硫酯酶以及使用其的脂肪酸或脂质的制造方法

专利名称：硫酯酶以及使用其的脂肪酸或脂质的制造方法
技术领域：
本发明涉及新型硫酯酶以及编码该硫酯酶的基因。另外，本发明涉及含有该硫酯酶基因的转化子以及使用该硫酯酶的脂肪酸或脂质的制造方法。
背景技术：
脂肪酸是脂质的I个主要构成成分，在生物体内与甘油进行酯结合构成三酰基甘油等脂质，在较多动植物中作为能量源被储藏利用的物质。在动植物内积蓄的脂肪酸或脂质作为食用或工业用受到广泛地利用，例如，单酰基甘油、二酰基甘油等被利用作食品的中间原料，其它各种工业产品的添加剂、中间原料。另外，还原碳原子数为12 18左右的高级脂肪酸所得到的高级醇的衍生物可以用作表面活性剂。例如，烷基硫酸酯盐或烷基苯磺酸盐等作为阴离子表面活性剂，另外，聚氧化烯烷基醚或烷基聚糖苷等作为非离子表面活性剂都可以用作清洁剂或杀菌剂。同样地，作为高级醇的衍生物的烷基胺盐或者单或二烷基季铵盐等阳离子表面活性剂日常用作杀菌剂，苯扎型季铵盐日常用作杀菌剂或防腐剂。特 别是，包含碳原子数为12左右的烷基部位的阴离子表面活性剂以及非离子表面活性剂作为表现出高清洁能力的清洁基材等，另外，包含碳原子数为14左右的烷基部位的阳离子表面活性剂作为优异的毛发护理剂等是有用的。进一步，碳原子数为18左右的高级醇作为植物的生长促进剂也是有用的。由于这样的脂肪酸类能够利用于各方面，因而其是有用的物质，所以进行使动植物等生物体内的脂肪酸或脂质的生产能力提高的尝试。例如，提出有通过导入乙酰基CoA羧化酶(ACCase)而使种子中的脂质量提高的方法(专利文献I、非专利文献I、专利文献5)，通过导入酶sn-2酰基转移酶(SLCl-I)使种子中的脂质量提高的方法(专利文献2、专利文献3和非专利文献2)，通过导入二酰基甘油酰基转移酶基因(DGAT)使种子中的脂质量提高的方法(专利文献4以及非专利文献3)等。另外，由于脂肪酸类的用途和有用性较大地依赖于其碳原子数，因此也进行控制脂肪酸的碳原子数、即链长的尝试。例如，提出有通过导入来自于加州月桂(Umbellularia californica (California bay))的酸基-ACP 硫酯酶使碳原子数为12的脂肪酸积蓄的方法(专利文献6、非专利文献4)，通过导入来自于萼距花(Cuphea hookeriana)的酰基-ACP硫酯酶使碳原子数为8或10的脂肪酸积蓄的方法(专利文献7)、通过导入来自于樟树(Cinnamomum camphorum)的酰基-ACP硫酯酶使碳原子数为14的脂肪酸积蓄的方法(非专利文献5)等。现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开2002-335786号公报专利文献2 :日本特表平11-506323号公报专利文献3 :国际公开第2008/076377号小册子专利文献4 :国际公开第2000/036114号小册子专利文献5 :美国专利第5，925，805号说明书
专利文献6 :日本特表平7-501924号公报专利文献7 :日本特表平8-502892号公报非专利文献非专利文献I :Madoka Y, Tomizawa K, Mizoi J, Nishida I, Nagano Y, SasakiY. , uChloroplast transformation with modified accD operon increases acetyl-CoAcarboxylase and causes extension of leaf longevity and increase in seed yieldin tobacco”，Plant Cell Physiol. , 2002 Dec, 43 (12)，p.1518-1525非专利文献2 :Zou J, Katavic V, Giblin EM, Barton DL, MacKenzie SL, KellerWA, Hu X, Taylor DC. , “Modification of seed oil content and acyl composition inthe brassicaceae by expression of a yeast sn-2 acyltransferase gene，，，PlantCell, 1997 Jun，9 (6) ,p. 909-923 非专利文献3 :Jako C, Kumar A, Wei Y, Zou J, Barton DL, Giblin EM, CovelloPS, Taylor DC.，“Seed-specific over-expression of an Arabidopsis cDNA encoding adiacylglycerol acyltransferase enhances seed oil content and seed weight”, PlantPhysiol. , 2001, 126 (2) ,p. 861-874非专利文献4:Voelker TA, Worrell AC, Anderson L, Bleibaum J, Fan C, HawkinsDJ, Radke SE, Davies HM. ,“Fatty acid biosynthesis redirected to medium chains intransgenic oilseed plants，，，Science. 1992 Jul 3; 257 (5066), p. 72-74.非专利文献5 :Yuan L, Voelker TA, Hawkins DJ. “Modification of thesubstrate specificity of an acyl-acyl carrier protein thioesterase by proteinengineering” Proc Natl Acad Sci USA. 1995Nov 7;92 (23),p.10639-10643.

