专利名称：一种含g2a基因的重组质粒及构建方法
技术领域：
本发明属于真核表达载体构建领域，尤其涉及一种含G2A基因的重组质粒及构建方法。
背景技术：
孤儿G蛋白偶联受体(G2A, for G2 accumulation)是G蛋白偶联受体家族，OGRl亚家族(包括0GR1，G2A, TDAG8, GPR4)成员之一，因其能够诱导细胞停滞在G2/M期，并修复受损的DNA而得名。G2A在人类基因库RPCI-Il片段40119-35358碱基位点，编码382个氨基酸肽链，具有高度保守结构，七个疏水结构组成跨膜α螺旋(ΤΜ1-ΤΜ7)。Weng Z等1998 年鉴定得到在前B细胞和成纤维细胞G2/M检验点积累的G2A可以通过减弱BCR-ABL的转变能力来发挥抑制细胞增殖的作用，而敲除G2A基因的小鼠则表现出系统性红斑狼疮和动脉粥样硬化病变。现在普遍认为动脉粥样硬化与氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)的吞噬、泡沫细胞的形成和相关细胞信号转导作用下单核细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的反应有密切关系。溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine, LPC)作为ox-LDL的主要脂质成分，已经有研究表明它可以与G2A高亲和力结合，介导细胞迁移，并作为分子伴侣协助G2A的表达。此外，动脉硬化病灶部位为酸性微环境，Murakami等报道，G2A的过表达在酸性环境下可导致肌醇磷酸的产生，而G2A的质子感知能力为LPC所拮抗。为进一步研究G2A怎样介导动脉粥样硬化等炎症反应，探究其质子感知特性，现有技术需要克隆G2A基因并构建真核表达载体，为下一步考察其下游细胞应答奠定基础。
发明内容
本发明提供了一种供研究G2A介导动脉粥样硬化等炎症反应并探究其质子感知特性的含有G2A基因的重组质粒。本发明的另外一个目的是提供了构建含有G2A基因的重组质粒的方法。概括的说，本发明设计了一对针对G2A基因的引物，从人脐静脉内皮细胞提取总RNA，反转录获得的cDNA中克隆不含终止密码子的G2A基因并亚克隆到pMD_19T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体PEGFP-N3用Hind III和BamH I双酶切回收后连接获得阳性重组质粒PEGFP-N3-G2A，并测序鉴定；重组载体以lipofectamine2000介导转染293T细胞。Real time PCR法检测外源基因在293T细胞中的表达。下面具体的说明本发明的详细技术方案
本发明的含G2A基因的重组质粒，其包括载体片段PEGFP-N3和基因片段G2A。本发明的G2A基因片段(不含终止密码子)来自人脐静脉内皮细胞(HUVECs )提取总RNA，反转录获得的cDNA中PCR扩增得到的；载体片段pEGFP_N3来自质粒pEGFP_N3。本发明的含G2A基因的重组质粒的构建方法包括如下步骤
(1)PCR扩增获得G2A基因；
(2)将含有pEGFP-N3片段的载体与步骤(I)获得的含G2A基因的PCR产物酶切后连
接;
(3)将步骤(2)获得的连接产物转化受体菌；(4)检测外源基因在293T细胞中的表达。。进一步的说，步骤(I)包含通过PCR从HUVECs总RNA反转录得到的cDNA中获得G2A基因；
进一步的说，步骤(I)中的PCR扩增中使用PCR引物5’ -AAGCTTATGTGCCCAATGCTACTGA
A-3’
和 5’-GGATCCGCAGGACTCCTCAATCAGCC-3’ 。进一步的说，步骤(2)中所述含有pEGFP-N3的载体为质粒pEGFP_N3。进一步的说，步骤(2)中采用Η η III和I酶对含有pEGFP_N3片段的载体与 步骤(I)获得的含G2A的基因的PCR产物进行酶切。进一步的说，步骤(4)中所述检测方法为Real time PCR法。 本发明的有益效果在于LPC作为胞外配体能够活化G2A，激活免疫细胞内信号转导，调节T淋巴细胞、B淋巴细胞和单核巨噬细胞的迁移和增殖，而LPC拮抗G2A的质子感知能力具有浓度依赖性。为了详细研究G2A在酸性刺激下的细胞应答，本发明克隆了 G2A基因并构建了真核表达载体pEGFP-N3-G2A质粒，用脂质体介导瞬时转染293T细胞；本发明发现293T细胞具有极低量的G2A基础表达。转染pEGFP-N3-G2A后，293T细胞中G2A mRNA表达量显著增加，能够满足于进一步的实验需要。本发明成功克隆了 G2A基因并构建了带有G2A基因的真核表达质粒PEGFP-N3-G2A,高效转染293T细胞并检测到G2A基因的表达，为下一步研究其质子感知后的信号通路奠定了基础。
