩增的产物浓缩后回收并定量，加入到体外表达系统中，测定所表达的吡嗪酰胺酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酰胺酸的酶活性。所测得的酶活性，一方面通过与同样条件下空白对照体外表达液测得的酶活结果比较，判断荧光定量PCR扩增产物是否含有结核分枝杆菌全长pncA片段，另一方面与采用同样方法表达和测定的结核分枝杆菌标准敏感株和耐药株吡嗪酰胺酶活性结果进行比较，判断是否发生了耐药突变，实现对临床样本中结核分枝杆菌的吡嗪酰胺耐药性的检测。图中所示的时间仅仅作为本方法所需总时间的大致示意，可以根据实际情况和需要进行增减和调整。人体除了毛发、指甲等部位不会感染结核外，其他所有部位均会感染，但以肺结核最为常见。因此，在临床检验中，常需要对各种临床样本中是否含有结核分枝杆菌进行检测来确认结核病，其中检测痰液最为常见。下面以临床痰液中结核分枝杆菌及其吡嗪酰胺耐药性检测为例，结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明。实施例I :
以吡嗪酰胺敏感株结核分枝杆菌标准菌株I tuberculosis H37Ra(美国菌种保存中心编号ATCC 25177)作为吡嗪酰胺药物敏感对照，标准吡嗪酰胺耐药株卡介苗BCG (美国菌种保存中心编号=ATCC 19274)作为吡嗪酰胺药耐药对照，将这两个培养的结核菌株的测定结果用于建立判断实际样本中是否含有结核分枝杆菌的荧光定量PCR标准曲线以及试验本方法是否能区分标准吡嗪酰胺耐药株和敏感株。具体步骤如下
I.裂解结核分枝杆菌和提取其DNA
(I)从培养有结核分枝杆菌标准菌株I tuberculosis H37Ra和BCG的L-J培养基上，分别用接种环刮取一环菌，溶于2 mL NaOH溶液，混匀后，37°C孵育5 min。(2)离心10 min，去上清留沉淀。PBS洗涤，重复洗2次，去上清留沉淀待检。(3) DNA提取向上述处理好的标本中加入DNA提取液。沸水浴lOmin，然后直接利用裂解液作为模板。2.根据结核分枝杆菌基因组中吡嗪酰胺酶基因(Md)阅读框及其上下游序列，设计特异引物，引物应具有不与吡嗪酰胺酶基因(Md)阅读框内任何序列完全匹配及所得PCR产物含有全长基因的特征，通过荧光定量PCR对结核分枝杆菌进行检测。本实施例中设计和使用的引物序列如下
定量 PCR 正向引物 I :5’ CGGACGGATTTGTCGCTCAC 3’ ；
定量 PCR 反向引物 I :5’ GCCCGATGAAGGTGTCGTAGAAG 3’。以下简称为荧光定量PCR引物对1，其在结核分枝杆菌基因组中的位置如图2所示。可见其完全互补区域位于基因的上下游区域，不与阅读框内任何序列匹配。检测时米用TaKaRa 公司生产的 MightyAmp for Real Time (SYBR Plus)试剂盒。扩增体系20 μι，其中MIX加10 μ ，上下游引物各加O. 5 μ ，模板加入2μ ，补水至总体积20 μ 。根据ABI公司的仪器说明书，设定反应程序及熔点曲线分析程序。反应条件98°C预变性2 min;98°C变性10 s，68°C退火65 s，85°C采集荧光，35个循环。典型的PCR扩增曲线如图3所示。扩增产物的凝胶电泳结果如图4所示。扩增产物的分子条带为918bp,符合设计预期，所得PCR产物应含有全长基因。 3.取H37Ra基因组制作标准品，梯度稀释后进行荧光定量PCR，获取标准曲线，结果如图6所示。由图可以看出，荧光定量PCR检测的Ct值与H37Ra基因组的模板数对数之间存在线性关系，检测灵敏度可达到10 copies/μ 左右。4.以步骤2中的荧光定量PCR产物为模板，使用带有启动子，或者同时带有启动子和增强子的引物，进行PCR扩增，为步骤2中所得的产物添加无细胞表达系统元件。本实施例中采用的表达系统为小麦胚芽无细胞表达系统，根据该系统特点，设计和采用的引物序列如下
体外表达正向引物I :
5’ TAATACGACTCACTATAGGATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGCTTACAAATACTCCCCCAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT 3，