发明内容
发明所要解决的课题本发明的课题在于提供一种新型硫酯酶以及编码该酶的硫酯酶基因。另外，本发明的课题在于提供含有该硫酯酶基因、并且提高了脂肪酸或包含这些脂肪酸的脂质的生产能力的转化子。进一步，本发明的课题在于提供使用该转化子的脂肪酸或包含这些脂肪酸的脂质的制造方法。解决课题的手段本发明者们为了提高动植物等中的脂肪酸或脂质的生产能力进行了专心研究。因此，着眼于对生物体内的脂肪酸和脂质的生物合成起重要作用的酶硫酯酶，尝试对较之现有硫酯酶的生产能力更高的新型硫酯酶进行了探索。其结果发现:从椰子(Cocos nuciferaL.)中分离新型编码硫酯酶的基因，并导入有该硫酯酶基因的转化子，与导入有其它硫酯酶基因的转化子相比较，其脂肪酸和脂质的生产能力都明显提高，以及脂质中所含的脂肪酸的组成与椰子胚乳的组成不同。基于这些发现至此完成本发明。本发明涉及下述(a) (C)的任意一种蛋白质(以下，也称为本发明的蛋白质)。(a)由序列号I所示的氨基酸序列构成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白质，(b)由在序列号I所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加I个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白质，
(c)由与序列号I所示的氨基酸序列具有90%以上同一性(同源性)的氨基酸序列构成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白质。另外，本发明涉及编码所述本发明的蛋白质的基因(以下，也称为本发明的基因)，优选为由下述(d) Cf)的任意一种的DNA构成的基因。(d)由序列号2所示的碱基序列构成的，并且编码具有硫酯酶活性的蛋白质的DNA,(e)在严格条件下与由序列号2所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA进行杂交的，并且编码具有硫酯酶活性的蛋白质的DNA，(f)由与序列号2所示的碱基序列具有90%以上的同一性的碱基序列构成的，并且编码具有硫酯酶活性的蛋白质的DNA。 另外，本发明涉及含有所述基因的重组载体，以及包含所述基因或所述重组载体的转化子。另外，本发明涉及一种脂肪酸或含有脂肪酸的脂质的制造方法，其特征在于，在培养基中培养所述转化子，从培养物中提取脂肪酸或者包含这些脂肪酸的脂质，其中，脂肪酸优选为月桂酸、肉豆蘧酸、棕榈酸以及棕榈油酸。进一步，本发明涉及使脂肪酸或含有脂肪酸的脂质的生产能力提高的方法，其特征在于，在宿主中导入编码下述(a) (C)的任意一种的蛋白质的基因。发明的效果根据本发明，可以提供一种新型硫酯酶以及编码该酶的硫酯酶基因。另外，根据本发明，可以提供含有该硫酯酶基因，并且提高了脂肪酸或脂质的生产能力的转化子。进一步，根据本发明，可以提供使用该转化子的脂肪酸(优选为月桂酸、肉豆蘧酸、棕榈酸以及棕榈油酸)或脂质的制造方法。本发明的转化子以及脂肪酸或脂质的制造方法具有优异的生产能力，还可以得到特有的脂肪酸组成，可以优选用于脂肪酸或脂质的工业化生产。本发明的上述以及其它特征和优点可以适当参照附图，从下述的记载中进一步明确。


图I是表示导入有来自于加州月桂的硫酯酶(BTE)基因、或者来自于椰子的硫酯酶(CTE)基因并经过转化的大肠杆菌的各脂肪酸的生产量的图。图2是表示导入有来自于加州月桂的硫酯酶(BTE)基因、或者来自于椰子的硫酯酶(CTE)基因并经过转化的大肠杆菌的总脂肪酸生产量的图。图3是分别表示(a)椰子胚乳中的脂肪酸构成比率、(b)导入有来自于椰子的硫酯酶(CTE)基因的转化子的脂肪酸构成比率的图。图4是表示拟南芥野生株、以及导入有来自于椰子的硫酯酶基因的拟南芥转化子Pnapin-CTE的种子中所含的总脂肪酸量的图。图5是表示拟南芥野生株、以及导入有来自于椰子的硫酯酶基因的拟南芥转化子Pnapin-CTE的种子中的脂肪酸构成比率的图。
具体实施方式
I.硫酯酶本发明的蛋白质为以下的(a) (C)的任意一种蛋白质(以下，也称为“本发明的硫酯酶”)。(a)由序列号I所示的氨基酸序列构成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白质，(b)由在序列号I所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加I个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白质，(c)由与序列号I所示的氨基酸序列具有90%以上同一性(同源性)的氨基酸序列构成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白质。另外，本发明的基因为编码上述蛋白质的基因。