专利名称：抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂。
背景技术：
亮氨酸氨基肽酶(Leucineaminopeptidase, LAP, EC 3. 4. 11. I)是一种蛋白分解酶，能水解肽链N端并由亮氨酸与其他氨基酸形成肽键的酶，广泛分布于肝、胰、肾等组织中。当人体肝、胆、胰等组织有病变时，均可出现血清LAP水平升高。测定血清亮氨酸氨基转肽酶可作为肝病诊断的又一项指标，对淤胆性肝炎的鉴别诊断、肝道梗阻及胰腺癌的诊断有价值。LAP不像其他肝功的酶，只能检测血液样本，LAP还可以检测尿液。在一些病例中可以检测尿液中LAP的变化，而不必采血。其肝癌的检出阳性率较ADA (腺苷脱氨酶)高， 比GGT (谷酰转肽酶)反映肝脏疾病更加灵敏。LAP的检测也可早期反映肾损害的性质和程度，并为临床鉴别肾小球、肾小管损伤提供可能的帮助；其亦可作为妊娠合并ICP及孕妇和胎儿健康情况动态监测的一项有效指标。目前，LAP的检测方法是样本中的LAP经催化水解底物L-亮氨-P-硝基苯胺，生成亮氨酸和对硝基苯胺，反应系统在405nm处吸光度上升，通过检测其上升的速率即可得出样本中LAP的活性。而在日常工作中，为缩短样本周转时间和防止仪器样品针被堵，不少医院使用肝素锂或肝素钠抗凝管采集常规生化项目血样本。由于肝素在LAP催化反应过程中起类似加速剂的作用，使得检测结果假性增高，所以实验室测定LAP浓度只能用血清，而肝癌肝硬化患者分离血清需要时间长，不能满足临床对检验结果的快速回报要求，这给实验室及临床工作带来许多不便。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，提供一种具有良好的抗肝素干扰性能和良好的稳定性，能完全满足临床检验要求的抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂。为了解决上述问题，本发明采用的技术方案为一种抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂，该试剂由试剂I和试剂2组成，其中试剂I、试剂2中的各组分及组分浓度范围为试剂I :缓冲液(ρΗ7·0-8. 5) 50-500 mmol/L抗干扰剂1-100 ml/L防腐剂O. 1-100 g/L ；试剂2:缓冲液(pH 3. 0-6. O) 50-500 mmol/'LL_亮氨酰-矿硝酰基苯胺 1-100 mmol/L稳定剂1-100 g/L
防腐剂O. 1-100 g/L ο本发明上述的试剂可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以制成液体试剂，直接使用；上述试剂的配置均采用行业常规技术。其中所述缓冲液可以是磷酸缓冲液、三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪一 N’ -2-乙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N，N-双(2-羟基乙烷磺酸)缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-(N-吗啡啉)乙磺酸钠缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-4-丁磺酸缓冲液、3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-I-丙磺酸缓冲液、4- (2-羟乙基)-I-哌嗪丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-1_丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液，柠檬酸一柠檬酸三钠缓冲液、咪唑缓冲液、醋酸一醋酸钠缓冲液，2-吗啉乙磺酸缓冲液中的一种或几种。所述防腐剂选白山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、叠氮钠、proc I in系列防腐剂(如Proclin300)中的一种或几种。
所述稳定剂选自聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA(牛血清白蛋白)中的一种或者几种。所述的抗干扰剂，优选非离子表面活性剂，为更优选地，所述非离子表面活性剂选白 TffEEN 系列(如 Tween2O)、SPAN 系列(如 Span-80)、TRITON 系列(如 TritonX-100)中的一种。本发明的突出实质性特点及显著进步主要表现在(I)本发明的试剂为双试剂，通过试剂I中的抗干扰剂先将样本中的肝素干扰效应去除，再加入试剂2进行反应，因此本发明试剂具有良好的抗肝素干扰性能。(2)本发明的试剂通过加入选定的稳定剂，使得试剂具有良好的稳定性本发明试剂盒2-8°C避光保存至少稳定12个月，能完全满足临床检验要求。
具体实施例方式下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明作出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下述试剂的配置方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。实施例I :试剂I :三羟甲基氨基缓冲液(pH 7.0) 50mmol/LTween 205ml/L叠氮钠0· I g/L ；
试剂2 2-吗啉乙磺酸缓冲液(pH 4· O) IOOmmoI/LL-売氛酸-p-硝酸基苯胺2mmol/L蔗糖5g/L叠氮钠O. I g/L。试剂I和试剂2可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以制成液体试齐U，直接使用；实施例2 试剂I :