体外表达反向引物 I : 5’ ACCGCCGCCAACAGTTCATCCCGGT3’
如图2所示，这对引物(体外表达引物对I)具有不与吡嗪酰胺酶基因(Md)阅读框内除起始密码子ATG以外的任何序列完全匹配及所得PCR产物含有全长基因的特征，其中正向引物含有适合小麦胚芽无细胞表达系统的T7启动子5’ TAATACGACTCACTATAGG 3’和一段5’ UTR增强子序列
5’ ATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGCTTACAAATACTCCCCC 3’
PCR反应条件98°C预变性30s;98°C变性10 s，66°C退火lmin，72°C扩增30 s，35个循环，72°C保温IOmin。体外表达PCR扩增产物的凝胶电泳结果如图4所示。扩增产物的分子条带为623 bp,符合设计预期，所得PCR产物含有全长基因。PCR扩增后，对于获得的产物进行浓缩
(I)在获得的PCR产物中，加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5. 2)溶液，均匀混合。(2)加入4 μ L的DNAmate溶液，均匀混合。(3 )加入2. 5倍体积的-20 V预冷无水乙醇，充分混匀。(4) 12,000 r/min 4°C离心 15 分钟。(5)弃溶液，留白色沉淀。(6)加入_20°C预冷的70%乙醇I mL，上下颠倒洗涤沉淀。重复洗涤两次。(7)12,000 r/min 4°C离心5分钟后小心弃去乙醇，真空干燥。加入适量的无核酸酶的水溶解DNA。
5.采用Nanodrop微量分光光度计测定回收产物的浓度。一般浓度应达到800 ng/μ L-1000 ng/μ L，回收产物在波长260 nm和280 nm处的吸光比值A260/A280在I. 70-1. 85范围内。6.采用RTS 100 Wheat germ CECF Kit小麦胚芽体外无细胞表达试剂盒，表达吡嗪酰胺酶。把反应体系置于恒温混匀仪中，24 0C, 9000 r/min，反应10-20 h ;反应体系见表I。7.由于吡嗪酰胺降解为吡嗪酸后，能与亚铁离子反应生成棕红色产物，从而反应液的颜色变化可以作为耐药性检测的指标。体外表达反应结束后，取20 μ L反应混合液加入到150 μ L 10 mg/mL吡嗪酰胺(PZA)溶液中，37°C孵育3 h。然后加入10 μ L 10% (ff/V)硫酸亚铁铵，显色。所显示的红棕色深浅可以通过肉眼直接区分，也可以通过分光光度 计测定460 nm处吸光值区分。从图7中，可以看出标准敏感株H37Ra的反应后颜色红棕色，说明从其基因表达的吡嗪酰胺酶活性高，能使吡嗪酰胺发挥疗效。而标准耐药株BCG的反应后颜色为无色或者很淡的红棕色，说明从其基因表达的吡嗪酰胺酶活性基本没有或者低，吡嗪酰胺不能发挥疗效，表现为耐药。在同样条件下，不加入体外表达PCR扩增产物的无细胞体外表达空白液没有显示出任何吡嗪酰胺酶活性，其在460nm处的吸光值最低。很显然，如果荧光定量PCR产物中不含有全长基因，那么体外表达PCR扩增产物中也不会含有全长
基因，从而体外表达后的表达液中将不会显示出任何吡嗪酰胺酶活性。因此，无细胞体外表达空白液在460nm处所显示的吸光值，可以作为一个辅助判断标准，如果体外表达后的表达液中吡嗪酰胺酶活性低于或者等于空白吸收值，那么荧光定量PCR产物中应不含有全长/7/^基因，从而可以排除一些非特异性扩增引起的假阳性，提高荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的特异性。实施例2
本实施例以从武汉市结核病防治所采集的确诊为结核病人的3份临床痰液(218，271，8333号)作为试验样本，来试验本方法是否能适合用于对临床痰液中结核分枝杆菌的检测和吡嗪酰胺耐药性检测进行初步的验证。具体步骤如下
I.裂解和提取痰液中结核分枝杆菌的DNA ;
(1)分别向一定量的痰液(1-5mL)中加入2 mL NaOH溶液，混匀后，37°C孵育20min.