由序列号I所示的氨基酸序列构成的蛋白质为来自于椰子(Cocos nucifera L.)·的新型硫酯酶(以下，简称为CTE)。硫酯酶是作为与甘油三酯的生物合成体系相关的酶的酰基-酰基载体蛋白质(Acyl-ACP)硫酯酶，并且水解作为叶绿体内或质体内的脂肪酸生物合成过程的中间体的酰基-酰基载体蛋白质(由作为脂肪酸残基的酰基和酰基载体蛋白质构成的复合体)的硫酯键，生成游离的脂肪酸的酶。通过硫酯酶的作用，使酰基载体蛋白质上的脂肪酸合成终止，游离的脂肪酸从质体输送并供给于甘油三酯合成。可知硫酯酶根据作为基质的构成酰基-酰基载体蛋白质的脂肪酸残基的种类不同而表现出不同的反应特异性，是确定生物体内的脂肪酸组成的重要的因素。在本发明的蛋白质中，除了(a)由序列号I所示的氨基酸序列构成的具有硫酯酶活性的蛋白质，还包含与该蛋白质功能上均等的蛋白质。通常，编码酶蛋白质的氨基酸序列并不是全部区域的序列没被保留就一定不显示酶活性，已知即使氨基酸序列发生变化也存在不影响酶活性的区域。在这样的区域中即使导入氨基酸的缺失、置换、插入或添加等突变也可以维持酶本来的活性。在本发明中，也可以使用这样保持硫酯酶活性地由序列号I所示的氨基酸序列进行部分变化的变异体。作为与由序列号I所示的氨基酸序列构成的硫酯酶功能上均等的蛋白质，可以列举(b)由在序列号I所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加I个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白质、以及(C)由与序列号I所示的氨基酸序列具有90%以上同一性(同源性)的氨基酸序列构成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白质，这些都包含于本发明的蛋白质。上述(b)的蛋白质中的“缺失、置换、插入和/或添加I个或多个氨基酸的氨基酸序列”优选为缺失、置换、插入和/或添加广20个氨基酸的氨基酸序列，更优选缺失、置换、插入和/或添加f 10个氨基酸的氨基酸序列，进一步优选缺失、置换、插入和/或添加f 5个氨基酸的氨基酸序列，特别优选缺失、置换、插入和/或添加广2个左右氨基酸的氨基酸序列。另外，上述添加中包括在两末端添加f多个氨基酸。另外，作为上述(C)的蛋白质中的“具有90%以上同一性的氨基酸序列”，氨基酸序列的同一性优选为95%以上，更优选为96%以上，进一步优选为97%以上，特别优选为98%以上。在后述的实施例中本发明者们进行了研究，在将由序列号I的氨基酸序列构成的硫酯酶与其它公知的硫酯酶的氨基酸序列比较的情况下，其同一性为5(Γ60%左右。例如，与来自于加州月桂(Umbellularia californica,也称为加利福尼亚月桂)的硫酯酶的氨基酸序列的同源性为50%左右，与来自于拟南芥的硫酯酶的氨基酸序列的同源性为60%左右。本发明中的氨基酸序列和碱基序列的同一丨生(同源性)通过Lipman-Pearson法(Science，227，1435，(1985))进行计算。具体来说，使用基因信息处理软件Genetyx-Win(软件开发)的同源性分析(Search homology)程序,将Unit size to compare (ktup)作为2进行分析，由此算出。在上述(b)和(C)的蛋白质中，作为更优选的具有硫酯酶活性的变异体，优选具有硫酯酶活性的、并且具有序列号I所示的氨基酸序列中以下位置的氨基酸被保留，而在这些位置以外的区域中氨基酸序列一部分发生变化的蛋白质相当于第34个的氨基酸保留为精氨酸，相当于第35个的氨基酸保留为丝氨酸，相当于第37个的氨基酸保留为谷氨酸，相当于第39个的氨基酸保留为甘氨酸，相当于第41个的氨基酸保留为天冬氨酸，相当于第 51个的氨基酸保留为天冬酰胺，相当于第54个的氨基酸保留为谷酰胺，相当于第59个的氨基酸保留为天冬酰胺，相当于第65个的氨基酸保留为甘氨酸，相当于第70个的氨基酸保留为甘氨酸，相当于第72个的氨基酸保留为甘氨酸，相当于第74个的氨基酸保留为苏氨酸，相当于第77个的氨基酸保留为蛋氨酸，相当于第82个的氨基酸保留为亮氨酸，相当于第84个的氨基酸保留为色氨酸，相当于第85个的氨基酸保留为缬氨酸，相当于第96个的氨基酸保留为酪氨酸，相当于第98个的氨基酸保留为色氨酸，相当于第99个的氨基酸保留为色氨酸，相当于第108个的氨基酸保留为色氨酸，相当于第113个氨基酸保留为甘氨酸，相当于第137个的氨基酸保留为丝氨酸，相当于第142个的氨基酸保留为蛋氨酸，相当于第147个的氨基酸保留为精氨酸，相当于第177个的氨基酸保留为赖氨酸，相当于第192个的氨基酸保留为甘氨酸，相当于第193个的氨基酸保留为亮氨酸，相当于第195个的氨基酸保留为脯氨酸，相当于第197个的氨基酸保留为色氨酸，相当于第199个的氨基酸保留为天冬氨酸，相当于第201个的氨基酸保留为天冬氨酸，相当于第203个的氨基酸保留为天冬酰胺，相当于第205个的氨基酸保留为组氨酸，相当于第206个的氨基酸保留为缬氨酸，相当于第210个的氨基酸保留为赖氨酸，相当于第211个的氨基酸保留为酪氨酸，相当于第214个的氨基酸保留为色氨酸，相当于第220个的氨基酸保留为脯氨酸，相当于第236个的氨基酸保留为酪氨酸，相当于第239个的氨基酸保留为谷氨酸，相当于第248个的氨基酸保留为丝氨酸，相当于第266个的氨基酸保留为组氨酸，以及相当于第283个的氨基酸保留为色氨酸。