图1、G2A基因的PCR扩增
图中，M表示DNA标准DL2000 ;1、2、3、4表示G2A基因扩增产物；
图2. pMD-19T-G2A的双酶切鉴定
图中，M 表示 DNA 标准 Bio Marker III ;l、pMD-19T_G2A 的 Hind III和 BamH I 双酶切产物；2、阴性对照pMD-19T的Hind III和BamH I双酶切产物；
图3. pEGFP-N3-G2A的双酶切鉴定
图中，M表示 DNA 标准 IKbp DNA ladder Marker;l、pEGFP-N3-G2A的Hindm和BamH I双酶切产物；2、阴性对照pEGFP-N3的Hind III和BamH I双酶切产物；
图 4. pEGFP-N3-G2A 表达框
图中,pUC ori为pUC复制起始位点；Kan r/Neo r卡那霉素抗性基因/新霉素抗性基因；fl ori为fl复制起始位点；HSV-tk单纯疱疹病毒胸苷激酶基因；CMV IE为启动子；Hind III和BamH I为限制性内切酶；EGFP蛋白表达基因；
图5. G2A特异性定量引物PCR
图中，M表示DNA标准DL500Marker; I、G2A定量弓I物PCR产物(239bp )
图6. GAPDH特异性定量引物PCR产物
图中，M表示DNA标准DL500Marker; I、GAPDH定量弓I物PCR产物(135bp )；
图7.转染293T细胞中G2A基因表达检测
图中，Blank为未转染细胞；pEGFP-N3为转染空载体的细胞；pEGFP-N3_G2A为转染G2A表达载体的细胞；图 8· 293Τ 细胞转染 pEGFP-N3 和 pEGFP_N3_G2A 图片(100 X)
图中，
(A)普通光下观察转染pEGFP-N3载体的293T细胞照片(100X)；
(B)荧光下观察转染pEGFP-N3载体的293T细胞照片(100X)；
(C)普通光下观察转染pEGFP-N3-G2A载体的293T细胞照片(100X)；
(D)荧光下观察转染pEGFP-N3-G2A载体的293T细胞照片(100X)。
具体实施例方式 实施例I含G2A基因的重组质粒的构建方法
I、材料
1.I主要试剂
限制性内切酶 BamW I , Hind IIL DNAase I ；
T4-DNA 连接酶(MBI, Fermentas)；
TransStart Taq DNA Polymerase (北京全式金生物技术有限公司); dNTPs(IOmM) (Takara)；
总RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒(上海生工生物有限公司)； 无支原体新生牛血清(四季青)；
DMEM高糖(Gibco公司);
胰酶(Hyclone公司)；
脂质体 Lipofectamine 2000 (Invitrigen)；
DNA marker (bioFLUX)；
反转录试剂盒(北京全式金)；
荧光定量试剂盒(Takara)；
其它试剂均为国产分析纯。I. 2质粒和细胞 pMD_19T 载体(Takara)；
PEGFP-N3 (Clontech)；
293T细胞(内蒙古大学生命科学学院)；
DH5a大肠杆菌感受态细胞(内蒙古大学生命科学学院)。2.方法
2.I G2A基因的克隆