(2)离心10min，去上清留沉淀。PBS洗涤，重复洗2次，去上清留沉淀待检。(3)DNA提取向上述处理好的标本中加入DNA提取液纯净水。沸水浴10 min,然后直接利用裂解液作为模板。2.采用与实施例I中荧光定量PCR同样的引物序列，通过荧光定量PCR对痰液中是否有结核分枝杆菌进行检测。定量PCR正向引物I :5’ CGGACGGATTTGTCGCTCAC 3’ ；定量PCR 反向引物 I :5’ GCCCGATGAAGGTGTCGTAGAAG 3’。检测时米用TaKaRa 公司生产的 MightyAmp for Real Time (SYBR Plus)试剂盒，同步平行扩增实施例I中提取的结核分枝杆菌标准菌株DNA作为对照。扩增体系20 μ ,其中MIX加10 μ ，上下游引物各加O. 5 μ ，模板加入2μ ，补水至总体积20 μ 。根据ABI公司的仪器的说明书，设定反应程序及熔点曲线分析程序。反应条件98°C预变性2 min；98°C变性10 s，68°C退火65 s，85°C采集荧光，35个循环。三个临床样本扩增结果如图5所示。可以看出，这三个临床样本都有阳性扩增，检测结果为痰液中含有结核分枝杆菌。3.采用与实施例I中体外表达PCR同样的引物序列，对于本实施例步骤2中的三个阳性扩增产物，再次进行PCR，添加与实施例I中同样的体外表达元件并对产物进行浓缩。同时也对标准菌株的荧光定量PCR产物分别进行同样的PCR和浓缩，作为样本结果的对照。PCR 反应条件98°C预变性 30s ;98°C变性 10 s，66°C退火 lmin，72°C扩增 30 s,35个循环，72°C保温IOmin。PCR扩增后，对于获得的产物进行浓缩
(I)在获得的PCR产物中，加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5. 2)溶液，均匀混合。
(2)加入4 μ L的DNAmate溶液，均匀混合。(3 )加入2. 5倍体积的-20 V预冷无水乙醇，充分混匀。(4) 12，000 r/min 4°C离心 15 分钟。(5)弃溶液，留白色沉淀。(6)加入_20°C预冷的70%乙醇I mL，上下颠倒洗涤沉淀。重复洗涤两次。(7)12,000 r/min 4°C离心5分钟后小心弃去乙醇，真空干燥。加入适量的无核酸酶的水溶解DNA。4.采用Nanodrop微量分光光度计测定回收产物的浓度。一般浓度应达到800 ng/μ L-1000 ng/μ L，回收产物在波长260 nm和280 nm处的吸光比值A260/A280在I. 70-1. 85范围内。5.采用RTS 100 Wheat germ CECF Kit小麦胚芽体外无细胞表达试剂盒，将上步获得的PCR产物分别加入到体外表达溶液体系中，表达吡嗪酰胺酶。把反应体系置于恒温混匀仪中，24 0C, 9000 r/min，反应10-20 h;反应体系见表2。6.采用与实施例I中同样的方法，通过在吡嗪酰胺酶作用下，吡嗪酰胺降解为吡嗪酸后，能与亚铁离子反应生成棕红色产物的反应分别测定表达的吡嗪酰胺酶活性。体外表达反应结束后，取20 μ L反应混合液加入150 μ L 10 mg/mL的吡嗪酰胺(PZA)中，37°C孵育3 h。然后加入10 UL 10% (W/V)硫酸亚铁铵，显色。红棕色的深浅可以通过肉眼直接区分，也可以通过分光光度计测定460 nm处吸光值区分。从三个临床样本中扩增的基因所表达的吡嗪酰胺酶活性的显色结果及对应460 nm吸光值如图7所示。7.由于整个实验过程中，不同测试和重复会产生一定的误差。为了判断实际样本与标准菌株酶活性测试结果的差别是否是由于误差引起，还是由于基因突变引起，可以通过多次重复测定标准菌株的酶活结果，通过标准偏差来确定临界值(Cutoff)。在本实施例中，我们采用实施例I中标准敏感株H37Ra的三次重复结果来确定临界值。Cutoff值确定的具体过程为以H37Ra三次的460nm平均吸光值作为1，将H37Ra单次测定的吸光值除以该平均吸光值的比值作为结果进行标准偏差(SD)计算，临界值划为(I - 3SD)，如图8实线所示。由于基因突变引起吡嗪酰胺耐药的主要原因是突变后的吡嗪酰胺酶活降低，因此，小于该临界值的可以认为样本的吡嗪酰胺酶活性低于敏感对照，判断为吡嗪酰胺耐药，高于该临界值的可以认为与H37Ra的吡嗪酰胺酶活性相当，判断为吡嗪酰胺敏感。同时我们采用不加入任何DNA的空白体外表达液的三次重复结果确定一个判断荧光定量PCR产物是否含有全长PncA基因的临界值。该临界值确定过程为以H37Ra三次的460nm平均吸光值作为1，将空白对照单次测定的吸光值除以该平均吸光值的比值作为结果进行标准偏差(SD)计算，同时计算空白比值的平均值A0，临界值划为(AO + 3SD)，该处理结果如图8虚线所示。