本发明的硫酯酶具有下述特征。(I)本发明的导入了硫酯酶的转化子与导入了其它植物硫酯酶(例如，来自于加州月桂的硫酯酶)的转化子相比，脂肪酸或脂质的生产能力更高。(2)在本发明的导入了硫酯酶的转化子中，可以生产与椰子胚乳不同组成的脂肪酸。具体来说，增加肉豆蘧酸(C14:0)的生产量。另外，可以生产椰子胚乳中几乎看不到的不饱和脂肪酸(特别是，C16:l的棕榈油酸)。(3)本发明的导入了硫酯酶的转化子中，主要生产月桂酸(C12:0)、肉豆蘧酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)以及棕榈油酸(C16:l)。在本发明中，“具有硫酯酶活性”是指，具有水解酰基-酰基载体蛋白质的硫酯键的活性。蛋白质是否具有硫酯酶活性，例如，可以通过将在大肠杆菌等宿主细胞内发挥作用的启动子的下游处连接有硫酯酶基因的融合基因导入缺损脂肪酸分解体系的宿主细胞，在导入的硫酯酶基因表达的条件下进行培养，使用气相色谱分析等方法分析宿主细胞的脂肪酸组成的变化，从而可以测定硫酯酶活性。或者，通过将在大肠杆菌等宿主细胞内发挥作用的启动子的下游处连接有硫酯酶基因的融合基因导入宿主细胞，对于在导入的硫酯酶基因表达的条件下进行了培养的细胞的破碎液，进行将根据Yuan etal.，PNAS, 1995，(92)，p. 10639-10643等方法(所述非专利文献5)制得的各种酰基-ACP作为基质的反应，由此可以测定硫酯酶活性。对于本发明的蛋白质的取得方法没有特别地限制，可以通过通常进行的化学或基因工程的方法等来得到。例如，可以通过从椰子的胚乳中分离、精制等，从而取得来自于天然物的蛋白质。另外，既可以基于序列号I所示的氨基酸序列信息进行人工合成等，也可以通过化学合成进行蛋白质合成，也可以通过基因重组技术制作重组蛋白质。在制作重组蛋白质的情况下，可以使用后述的本发明的硫酯酶基因。2.硫酯酶基因本发明的基因是编码上述本发明的蛋白质的基因(以下，也称为“本发明的硫酯酶基因”)。优选，可以列举(d)由序列号2所示的碱基序列构成并且编码具有硫酯酶活性的蛋 白质的DNA所构成的基因，或者与该基因功能上均等的基因。作为功能上均等的基因，可以列举以下(e) (g)的基因，(e)在严格条件下与由序列号2所不的喊基序列互补的喊基序列构成的DNA进行杂交并且编码具有硫酯酶活性的蛋白质的DNA所构成的基因，(f)由与序列号2所示的碱基序列具有90%以上的同一性(同源性)的碱基序列构成并且编码具有硫酯酶活性的蛋白质的DNA所构成的基因，以及(g)由序列号2所示的碱基序列中I个或多个碱基缺失、置换、插入和/或添加的碱基序列构成并且编码具有硫酯酶活性的蛋白质的DNA所构成的基因，这些都包含于本发明的基因。在本发明中，作为“严格的条件”，例如可以列举Molecular Cloning - ALABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook, David W Russell. ， Cold SpringHarbor Laboratory Press]记载的方法,例如可以列举使含有6XSSC (1XSSC的组成:O. 15M氯化钠、O. 015M柠檬酸钠，pH7. 0),0. 5%SDS、5xDenhardt 以及 100mg/ml 鲱鱼精 DNA 的溶液与探针在65°C下恒温8 16小时进行杂交的条件。作为上述(f)的基因中的“具有90%以上同一性的碱基序列”，碱基序列的同一性优选为95%以上，更优选为96%以上，进一步优选为97%以上，特别优选为98%以上。本发明中的碱基序列的同一性通过所述的Lipman-Pearson法(Science, 227, 1435, (1985))来进行计算。具体来说，通过使用基因信息处理软件Genetyx-Win (软件开发)的同源性分析(Search homology)程序,将 Unit size to compare (ktup)作为 2 进行分析,从而算出。上述(g)的基因中的“缺失、置换、插入和/或添加I或多个碱基的碱基序列”优选缺失、置换、插入和/或添加f 60个碱基的碱基序列，更优选缺失、置换、插入和/或添加I 30个喊基的喊基序列，进一步优选缺失、置换、插入和/或添加I 15个喊基的喊基序列，特别优选缺失、置换、插入和/或添加1飞个碱基的碱基序列。另外，上述添加包括在两末端添加多个碱基。