以从HUVECs中提取的总RNA反转录得到的cDNA为模版，用primer 5软件设计引物，弓 I物两端设计 Η η III和 BamA I 酶切位点，序列如下 Pl: 5’ -AAGCTTATGTGCCCAATGCTACTGAA-3’； P2:5，-GGATCCGCAGGACTCCTCAATCAGCC-3，(上海生工生物有限公司合成)；扩增长度1152bp。PCR 反应体系P1 (IOmM) lml，P2 (IOmM) lml，双蒸水 40. 5ml，IOXTransStart TaqBuffer (Mg2+) 5ml, dNTPs (IOmM) lml, TransStart Taq DNA Polymerase 0.5ml,模板 lml。反应条件94°C预变性5min 后，94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin20s，循环5次后，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin20s，循环25次，最后再于72°C延伸lOmin。扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，纯化回收PCR产物，回收产物与pMD_19T载体连接，连接产物转化DH5 α大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆(pMD-19T-G2A)送测序。2. 2构建表达载体
用历·/ (! III和及I双酶切pMD-19T-G2A与pEGFP_N3，酶切产物回收后用T4-DNA连接酶在16°C连接过夜，连接产物转化DH5 α大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆酶切鉴定，送测序；获得PEGFP-N3-G2A表达载体。2. 3瞬时转染293Τ细胞
293Τ细胞培养在含10%无支原体新生牛血清的DMEM培养基中，胰酶消化制成单细胞悬液，以2Χ IO5个/孔接种于6孔板，每板接种提取pEGFP-N3和pEGFP_N3_G2A质粒并纯化。NanoDrop核酸蛋白测定仪ndlOOO测定质粒浓度和纯度。分别转染293T细胞。24 h后观、察荧光照相，36h提取细胞总RNA。2.4 Real time PCR检测目的基因的表达
收集未转染及转染上述2种质粒的293T细胞，总RNA提取试剂盒提取各组细胞的总RNA，用DNAase I去除DNA，NanoDrop核酸蛋白测定仪ndlOOO检测A260以计算RNA的浓度。用反转录试剂盒反转录成cDNA。SYBR Premix Ex Taq TaKaRa试剂盒荧光定量PCR检测目的基因在各组细胞的表达.所用引物如下G2A检测引物，G2A-F:5’-CCTGGTTCTCCTCGTCAAAGC-3’ ；G2A_R:5’ -TGAGCCTGGTGACGTCTGTCTT-3’ ；产物长度 239bp ;以 GAPDH 为内参，GAPDH-F:5，-TCAAGTGGGGCGATGCTGGC-3，；
GAPDH-R:5’ -TGGGGGCATCAGCAGAGGGG-3’，产物长度 135bp ;反应体系2XSYBR PremixEx Taq 12. 5 μ 1，上下游引物各(IOmM) 1μ l，cDNA 115ng，补双蒸水至25 μ I。反应条件95°C预变性 30s ;95°C变性 5s，60°C (G2A)和 60°C (GAPDH)退火 30s，72°C延伸 30s，循环40次；最后再于72°C延伸IOmin ;做溶解曲线。每个反应有3次重复。2. 5统计学分析
采用GraphPad Prism 5统计学软件one-way ANOVA进行数据处理分析数据以均数依标准差(X— 土 S)表示，两组间比较采用t检验，检验水准P〈0. 05。3 结果
3.I编码区片段的克隆与序列测定
用引物P1、P2以从HUVECs中提取的总RNA反转录得到的cDNA为模版扩增得到与预期片段大小相符的特异性片段结果(图I)。回收的PCR产物与pMD-19T载体连接成的重组质粒。pMD-19T-G2A经历idIII和及I双酶切鉴定正确结果(图2)。序列测定结果表明，扩增出的DNA片段长1152bp，包含了不含终止密码子的ORF 1140bpo与已知的NCBI genebank 人 G2A 序列(NM_013345. 2)完全一致。3. 2表达载体pEGFP-N3-G2A的构建