从图8可以看出，标准耐药株BCG和临床样本218，8333的测定结果，小于临界值，表现为吡嗪酰胺耐药。而临床样本271的吡嗪酰胺酶活高于临界值，表现为吡嗪酰胺敏感。进一步对PCR产物进行测序，结果显示临床样本218和8333的pncA基因上存在有导致吡嗪酰胺耐药的基因突变(分别为89位，151位)，而临床样本271的基因上不存在有突变，与标准敏感株H37Ra的抑M序列一致。该结果同时说明，本方法检测吡嗪酰胺耐药性，不需要预先知道突变位点信息，只需根据所表达的吡嗪酰胺酶活性相对与标准株是否有改变，就可以判断结果。由于本发明的引物设计具有不与吡嗪酰胺酶基因(Md)阅读框内除起始密码子ATG以外的任何序列完全匹配及所得PCR产物含有全长基因的特征，因此PCR扩增的DNA产物能包含基因阅读框内任何位置的可能突变，从该扩增产物体外表达的吡嗪酰胺酶酶活性能反应整个/7/ ^基因阅读框内任意碱基突变引起的酶活性改变，可同时检测多位点突变或潜在耐药突变。从图8中的结果，还可以看出从三株临床样本扩增出的基因所表达的吡嗪酰胺酶活性都高于空白对照的临界值(AO + 3SD)，说明荧光定量PCR产物中应包含有全长的基因，再次验证了荧光定量PCR的结果。本实施例结果显示本发明提供的方法能成功地用于测定临床痰液中的结核分枝杆菌及其吡嗪酰胺的耐药性。实施例3
在吡嗪酰胺耐药性检测的步骤中需要为荧光定量PCR产物添加体外表达元件，如T7启动子，表达增强子等。本实施例以批嗪酰胺敏感株结核分枝杆菌标准菌株麗tuberculosisH37Ra (美国菌种保存中心编号ATCC 25177)作为吡嗪酰胺药物敏感对照，标准吡嗪酰胺耐 药株卡介苗BCG (美国菌种保存中心编号ATCC 19274)作为吡嗪酰胺药耐药对照，两种菌株分别采用带有和不带有一段表达增强子5’ UTR的引物进行体外表达PCR。然后加入到小麦胚芽无细胞表达系统中，研究引物中的表达增强子是否会对吡嗪酰胺耐药性测定有影响。具体步骤如下
I.采用与实施例I中同样的方法裂解结核分枝杆菌标准菌株I tuberculosis H37Ra和BCG并提取其DNA。2.采用与实施例I中同样的荧光定量PCR引物序列和方法对提取的DNA进行荧光定量PCR扩增。3.对于本实施例步骤2中的扩增产物，分别采用以下两对引物，再次进行PCRj^加适合小麦胚芽表达体外表达系统的原件并对产物进行浓缩。体外表达正向引物I :
5’ TAATACGACTCACTATAGGATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGCTTACAAATACTCCCCCAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT 3，；
体外表达反向引物I :
5’ ACCGCCGCCAACAGTTCATCCCGGT3’ ；体外表达正向引物2 :
5’ TAATACGACTCACTATAGGAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT 3’ ；
体外表达反向引物2
5’ ACCGCCGCCAACAGTTCATCCCGGT3’ 。其中正向引物I含有适合小麦胚芽无细胞表达系统的T7启动子5’TAATACGACTCACTA TAGG 3’ 和一段 5’UTR 增强子序列5’ ATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCA CACAGCTTACAAATACTCCCCC 3’ ；而正向引物2只含有T7启动子，不含有5’UTR增强子。两对引物与结核基因组匹配的序列都一样。
PCR 反应条件98°C预变性 30s ;98°C变性 10 s，66°C退火 lmin，72°C扩增 30 s,35个循环，72°C保温IOmin。采用与实施例I中同样的方法分别浓缩PCR扩增的DNA片段。4.采用Nanodrop微量分光光度计测定回收产物的浓度。一般浓度应达到800ng/μ L-1000 ng/μ L，回收产物在波长260 nm和280 nm处的吸光比值A260/A280在I. 70-1. 85 范围内。5.采用RTS 100 Wheat germ CECF Kit体外无细胞表达试剂盒，及实施例I中相同的表达条件和方法表达吡嗪酰胺酶和同样的酶活检测方法检测所表达的吡嗪酰胺酶活。结果如图9所示。从图9可以看出带5’ UTR增强子所表达的标准敏感株H37Ra吡嗪酰胺酶反应后在460nm波长的吸收值0D460值比不带5’ UTR增强子的高，说明带5’ UTR增强子可以在同样时间内增加吡嗪酰胺酶的表达。而标准耐药株BCG无论加或者不加表达增强子5’ UTR，测得的吡嗪酰胺酶活性差别不大，反应后颜色为无色或者很淡的红棕色0D460值较低。但无论使用的引物是否带有5‘UTR，标准敏感株与耐药株的酶活差别明显，说明无论加或者不加表达增强子5’ UTR不影响本检测方法对于耐药性的判断。但带有5‘UTR增强子能在相同时间内，更明显地区分敏感株和耐药株。本实施例说明表达增强子5’ UTR具有能够增强表达嗪酰胺酶的作用，本检测方法即使在不加入表达增强子5’ UTR时也能够很好的区分开敏感株与耐药株，引物设计可以根据需要进行体外表达元件的选择。实施例4