作为上述(e广(g)的基因，优选为由编码具有硫酯酶活性的蛋白质的碱基序列构成的基因，并且，具有对应于该基因编码的氨基酸序列成为在所述序列号I所示的氨基酸序列中以下位置的氨基酸被保留的碱基序列，而这些氨基酸保留位置以外的区域中碱基序列一部分发生变化相当于第34个的氨基酸保留为精氨酸、相当于第35个的氨基酸保留为丝氨酸、相当于第37个的氨基酸保留为谷氨酸、相当于第39个的氨基酸保留为甘氨酸、相当于第41个的氨基酸保留为天冬氨酸、相当于第51个的氨基酸保留为天冬酰胺、相当于第54个的氨基酸保留为谷酰胺、相当于第59个的氨基酸保留为天冬酰胺、相当于第65个的氨基酸保留为甘氨酸、相当于第70个的氨基酸保留为甘氨酸、相当于第72个的氨基酸保留为甘氨酸、相当于第74个的氨基酸保留为苏氨酸、相当于第77个的氨基酸保留为蛋氨酸、相当于第82个的氨基酸保留为亮氨酸、相当于第84个的氨基酸保留为色氨酸、相当于第85个的氨基酸保留为缬氨酸、相当于第96个的氨基酸保留为酪氨酸、相当于第98个的氨基酸保留为色氨酸、相当于第99个的氨基酸保留为色氨酸、相当于第108个的氨基酸保留为色氨酸、相当于第113个氨基酸保留为甘氨酸、相当于第137个的氨基酸保留为丝氨酸、相当于第142个的氨基酸保留为蛋氨酸、相当于第147个的氨基酸保留为精氨酸、相当于第177个的氨基酸保留为赖氨酸、相当于第192个的氨基酸保留为甘氨酸、相当于第193个的氨基酸保留为亮氨酸、相当于第195个的氨基酸保留为脯氨酸、相当于第197个的氨基酸保留为色氨酸、相当于第199个的氨基酸保留为天冬氨酸、相当于第201个的氨基酸保留为天冬氨酸、相当于第203个的氨基酸保留为天冬酰胺、相当于第205个的氨基酸保留为组氨酸、相当于第206个的氨基酸保留为缬氨酸、相当于第210个的氨基酸保留为赖氨酸、相当于第211个的氨基酸保留为酪氨酸、相当于第214个的氨基酸保留为色氨酸、相当于第220个的 氨基酸保留为脯氨酸、相当于第236个的氨基酸保留为酪氨酸、相当于第239个的氨基酸保留为谷氨酸、相当于第248个的氨基酸保留为丝氨酸、相当于第266个的氨基酸保留为组氨酸、以及相当于第283个的氨基酸保留为色氨酸。作为本发明的硫酯酶基因的取得方法，没有特别地限制，可以通过通常的基因工程技术来得到。例如，基于序列号I所示的氨基酸序列或序列号2所示的碱基序列，可以通过人工合成取得本发明的硫酯酶基因。基因的人工合成可以利用例如Invitrogen Inc.等业务。另外，可以通过克隆从椰子中取得，例如，可以根据Molecular Cloning-ALABORATORYMANUAL THIRD EDITI0N[Joseph Sambrook, David ff. RusselI, Cold Spring HarborLaboratory Press (2001)]记载的方法等来进行。在将突变导入序列号I所示的氨基酸序列或序列号2所示的碱基序列的情况下，例如可以列举位点特异突变导入法。作为具体的位点特异突变的导入方法，可以列举利用剪接重叠延伸(Splicing overlap extension, S0E) PCR 反应(Horton et al. , Gene77, 61-68, 1989)的方法、ODA 法(Hashimoto-Gotoh et al.，Gene, 152，271-276，1995)、Kunkel 法(Kunkel, T. A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985，82，488)等。另外，也可以利用 Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmi^ 剂盒(TakaraBio, Inc. )、Transformer TM Site-Directed Mutagenesis 试剂盒(Clonetech 公司)、KOD-Plus-Mutagenesis Kit (东洋纺公司)等市售的试剂盒。另外，在赋予任意的基因突变之后，可以通过用适当的方法进行酶活性评价和基因分析来取得目标基因。具体来说，通过使用任意克隆的DNA片段使同源重组发生的方法，或者通过照射Y射线等，从而可以导入任意的基因突变。3.转化子本发明的转化子是包含所述本发明的硫酯酶基因或含有该基因的重组载体而成的。如后述的实施例所示，本发明的转化子大幅提高脂肪酸或者含有这些脂肪酸的脂质的生产能力，所述脂肪酸优选为碳原子数为12以上的长链脂肪酸，更优选月桂酸、肉豆蘧酸、棕榈酸以及棕榈油酸。另外，对于转化子的脂肪酸生产能力，可以通过后述的实施例中记载的方法进行测定。本发明的转化子通过用通常基因工程的方法将所述硫酯酶基因导入宿主而得到。优选为，可以通过将该基因导入能够使所述硫酯酶基因在宿主细胞中表达的载体中来调制重组载体，并将该重组载体导入宿主细胞使宿主细胞转化来制作。得到的转化子提高脂肪酸或含有脂肪酸的脂质的生产能力。首先，对本发明的含有硫酯酶基因的重组载体进行说明。作为使用的载体，只要是能够将本发明的硫酯酶基因导入宿主、并且能够使该基因在宿主细胞内表达的载体即可。例如，可以使用根据所要导入的宿主的种类而具有启动