N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液(pH 8.0) IOOmmoI/LSpan-8010ml/L山梨酸钾I g/L ；试剂2 醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 3.0) IOOmmoI/LL-亮氨酰-p-硝酰基苯胺5mmol/LBSA2g/L叠氮钠O. I g/L。试剂I和试剂2可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以制成液体试齐U，直接使用；实施例3 试剂I :N-(2-羟乙基)哌嗪-N’ -4- 丁磺酸缓冲液(pH 8. 5) 500mmol/LTriton X-10020ml/LProclin300lg/L ；试剂2 咪唑缓冲液(pH6. 0) lOOmmol/LL_売氛酸-p-硝酸基苯胺 20mmol/L山梨醇5g/LProclin300 0. lg/L。试剂I和试剂2可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以制成液体试齐U，直接使用；本发明试剂盒测定样本中的LAP的测试条件如下温度30-37°C ；比色杯光径为I. 0cm。检测主波长405nm。应用本发明LAP测定试剂盒测定样本中LAP的方法如下样品(校准管以校准品做样品)加Rl混匀，30-37°C孵育3-5min后，立即加入R2混匀，30-37°C反应2min后，连续检测3min，计算ΛΑ/min。其中样本用量15μ 1，试剂I用量240 μ 1，试剂2用量60 μ I。本发明试剂盒测定样本中LAP含量按以下公式进行计算
权利要求
1.一种抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂，其特征在于该试剂由试剂I和试剂2组成，其中试剂I、试剂2中的各组分及组分浓度范围为 试剂I : 缓冲液(pH 7. 0 8. 5) 50-500mmol/L 抗干扰剂l-100ml/L 防腐剂0. l-100g/L ； 试剂2 缓冲液(pH 3. 0-6.0) 50-500 mmol/L L-亮氨酰■硝酰基苯胺 1-100 mmol/L 稳定剂1-100 g/L 防腐剂0. 1-100 g/L。
2.根据权利要求I所述的抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂，其特征在于所述的抗干扰剂为非离子表面活性剤。
3.根据权利要求2所述的抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂，其特征在于所述的非离子表面活性剂为TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列中的ー种。
4.根据权利要求I所述的抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶測定试剂，其特征在于所述缓冲液为磷酸缓冲液、三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、N-2-羟こ基哌嗪-N’ -2-こ磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基こ磺酸缓冲液、哌嗪-N，N-双(2-羟基こ烷磺酸)缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-(N-吗啡啉)こ磺酸钠缓冲液、4- (2-羟こ基)哌嗪-1-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-(2-羟こ基)哌嗪-N’ -4- 丁磺酸缓冲液、3-双(2-羟こ基)氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-I-丙磺酸缓冲液、4-(2-羟こ基)-1-哌嗪丙磺酸缓冲液、3_(环己胺)-1_丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液，柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、咪唑缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液，2-吗啉こ磺酸缓冲液中的ー种或几种。
5.根据权利要求I所述的抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂，其特征在于所述防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、叠氮钠、proclin系列防腐剂中的ー种或几种。
6.根据权利要求I所述的抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂，其特征在于所述稳定剂为聚こニ醇、丙三醇、丙ニ醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA中的一种或者几种。
全文摘要
本发明公开一种抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂，该试剂由试剂1和试剂2组成，其中试剂1、试剂2中的各组分及组分浓度范围为试剂1缓冲液(pH 7.0~8.5)50-500mmol/L，抗干扰剂1-100ml/L，防腐剂0.1-100g/L；试剂2缓冲液(pH 3.0-6.0)50-500mmol/L，L-亮氨酰-p-硝酰基苯胺1-100mmol/L，稳定剂1-100g/L，防腐剂0.1-100g/L。本发明具有良好的抗肝素干扰性能和良好的稳定性，能完全满足临床检验要求的优点。
文档编号C12Q1/37GK102864206SQ20121033511
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者邹炳德, 邹继华, 沃燕波 申请人:宁波美康生物科技股份有限公司