除了上述实施例中采用小麦胚芽体外无细胞蛋白质表达系统外，本检测方法原理上还可以使用其它的体外表达系统，如经常使用的兔网织红血球(rabbit reticulocyte)、以及大肠杆菌疋· coli)的无细胞体外蛋白质表达系统，来对荧光定量PCR检测阳性的样本，进行吡嗪酰胺酶的表达，从而实现吡嗪酰胺耐药性检测。本实施例以吡嗪酰胺敏感株结核分枝杆菌标准菌株IH37Ra (美国菌种保存中心编号ATCC 25177)作为吡嗪
酰胺药物敏感对照，标准吡嗪酰胺耐药株卡介苗BCG(美国菌种保存中心编号ATCC 19274)作为吡嗪酰胺药耐药对照，采用大肠杆菌(E. coli)无细胞表达系统来表达吡嗪酰胺酶，实现对结核分枝杆菌吡嗪酰胺的耐药性进行检测。具体步骤如下
I.采用与实施例I中同样的方法裂解结核分枝杆菌标准菌株I tuberculosis H37Ra和BCG并提取其DNA。2.采用与实施例I中同样的荧光定量PCR引物序列和方法对提取的DNA进行荧光定量PCR扩增。3.对于本实施例步骤2中的扩增产物，采用以下引物，再次进行PCR，添加适合大肠杆菌无细胞体外表达系统的表达原件并对产物进行浓缩。本实施例中采用的引物序列如下
体外表达正向引物3 :
5’ TAATACGACTCACTATAGGAAGGAGATAATGCATCATCATCATCATCACAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT 3，；
体外表达反向引物3
5’ ACCGCCGCCAACAGTTCATCCCGGT3’ 。
如图10，这对引物具有不与吡嗪酰胺酶基因阅读框内除起始密码子ATG以外的任何序列完全匹配及所得PCR产物含有全长基因的特征，其中正向引物含有适合大肠杆菌无细胞表达系统的T7启动子5’ TAATACGACTCACTATAGG 3’和一段SD序列5’AAGGAGATAATGCATCATCATCATCATCAC 3，
采用与实施例I中同样的方法分别浓缩PCR扩增的DNA片段。4.采用Nanodrop微量分光光度计测定回收产物的浓度。一般浓度应达到800ng/μ L-1000 ng/μ L，回收产物在波长260 nm和280 nm处的吸光比值A260/A280在I. 70-1. 85 范围内。5.采用RTS 100 E. coli HY Kit体外无细胞表达试剂盒，表达吡嗪酰胺酶。把反应体系置于恒温混匀仪中，30 °C，反应4-6 h;反应体系见表3。6.采用与实施例I中同样的方法，通过在吡嗪酰胺酶作用下，吡嗪酰胺降解为吡嗪酸后，能与亚铁离子反应生成棕红色产物的反应分别测定表达的吡嗪酰胺酶活性。体外表达反应结束后，取20 μ L反应混合液加入150 μ L 10 mg/mL的吡嗪酰胺(PZA)中，37°C孵育3 h。然后加入10 UL 10% (W/V)硫酸亚铁铵，显色。实验的结果通过分光光度计测定460 nm处吸光值区分。从图11中，可以看出标准敏感株H37Ra的0D460值较高，说明从^pncA基因表达的吡嗪酰胺酶活性高，能是吡嗪酰胺发挥疗效。而标准耐药株BCG的0D460值较低，反应后颜色为无色或者很淡的红棕色，说明从其基因表达的吡嗪酰胺酶活性基本没有或者低，吡嗪酰胺不能发挥疗效，表现为耐药。本实施例说明本发明方法利用大肠杆菌(E. coli)无细胞表达系统依旧可以取得较好的检测结果。因此，根据需要，本发明方法可以选择不同的体外表达系统，关键在于要在体外表达PCR的引物设计上，需要选择添加适合不同体外表达系统的表达元件。实施例5
除了在上述实施例1-4中使用的定量PCR正向引物I及定量PCR反向引物I这对引物外，还可以设计采用其它的荧光定量PCR引物序列来对痰液中的结核分枝杆菌来进行检测，只要引物具有不与吡嗪酰胺酶基因阅读框内的任何序列完全匹配及所得PCR产物含有全长基因的特征，就不会影响后面通过体外表达系统表达吡嗪酰胺酶并测定酶活，来对阳性样本进行吡嗪酰胺耐药性的检测。本实施例以吡嗪酰胺敏感株结核分枝杆菌标准菌株I (MercWo1Si1S H37Ra (美国菌种保存中心编号ATCC 25177)作为吡嗪酰胺药物敏感对照，标准吡嗪酰胺耐药株卡介苗BCG (美国菌种保存中心编号ATCC 19274)作为吡嗪酰胺药耐药对照，采用另一对荧光定量PCR引物来对这两种菌株进行结核分枝杆菌及其吡嗪酰胺药耐药性检测。具体步骤如下