子或终止子等表达调节区域的表达载体，该载体并且具有复制起始点或选择标记等。另外，也可以是在质粒等染色体外进行自增殖·复制的载体，也可以是合并于染色体内的载体。作为具体的载体，在将微生物作为宿主的情况下，例如可以列举pBlue script IISK(-) (Stratagene 公司制造)、pUCl 19 (宝酒造公司制造)、pET 系载体(Takara Bio, Inc.制造)、pGEX 系载体(GE Healthcare, Inc.制造)、pCold 系载体(Takara Bio, Inc.制造)、pHY300PLK (Takara Bio, Inc.制造)、pUBllO (Mckenzie, T. et al. , (1986), Plasmid15 (2) ; p. 93-103)、pBR322 (Takara Bio, Inc.制造)、pRS403 (Stratagene Corp.制造)、PMW218/219 (Nippon Gene Co. , Ltd.制造)等。在将植物细胞作为宿主的情况下，例如可以列举 pRI 系载体(Takara Bio, Inc.制造)、pBI 系载体(Clontech Laboratories, Inc.制造)、IN3系载体(Inplanta Innovations, Inc.制造)等。特别是,在将大肠杆菌作为载体的情况下，优选使用 pBlue script II SK(-) (Stratagene 公司制造)、pMW218/219 (NipponGene Co.，Ltd.制造)；在将拟南芥作为宿主的情况下，优选使用pRI系载体(TakaraBio, Inc.制造)、pBI 系载体(Clontech Laboratories, Inc.制造)。启动器或终止子等表达调节区域或选择标记的种类也没有特别地限定，可以根据所要导入的宿主的种类，适当选择通常使用的启动子或标记等来使用。具体来说，作为启动子，可以列举Iac启动子、trp启动子、tac启动子、trc启动子、T7启动子、SpoVG启动子、花椰菜花叶病毒35SRNA启动子、肌动蛋白和泛素等看家基因(house-keeping gene)的启动子、来自于菜籽的Napin基因启动子、来自于植物的Rubisco启动子等。另外，作为选择标记，可以列举抗生素抗药性基因(氨苄西林抗性基因、氯霉素抗性基因、红霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、大观霉素抗性基因、四环素抗性基因、灭瘟素S抗性基因、双丙氨膦抗性基因、以及潮霉素抗性基因)等抗药性基因。进一步，也可以将与营养缺陷型相关的基因的缺失等用作选择标记基因。可以采用限制酶处理或结扎等通常的方法，通过将本发明的硫酯酶基因导入这样的载体来构建转化子用的载体。另外，本发明的硫酯酶基因可以通过上述的方法取得。通过由此制得的重组载体，将所述硫酯酶基因导入宿主从而制作转化子。作为转化子的宿主没有特别地限定，可以使用微生物、植物体、动物体。本发明的硫酯酶如后所述优选用于特别是碳原子数为12以上的长链脂肪酸的制造，例如，本来不具有将碳原子数为12的脂肪酸残基识别为基质的硫酯酶的生物体也可以用作宿主。在本发明中，从脂肪酸或脂质的制造效率以及得到的脂肪酸的利用性的观点出发，作为宿主优选使用微生物和植物体。作为微生物，可以使用属于埃希氏菌(Escherichia)属的微生物或属于芽孢杆菌(Bacillus)属的微生物等原核生物，或者酵母或丝状菌等真核微生物，其中，优选大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、圆红冬抱酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、被抱霉菌(Mortierella sp.)，特另Il优选大肠杆菌。作为植物体，优选拟南芥(Arabidopsis thaliana)、菜籽、椰子、棕榈、萼距花、麻风树(Jatropha),特别优选拟南芥。作为转化方法，只要是能够将目标基因导入宿主的方法就没有特别地限定。例如，可以采用使用钙离子的方法、通常的感受态细胞转化方法(J. Bacterial. 93, 1925(1967))、原生质体转化法(Mol. Gen. Genet. 168, 111(1979))、电穿孑L 法(FEMS Microbiol.Lett. 55, 135 (1990))或者 LP 转化方法(T. Akamatsu 和 J. Sekiguchi, Archives of Microbiology, 1987, 146, p. 353-357;T. Akamatsu 和 H. Taguchi, Bioscience, Biotechnology, andBiochemistry, 2001, 65, 4, p. 823-829)等。