专利名称：重组胆红素氧化酶及其生产方法
技术领域：
本发明涉及重组胆红素氧化酶和该酶的生产方法。更具体而言，本发明涉及来源于半知丝状真菌抚孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)的重组胆红素氧化酶等。
背景技术：
“胆红素氧化酶”是催化胆红素氧化成为胆绿素的反应的酶，是属于多铜氧化酶(在其活性中心具有多个铜离子的酶的通称)中的一类酶。习惯上将胆红素氧化酶广泛用作肝功能等临床检测的试剂(血清中胆红素的测定试剂)。此外，在近几年中，还将胆红素氧化酶用作在酶电池的阴极(正电极)侧催化氧的电化学四电子还原反应的电极酶。在过去，将从半知丝状真菌疣孢漆斑菌MT-I中提取并将提取物部分纯化得到的酶样品(下文中将此类样品称为“天然胆红素氧化酶”)作为胆红素氧化酶使用(参见专利文·件I)。另外，非专利文件I已报道了对编码胆红素氧化酶的基因的碱基序列的测定，以及使用酵母构建用于重组胆红素氧化酶的表达系统(还可参见专利文件2)。现有技术文件专利文件专利文件I :特开平5-199882号公报专利文件2 :特开2005-73660号公报非专利文件非专利文件I :“Molecular cloning of the gene for bilirubin oxidase fromMyrothecium verrucaria and its expression in yeast.，’,J Biol Chem. ,1993 年 9 月 5日，268 (25):18801-9。
发明内容
技术问题为了大量供应作为用于临床检测试剂或者用于酶电池的电极酶的、来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的胆红素氧化酶，期望构建出出色的重组胆红素氧化酶表达系统。然而，使用半知丝状真菌疣孢漆斑菌或酵母的传统方法存在着如下缺陷酶的表达量低或者所表达的酶的活性不足。因此，本发明的目的是提供一种简单技术，用于获得具有高表达和高活性的、来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的重组胆红素氧化酶。技术方案为解决上述问题，本发明人尝试使来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌(作为真核生物的真菌)的胆红素氧化酶基因在大肠杆菌(Escherichia coli)(作为原核生物的细菌)中进行表达。结果，本发明人发现，使用简单的大肠杆菌表达系统能够表达和纯化出具有足够活性的重组胆红素氧化酶。而且，本发明人了解了如下事实出人意料地，在缺少翻译后糖链修饰的大肠杆菌表达系统中，能够得到比来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的天然胆红素氧化酶活性更高的重组胆红素氧化酶。基于这些发现，本发明提供了通过如下方式得到的重组胆红素氧化酶将来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的胆红素氧化酶基因导入大肠杆菌中并使其得以表达。这一重组胆红素氧化酶具有如SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列，并且具有比来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的天然胆红素氧化酶更高的高酶活性。SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列是通过去除来自天然胆红素氧化酶的氨基酸序列的分泌信号肽的37个残基得到的序列。另外，本发明提供了重组胆红素氧化酶的生产方法，所述方法包括如下步骤将来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的胆红素氧化酶基因导入大肠杆菌中并使其得以表达。在所述重组胆红素氧化酶的生产方法中，优选使用来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的胆红素氧化酶基因，所述胆红素氧化酶基因具有如SEQ ID N0:2所示的碱基序列，并且 优选使用来源于K-12的大肠杆菌菌株。SEQ ID NO: 2所示的碱基序列是通过去除编码分泌信号肽的部分而得到的序列。有益效果本发明提供了一种简单技术，用于获得具有高表达和高活性的、来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的重组胆红素氧化酶。
图I为表明pET-BO载体结构的示意图。图2为代替图片的照片，该照片示出了纯化后的重组胆红素氧化酶的SDS-PAGE结
果O图3为示出纯化后的重组胆红素氧化酶的吸收光谱的光谱图。图4为示出重组胆红素氧化酶的活性评价结果的图。
具体实施例方式现在，将参考附图对实施本发明的优选方式进行描述。此外，下文中将描述的实施本发明的方式为实施本发明的代表性方式的实例，本发明的保护范围并不会因此而被狭义解释。通过将来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的胆红素氧化酶基因导入大肠杆菌中并使其得以表达，得到本发明的重组胆红素氧化酶。所述重组胆红素氧化酶的特征在于具有比来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的天然胆红素氧化酶更高的酶活性(参见“实施例”)。此夕卜，由于是通过在没有翻译后糖链修饰的大肠杆菌中表达而得到所述重组胆红素氧化酶，所以不同于天然胆红素氧化酶和由酵母表达的重组(野生型)胆红素氧化酶，所述重组胆红素氧化酶无糖链修饰。作为来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的胆红素氧化酶基因，可使用具有如SEQ IDN0:2所示的碱基序列的DNA片段。这一碱基序列被认为是通过从编码天然胆红素氧化酶的DNA中去除编码分泌信号肽的部分而得到的序列。