I.采用与实施例I中同样的方法裂解结核分枝杆菌标准菌株I tuberculosis H37Ra和BCG并提取其DNA。2.根据结核分枝杆菌基因组中吡嗪酰胺酶基因阅读框及其上下游序列，设计特异引物，引物应具有不与吡嗪酰胺酶基因(Md)阅读框内任何序列完全匹配及所得PCR产物含有全长基因的特征，通过荧光定量PCR对结核分枝杆菌进行检测。本实施例中设计和使用的引物序列如下
定量 PCR 正向引物 2 :5’ GGCGTCATGGACCCTATATCTGTGG3’ ；定量 PCR 反向引物 2 :5’ CGGTGAACAACCCGACCCAGCC 3’。以下简称为荧光定量PCR引物对2，其在结核分枝杆菌基因组中的位置如图12所示。可见其完全互补区域位于基因的上下游区域，不与阅读框内任何序列匹配。检测时米用TaKaRa 公司生产的 MightyAmp for Real Time (SYBR Plus)试剂盒。扩增体系20 μι，其中MIX加10 μ ，上下游引物各加O. 5 μ ，模板加入2μ ，补水至总体积20 μ 。根据ABI公司的仪器说明书，设定反应程序及熔点曲线分析程序。反应条件98°C预变性2 min;98°C变性10 s，68°C退火60 s，85°C采集荧光，35个循环。典型的PCR扩增曲线如图13所示。3.采用与实施例I中步骤4相同的体外表达引物对I和PCR反应条件，对于本实施例步骤2中的阳性扩增产物，再次进行PCR，添加与实施例I中同样的体外表达原件并采用与实施例I中步骤4相同的方法对产物进行浓缩。4.采用Nanodrop微量分光光度计测定回收产物的浓度。一般浓度应达到800 ng/μ L-1000 ng/μ L，回收产物在波长260 nm和280 nm处的吸光比值A260/A280在I. 70-1. 85范围内。5.采用RTS 100 Wheat germ CECF Kit小麦胚芽体外无细胞表达试剂盒，将上步获得的PCR产物加入到体外表达溶液和体系中，表达吡嗪酰胺酶。把反应体系置于恒温混匀仪中，24 0C, 9000 r/min，反应10-20 h ;反应体系见表I。6.采用与实施例I中同样的方法，通过在吡嗪酰胺酶作用下，吡嗪酰胺降解为吡嗪酸后，能与亚铁离子反应生成棕红色产物的反应分别测定表达的吡嗪酰胺酶活性。体外表达反应结束后，取20 μ L反应混合液加入150 μ L 10 mg/mL的吡嗪酰胺(PZA)中，37°C孵育3 h。然后加入10 UL 10% (W/V)硫酸亚铁铵，显色。实验的结果通过分光光度计测定460 nm处吸光值区分。从图14中，可以看出标准敏感株H37Ra的0D460值较高，说明从^pncA基因表达的吡嗪酰胺酶活性高，能是吡嗪酰胺发挥疗效。而标准耐药株BCG的0D460值较低，反应后颜色为无色或者很淡的红棕色，说明从其基因表达的吡嗪酰胺酶活性基本没有或者低，吡嗪酰胺不能发挥疗效，表现为耐药。本实施例说明本检测方法对于荧光定量PCR引物具有较大兼容性，只要引物具有不与吡嗪酰胺酶基因(Md)阅读框内任何序列完全匹配及所得PCR产物含有全长基因的特征，可根据实验需要合理设计引物，不影响吡嗪酰胺耐药检测结果。实施例6:
本发明包括有荧光定量PCR检测以及吡嗪酰胺酶体外表达测定酶活两部分，吡嗪酰胺酶体外表达测定酶活除了用在如上述实施例1-5中所述的用于吡嗪酰胺耐药性检测外，还可以起一个辅助功能，用于对荧光定量PCR阳性扩增产物进行验证是否含有结核分枝杆菌全长基因。对于非特异的荧光定量PCR阳性扩增，由于产物不含有结核分枝杆菌的基因，将不能测到吡嗪酰胺酶活性，从而可以排除一部分的可能非特异阳性扩增，提高荧光定量PCR检测痰液中结核分枝杆菌的特异性。本实施例采用实施例5中使用的荧光定量PCR正向引物2和反向引物2，不加入结核分枝杆菌DNA模板，进行45个循环来产生弓I物二聚合体，将该引物二聚体用于验证通过吡嗪酰胺酶体外表达测定酶活能否识别该不含有PncA基因的荧光定量PCR产物。具体步骤如下 I.采用与实施例5中同样的荧光定量PCR正向引物2和反向引物2 :
定量 PCR 正向引物 2 :5’ GGCGTCATGGACCCTATATCTGTGG3’ ；