另外，导入有目标基因片段的转化子的选择可以通过利用选择标记等来进行。例 如，将转化子获得抗药性为指标可以来进行选择，其结果来自于载体的抗药性基因在转化时导入目标DNA片段并且导入宿主细胞中。另外，将染色体组作为模板，通过PCR法等也可以确认目标DNA片段的导入。4.脂肪酸或脂质的制造方法本发明的脂肪酸或含有脂肪酸的脂质的制造方法使用上述本发明的硫酯酶。作为具体的制造方法，可以列举使用含有编码本发明的硫酯酶的基因的转化子(重组体)的方法、使用精制的Acyl-ACP和本发明的硫酯酶体外进行从Acyl-ACP中切出脂肪酸的方法(Yuan et al. , PNAS, 1995, (92)，ρ· 10639-10643)等。特别是优选为，在通过上述的方法等得到导入了编码本发明的硫酯酶的基因的转化子之后，使用适当的培养基在适当的条件下培养该转化子，使脂肪酸或含有脂肪酸的脂质产生，从培养物中提取脂肪酸或脂质。另外，在培养基中培养本发明的转化子当然包含微生物或动植物或者其细胞·组织的培养，也包含在土壤等中栽培植物体。另外，在培养物中也包含经培养·栽培等后的转化子。转化子的培养条件可以根据导入了硫酯酶基因的宿主的种类来选择，可以采用适宜优选的培养条件。作为一个例子，在将大肠杆菌用作宿主的转化子的情况下，可以列举在LB培养基中3(T37°C下进行培养O. 5^1天。另外，在将拟南芥用作宿主的转化子的情况下，在土壤中在温度条件为2(T25°C下连续照射白色光或光期为16小时 暗期为8小时等的光照条件下进行栽培Γ2个月。另外，从脂肪酸和脂质的生产效率的观点出发，在培养基中可以添加例如作为与硫酯酶的基质或脂肪酸生物合成体系相关的前驱物质的甘油、醋酸、丙二酸等。培养转化子使脂肪酸或脂质产生之后，从培养物(培养体或培养液等)中分离、精制等脂肪酸或含有其的脂质提取。作为分离、回收转化子内产生的脂肪酸或含有其的脂质的方法没有特别地限定，可以通过分离通常生物体内的脂质成分等时使用的方法来进行。例如，可以通过过滤、离心分离、细胞破碎、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、氯仿/甲醇提取法、己烷提取法、乙醇提取法等从转化子或培养物中分离、回收脂肪酸或含有脂肪酸的脂质成分。另外，在更大规模的情况下，在通过压榨或提取从转化子或培养物中回收油分之后，可以进行脱气、脱酸、脱色、脱蜡、脱臭等通常的精制，得到脂质。在分离该含有脂肪酸的脂质成分之后，可以通过水解分离的脂质得到脂肪酸。作为从脂质成分中分离脂肪酸的方法，具体来说，可以列举在碱溶液中在70°C左右的高温下进行处理的方法、进行脂肪酶处理的方法、使用高压热水进行分解的方法等。由此，可以使用本发明的硫酯酶基因制造脂肪酸或脂质。本发明的脂肪酸或脂质的制造方法可以优选用于特别是碳原子数为12以上的长链脂肪酸的制造。其中，本发明的制造方法优选用于制造碳原子数为12 18的脂肪酸，更优选用于制造碳原子数为12 16的脂肪酸，特别优选用于制造月桂酸(C12:0)、肉豆蘧酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:l)。本发明的制造方法或通过转化子制得的脂肪酸或其衍生物，除了用作食用以外，可以作为乳化剂配合于化妆品等中，或者可以作为皂或洗剂等的清洁剂、纤维处理剂、毛发 护理剂、或杀菌剂或防腐剂利用。特别是，棕榈油酸可以利用为皮肤功能改善剂(皮肤乳化作用、保护效果、抗炎症作用、减轻发痒刺激、轻度烫伤的镇静等)。实施例以下，基于实施例进一步详细地说明本发明，但是本发明并没有限定于此。实施例I来自于椰子(Cocos nucifera L.)的Acyl-ACP硫酯酶基因的取得I.由椰子胚乳调制cDNA从椰子胚乳中提取RNA。在RNA的提取操作中使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, Valencia, California)。用液氮冻结椰子胚乳之后，使用研钵和碾槌进行粉碎。将已粉碎的物质移至适量I. 5mL管中，在其中加入450 μ L添加有1Μ1/100容量的二硫苏糖醇的RLT Buffer,将搅拌后的总量适用于QIA shredder spin column。之后按照试剂盒附上的手册进行操作，得到来自于椰子的total RNA。使用得到的total RNA (3.2yg)和SuperScript III First-Strand Synthesis SystemCInvitrogen Carlsbad, California),按照试剂盒附上的手册，通过进行逆转录反应，得到来自于椰子胚乳的cDNA。2.