通过胆红素氧化酶基因的表达而获得的重组胆红素氧化酶具有如SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列，所述序列是通过从天然胆红素氧化酶的氨基酸序列中去除分泌信号肽的37个残基而得到。此外，本发明的重组胆红素氧化酶可为具有通过如下得到的序列的重组胆红素氧化酶从如SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列中去除对应于起始密码子的甲硫氨酸(从N末端起的第一个甲硫氨酸)。作为用于重组胆红素氧化酶表达的载体，可采用通常用于重组蛋白质表达的质粒载体。所述载体的实例包括pET22b、pUC18、pHSG398、pHSG399、pRIT2T、pUEXl 至 pUEX3、pKK223-3、pINIII I、pTTQ18、pGEMEX-1、pGH_L9 和 pKK233_2。作为用于重组胆红素氧化酶表达的宿主细胞，可采用通常用于重组蛋白质表达的大肠杆菌细胞。作为大肠杆菌、尤其是优选来源于K-12的菌株，其实例包括如下菌株BL21(DE3)、BB4、BM25. 5、BMH71_18mutS、BW313、C_la、C600、CJ236、DHU DH5、DH5 α、DH10B、DP50supF、ED8654、ED8767、ER1647、HB101、HMS174、HST02、HST04dam-/dcm-、HST08Premium、JM83、JM101、JM105、JM106、JM107、JM108、JM109、JM110、K802、K803、LE392、MC1061、MV1184、MV1193、NovaBlue、RR1、TAP90、TGI、TG2、TH2、XLl-Blue、X-1776、y-1088, y-1089 和y-1090。
根据待使用的宿主细胞，可使用常规的已知方法(如，电穿孔法和钙法)将载体导入宿主细胞中(转化)。另外，例如，通过超声波破碎法来打碎细胞，并通过离心除去破碎产物中的未破碎细胞和沉淀物，继之以进行透析，由此从所培养的转化子中提取突变的胆红素氧化酶并对提取物进行纯化。可将由此得到的粗产物进一步通过液相色谱进行纯化。实施例实验例II.来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌NBRC (IF0)6113菌株的胆红素氧化酶的cDNA克隆( 1-1)疣孢漆斑菌的培养疣孢漆斑菌NBRC (IFO) 6113菌株分批购自独立行政法人日本国立技术与评估研究院(NITE)的生物技术中心(独立行政法人製品評価技術基盤機構〃' 4 f々7 口
一本部)。将所购买的干燥真菌体悬浮在复水液(聚蛋白胨0. 5% ;酵母提取物0. 3% ；MgSO4 · 7H20 :0. 1%)中，并将所得到的悬浮液接种至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板(马铃薯葡萄糖2. 4% ;琼脂1. 5%)上。在室温下培养5-7天后，PDA平板表面被白色菌丝覆盖。将所述菌丝用铲刮下，并于_80°C下保存。菌体的产量为50mg-60mg (湿重)/PDA平板(直径9cm)。(1-2) RNA 提取和 cDNA 合成从约IOOmg疣孢漆斑菌NBRC (IF0)6113菌株的冷冻真菌体粉末中提取出100 μ g(通过UV吸收测定)总RNA。将所述总RNA用作逆转录PCR的模板RNA。以所述总RNA作为模板，使用OneSt印RT-PCR试剂盒(由Qiagen K. K.生产)进行逆转录PCR。参考已报道的BO的cDNA碱基序列，设计用于逆转录PCR的引物的碱基序列，如下表I所示。表I
_
权利要求
1.一种重组胆红素氧化酶，所述重组胆红素氧化酶通过将来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的胆红素氧化酶基因导入大肠杆菌中并使其得以表达而得到。
2.根据权利要求I所述的重组胆红素氧化酶，所述重组胆红素氧化酶具有比来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的天然胆红素氧化酶更高的酶活性。
3.根据权利要求2所述的重组胆红素氧化酶，所述重组胆红素氧化酶具有如SEQIDNO: I所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组胆红素氧化酶，所述重组胆红素氧化酶用作酶电池的电极酶。
5.一种制备重组胆红素氧化酶的方法，所述方法包括如下步骤将来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的胆红素氧化酶基因导入大肠杆菌中并使其得以表达。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，使用来源于K-12的大肠杆菌菌株。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，使用来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的胆红素氧化酶基因，所述胆红素氧化酶基因具有如SEQID N0:2所示的碱基序列。
全文摘要
本发明公开了重组胆红素氧化酶的生产方法，所述方法包括如下步骤将来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的胆红素氧化酶基因导入大肠杆菌中并使其得以表达。本发明还公开了由这一生产方法得到的重组胆红素氧化酶。这一重组胆红素氧化酶具有比来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的天然胆红素氧化酶更高的酶活性。
文档编号C12N9/06GK102884180SQ20118002276
公开日2013年1月16日 申请日期2011年4月25日 优先权日2010年5月13日
发明者汲田英之, 山口大介, 户木田裕一, 藤田修二 申请人:索尼公司