定量 PCR 反向引物 2 :5’ CGGTGAACAACCCGACCCAGCC 3’。不加入任何模板，进行PCR扩增反应，PCR反应时采用TaKaRa公司生产的MightyAmp for Real Time (SYBR Plus)试剂盒。扩增体系 20 μ ，其中 MIX 加 10 μ ,上下游引物各加0.5 μ ，补水至总体积20 μ 。根据ABI公司的仪器说明书，设定反应程序及熔点曲线分析程序。反应条件98°C预变性2 min;98°C变性10 s，68°C退火60 s，85°C采集荧光，45个循环。3.采用与实施例I中步骤4相同的体外表达引物和PCR反应条件，对于本实施例步骤2中的扩增产物，再次进行PCR，添加与实施例I中同样的体外表达原件并采用与实施例I中步骤4相同的方法对产物进行浓缩。4.采用Nanodrop微量分光光度计测定回收产物的浓度。一般浓度应达到800 ng/μ L-1000 ng/μ L，回收产物在波长260 nm和280 nm处的吸光比值A260/A280在I. 70-1. 85范围内。5.采用RTS 100 Wheat germ CECF Kit小麦胚芽体外无细胞表达试剂盒，将上步获得的PCR产物加入到体外表达溶液和体系中，表达吡嗪酰胺酶。同时设一个不加入任何D N A小麦胚芽无细胞表达系统溶液作为对照。反应体系置于恒温混匀仪中，24 °C,9000r/min,反应10-20 h ;反应体系见表I。6.采用与实施例I中同样的方法，通过在吡嗪酰胺酶作用下，吡嗪酰胺降解为吡嗪酸后，能与亚铁离子反应生成棕红色产物的反应分别测定表达的吡嗪酰胺酶活性。体外表达反应结束后，取20 μ L反应混合液加入150 μ L 10 mg/mL的吡嗪酰胺(PZA)中，37°C孵育3 h。然后加入10 UL 10% (W/V)硫酸亚铁铵，显色。实验的结果通过分光光度计测定460 nm处吸光值。如图15所示，加入有DNA的反应混合液与不加入任何DNA的空白反应混合液对照相比，吸光值没有差别。说明荧光定量PCR产物中不含有全长的基因，判断为非特异扩增，由于本实施例中加入的是引物二聚体，很显然证明该结果是正确的。本实施例说明采用体外表达吡嗪酰胺酶，其酶活的测定可以进一步辅助鉴定荧光定量PCR产物是否为含有全长的基因。由于有机整合了一个鉴定步骤，能排除荧光定量PCR的非特异性扩增结果，提高了结核分枝杆菌检测的特异性。附表 表I
权利要求
1.一种临床样本中结核分枝杆菌荧光定量及吡嗪酰胺耐药性联合检测的方法，其特征是通过荧光定量PCR扩增含有全长基因的结核分枝杆菌基因组片段来检测临床样本中是否含有结核分枝杆菌，所述基因为结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶基因，如果出现阳性扩增就证明临床样本中含有结核分枝杆菌，则对其吡嗪酰胺耐药性进行检测；检测时，以荧光定量PCR的产物为模板，采用含有体外表达元件的引物，再次进行PCR扩增全长基因，添加表达所需要的元件；然后将扩增的PCR产物加入到体外表达系统中，测定所表达的吡嗪酰胺酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酰胺酸的酶活性；所测得的酶活性，一方面作为辅助验证荧光定量PCR产物是否含有全长基因，另一方面与采用同样方法表达和测定的结核分枝杆菌标准株吡嗪酰胺酶活性进行比较，据此得知临床样本中结核分枝杆菌是否发生了耐药突变，实现对其吡嗪酰胺耐药性的检测。
2.根据权利要求I所述的临床样本中结核分枝杆菌荧光定量及其吡嗪酰胺耐药性联合检测的方法，其特征是该方法包括以下的步骤(1)提取和裂解临床样本中结核分枝杆菌的DNA，作为以下PCR检测的模板；(2)根据/wd，GenBank序列号为U59967所述的结核分枝杆菌基因组中吡嗪酰胺酶基因及其上下游序列的特征，设计特异引物，所采用的引物具有不与基因阅读框内任何序列完全匹配及所得PCR产物含有全长基因的特征，通过荧光定量PCR扩增含有全长 PncA基因的结核分枝杆菌基因组片段来检测临床样本中是否含有结核分枝杆菌；(3)对于步骤(2)中检测到有结核分枝杆菌的样本，采用设计的含有体外表达元件的引物，所采用的引物具有不与/7/^基因阅读框内除起始密码子ATG以外的任何序列完全匹配及所得PCR产物含有全长基因的特征，以步骤(2)中获得的荧光定量PCR产物为模板， 再次进行PCR扩增含有全长基因的片段，为基因添加表达元件，使得无细胞体外表达系统能够对加入的PCR产物进行吡嗪酰胺酶的表达；(4)浓缩步骤(3)中获得的PCR产物并定量；(5)加入I 20微克的步骤(4)中获得的PCR产物，采用无细胞体外表达系统表达吡嗪酰胺酶，根据需要选择表达时间I到24小时；(6)取I 50微升表达吡嗪酰胺酶后的体外表达系统液，测定其中所含有的吡嗪酰胺酶的活性；一方面通过与同样条件下空白对照体外表达液测得的酶活结果比较，判断荧光定量PCR扩增产物是否含有结核分枝杆菌全长pncA片段，另一方面通过与同样方法表达标准吡嗪酰胺敏感菌株和耐药菌株/7/ ^基因的吡嗪酰胺酶活性进行比较，判断样本中结核分枝杆菌的Md基因是否发生了耐药突变，实现对其吡嗪酰胺耐药性的检测。