来自于椰子的硫酯酶基因(CTE基因)的克隆与椰子相关的染色体组信息以及与来自于椰子的Acyl-ACP硫酯酶相关的基因信息并不是公知的，挑选已知的植物硫酯酶的氨基酸序列，并且挑选各硫酯酶间氨基酸保留性高的区域，相对于该区域设计表I所示的简并引物(引物No. ΓΝο. 5(序列号5、))。具体来说，相当于拟南芥硫酯酶(Genbank ID (GI):804947)中的105 110位(AAEKQW)、250 255位(WVMMN)、31(T318位(DLDVNQHV)、325 324位(NQHVNNVKY)的氨基酸相对于植物硫酯酶序列设计简并引物。将来自于椰子胚乳的cDNA作为模板，进行使简并引物组合的PCR反应，通过序列分析确定取得的各CTE基因片段的序列。特别是，通过比对由引物No. 2和No. 4的组合而得到的序列，取得CTE基因的部分序列信息。使用参考取得的部分的序列信息设计的DNA引物(表1，引物No. 6 (序列号10))以及低聚dT引物(表1，引物No. 7 (序列号11))通过PCR反应扩增DNA片段，进行该DNA片段的序列分析，取得、确认编码来自于椰子的硫酯酶的功能性部分的基因的碱基序列(序列号2)。表I :表I引物序列
权利要求
1.一种蛋白质，其中， 所述蛋白质为下述(a) (C)的任意一种蛋白质， Ca)由序列号I所示的氨基酸序列构成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白质， (b)由在序列号I所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加I个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白质， (c)由与序列号I所示的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列构成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白质。
2.—种基因，其中， 所述基因编码权利要求I所述的蛋白质。
3.—种基因，其中， 所述基因由下述(d) (f)的任意一种的DNA构成， Cd)由序列号2所示的碱基序列构成的，并且编码具有硫酯酶活性的蛋白质的DNA， Ce)在严格条件下与由序列号2所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA进行杂交的，并且编码具有硫酯酶活性的蛋白质的DNA， (f)由与序列号2所示的碱基序列具有90%以上的同一性的碱基序列构成的，并且编码具有硫酯酶活性的蛋白质的DNA。
4.一种重组载体,其中， 所述重组载体含有权利要求2或3所述的基因。
5.一种转化子，其中， 所述转化子包含权利要求2或3所述的基因或者权利要求4所述的重组载体。
6.如权利要求5所述的转化子，其中， 宿主为微生物或植物。
7.如权利要求5所述的转化子，其中， 宿主为大肠杆菌。
8.如权利要求5所述的转化子，其中， 宿主为拟南芥。
9.一种脂肪酸的制造方法，其特征在于， 在培养基中培养权利要求51中任一项所述的转化子，并从培养物中提取脂肪酸。
10.一种含有脂肪酸的脂质的制造方法，其特征在于， 在培养基中培养权利要求51中任一项所述的转化子，并从培养物中提取含有脂肪酸的脂质。
11.如权利要求9或10所述的制造方法，其特征在于， 所述脂肪酸为碳原子数为12以上的长链脂肪酸。
12.如权利要求扩11中任一项所述的制造方法，其特征在于， 所述脂肪酸为选自月桂酸、肉豆蘧酸、棕榈酸以及棕榈油酸中的任意一种以上。
13.一种提高脂肪酸或含有脂肪酸的脂质的生产能力的方法，其特征在于， 在宿主中导入编码下述(a) (c)的任意一种蛋白质的基因， Ca)由序列号I所示的氨基酸序列构成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白质， (b)由在序列号I所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加I个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白质， (C)由与序列号I所示的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列构成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白质。
全文摘要
本发明涉及由序列号1所示的氨基酸序列构成的硫酯酶以及编码该蛋白质的硫酯酶基因、包含该基因的转化子、以及使用该转化子的脂肪酸或脂质的制造方法。
文档编号C12N5/10GK102884189SQ20118002275
公开日2013年1月16日 申请日期2011年4月13日 优先权日2010年5月6日
发明者东条卓人, 远藤圭二 申请人:花王株式会社