获得的重组质粒PMD-19T-G2A和表达载体质粒pEGFP-N3(4. 7kb)经历/ d III和I双酶切，将G2A (1152bp)片段与pEGFP-N3连接，得到的表达载体pEGFP_N3_G2A。经历/ d III和及I双酶切鉴定符合预期结果(图3)，测序结果与已知的NCBI gene bank人G2A序列(NM_013345. 2)完全一致。G2A基因真核表达载体pEGFP_N3_G2A表达框的构建见(图4)。3. 3荧光定量PCR特异性引物的鉴定
引物G2A-F/R和GAPDH-F/R以cDNA为模板扩增得到与预期片段大小相符的特异性片段(图5;图6)序列测定结果表明,扩增出的片段与与已知的NCBI gene bank序列人G2A序列(NM_013345. 2)目的片段(239bp)和 GAPDH 基因(NM_002046. 3)目的片段(135bp)完
全一致。3. 4荧光定量PCR检测G2A基因在293T细胞中的表达
使用G2A定量引物及GAPDH定量引物，以GAPDH为内参基因，分别提取未转染细胞、转染空载体(PEGFP-N3)细胞和转染pEGFP-N3-G2A载体细胞的总RNA，去除DNA后，反转录为cDNA并以此为模板，荧光定量PCR检测G2A基因的表达，检测到G2A基因表达水平较未转染的细胞提高153倍(图7)。3. 5瞬时转染pEGFP-N3和pEGFP_N3_G2A到293T细胞的荧光检测
PEGFP-N3和pEGFP-N3-G2A转染293T细胞24 h后观察荧光(图8)，统计阳性细胞，转 染率约为80%。因为G2A基因与EGFP基因是融合表达，荧光检测同时也说明了 G2A基因已经在蛋白水平表达，转基因细胞构建成功。
权利要求
1.一种含G2A基因的重组质粒，其特征在于，包括载体片段PEGFP-N3和基因片段G2A。
2.如权利要求I所述的重组质粒，所述基因片段G2A是从人脐静脉内皮细胞提取总 RNA,反转录获得的cDNA中PCR扩增得到的。
3.如权利要求I所述的重组质粒，所述载体片段PEGFP-N3来自质粒pEGFP_N3。
4.如权利要求1-3所述的任一含G2A基因的重组质粒的构建方法，其特征在于包括如下步骤1)PCR扩增获得G2A基因；2)将含有pEGFP-N3片段的载体与步骤I)获得的含G2A基因的PCR产物酶切后连接；3)将步骤2)获得的连接产物转染293T细胞；4)检测外源基因在293T细胞中的表达。
5.如权利要求4所述的含G2A基因的重组质粒的构建方法，其特征在于步骤I)包含通过PCR从人脐静脉内皮细胞提取总RNA，反转录获得的cDNA中扩增得到G2A基因。
6.如权利要求5所述的含G2A基因的重组质粒的构建方法，其特征在于步骤I)中的 PCR 扩增中使用 PCR 引物 5’ -AAGCTTATGTGCCCAATGCTACTGAA-3’ 和 5’ -GGATCCGCAGGACTCCTC AATCAGCC-3，。
7.如权利要求4所述的含G2A基因的重组质粒的构建方法，其特征在于步骤2)中所述含有pEGFP-N3的载体为质粒pEGFP-N3。
8.如权利要求4所述的含G2A基因的重组质粒的构建方法，其特征在于步骤2)中采用 Hind III和汉I酶对含有pEGFP_N3片段的载体与步骤I)获得的含G2A的基因的PCR产物进行酶切。
9.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于步骤4)中所述检测方法为Realtime PCR 法。
全文摘要
本发明涉及一种含G2A基因的重组质粒，包括载体片段pEGFP-N3和基因片段G2A，该重组质粒的构建方法为首先PCR扩增获得G2A基因；再将含有pEGFP-N3片段的载体与上步获得的含G2A基因的PCR产物酶切后连接；将连接产物转化受体菌；最后鉴定阳性克隆，获得pEGFP-N3-G2A连接产物。本发明成功克隆了G2A基因并构建了带有G2A基因的真核表达质粒pEGFP-N3-G2A，高效转染293T细胞并检测到G2A基因的表达，为研究G2A怎样介导动脉粥样硬化等炎症反应并探究其质子感知特性奠定了基础。
文档编号C12N15/63GK102703485SQ20121019724
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者冯文利, 木其日, 杨德志, 阿拉坦高勒, 黄旭东 申请人:阿拉坦高勒