3.根据权利要求2所述的临床样本中结核分枝杆菌荧光定量及其吡嗪酰胺耐药性联合检测的方法，其特征在于步骤(2 )所述特异弓I物序列为定量 PCR 正向引物 I :5’ CGGACGGATTTGTCGCTCAC 3’，定量 PCR 反向引物 I :5’ GCCCGATGAAGGTGTCGTAGAAG 3’，定量 PCR 正向引物 2 :5’ GGCGTCATGGACCCTATATCTGTGG3’，定量 PCR 反向引物 2 :5’ CGGTGAACAACCCGACCCAGCC 3’ ；体外表达正向引物 I : 5’TAATACGACTCACTATAGGATACTCCCCCACAACAGCTTA CAATACTCCC CCACACAGCTTACAAATACTCCCCCAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT 3’ ，体外表达反向引物 I : 5’ ACCGCCGCCAACAGTTCATCCCGGT3’，体外表达正向引物 2 :5’TAATACGACTCACTATAGGAGTCGCCCGAACGTAAGGAG GACGT 3’ ；体外表达反向引物 2:5’ ACCGCCGCCAACAGTTCATCCCGGT3’ ；体外表达正向引物 3 :5’TAATACGACTCACTATAGGAAGGAGATAATGCATCATCATCAT CATCACAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT 3，；体外表达反向引物 3 :5’ ACCGCCGCCAACAGTTCATCCCGGT3’。
4.根据权利要求2所述的临床样本中结核分枝杆菌荧光定量及其吡嗪酰胺耐药性联合检测的方法，其特征在于步骤(3)中添加的体外表达元件采用启动子，或者采用启动子和表达增强子；所述的启动子的引物序列为5’ TAATACGACTCACTATAGG 3’，所述的表达增强子的引物序列为5’ ATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGCTTACAAATACTCCCCC 3’ 。
5.根据权利要求2所述的临床样本中结核分枝杆菌荧光定量及其吡嗪酰胺耐药性联合检测的方法，其特征在于步骤(3)-步骤(6)中所述的体外表达系统为包括小麦胚芽体外表达系统和大肠杆菌体外表达系统常见的体外无细胞表达系统。
6.根据权利要求2所述的临床样本中结核分枝杆菌荧光定量及其吡嗪酰胺耐药性联合检测的方法，其特征在于步骤(6)中判断荧光定量PCR扩增产物是否含有结核分枝杆菌全长片段的方法为以同样条件和方法下不加入任何DNA表达后的空白体外表达液中所测得的吡嗪酰胺酶酶活加上三倍的同样方法和条件下多次测定其酶活结果标准偏差作为临界值，所测得的样本酶活低于或等于该临界值判断为荧光定量PCR扩增产物不含有结核分枝杆菌全长片段，荧光定量PCR检测结果为假阳性；所测得的样本酶活高于该临界值的判断为荧光定量PCR扩增产物含有结核分枝杆菌全长/7/ ^片段，荧光定量PCR检测结果验证为阳性。
7.根据权利要求2所述的临床样本中结核分枝杆菌荧光定量及其吡嗪酰胺耐药性联合检测的方法，其特征在于步骤(6)中判断样本中结核分枝杆菌的Md基因是否发生了耐药突变使用的方法为以同样方法和条件下结核分枝杆菌标准吡嗪酰胺敏感株中基因表达的吡嗪酰胺酶酶活减去三倍的多次表达其酶活测定结果标准偏差作为临界值，所测得的样本酶活低于该临界值判断为吡嗪酰胺耐药，高于或者等于该临界值的为吡嗪酰胺敏感。
8.根据权利要求I所述的临床样本中结核分枝杆菌荧光定量及其吡嗪酰胺耐药性联合检测的方法，其特征在于以吡嗪酰胺耐药性检测过程中，体外表达液中含有的吡嗪酰胺酶活性，作为辅助验证荧光定量PCR产物是否含有全长基因，排除荧光定量PCR的非特异性扩增，提高临床样本中结核分枝杆菌PCR检测的特异性。
9.权利要求I至8中任一权利要求所述联合检测方法的应用，其特征在于该方法用于结核分枝杆菌及其耐药性的检测，应用时无需细菌培养和DNA序列测定仪。
全文摘要
本发明涉及临床样本中结核分枝杆菌及其吡嗪酰胺耐药性的联合检测方法，步骤是A、提取样本中的DNA；B、通过荧光定量PCR扩增含有全长吡嗪酰胺酶基因(pncA)的结核基因组片段来检测结核分枝杆菌；C、对结核分枝杆菌阳性样本，进行吡嗪酰胺耐药性的检测；吡嗪酰胺耐药性检测的步骤为1.以荧光定量PCR产物为模板再进行一次PCR反应添加体外表达元件；2、将此PCR产物加入到无细胞表达系统中，表达吡嗪酰胺酶；3、通过该样本与标准菌株的吡嗪酰胺酶活性对比，给出吡嗪酰胺耐药性结果。本发明将荧光定量PCR扩增全长pncA基因结合体外表达的吡嗪酰胺酶酶活性，实现了样本中结核分枝杆菌及其吡嗪酰胺耐药性的联合检测,无需细菌培养和DNA测序仪。
文档编号C12Q1/04GK102925554SQ20121034518
公开日2013年2月13日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者危宏平, 李恒, 周满, 耿学磊, 王殿冰, 余军平, 张先恩 申请人:中国科学院武汉病毒研究所