一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种血浆miRNA定量检测的方法，尤其设及一种直接对血浆miR-122 进行绝对定量检测的方法。
【背景技术】
[0002] 成熟miRNA是一类由22个碱基（nt)组成的、具有调控基因表达作用的单链小分 子核糖核酸，镶嵌于4种Argonaute(Ago)之一的蛋白质中，形成RNA介导的基因沉默复合 体巧ISC)。RISC在mRNA上滑动，当在mRNA的3'端非翻译区（3' -UTR)区域遇上与miRNA 互补的祀序列时，就会抑制利用该mRNA进行的蛋白质生产。miRNA是现今发现的唯一一类 通过与被调控的祀基因3'-UTR碱基序列配对而发挥调控作用的调控因子，使miRNA与被调 控的祀基因之间建立起独特的1对1或1对多的特异性，影响并参与维持细胞的生理状态 和分化程度。通过对细胞的影响，特定miRNA表达量的变化影响并维持组织的特征，反映生 物个体的生理病理特征，预示其作为鉴定多种疾病的生物标记的可能性。例如脊椎动物都 拥有的、进化保守的miR-122,只在肝细胞中富集，每个肝细胞中所含拷贝数可达5万之多。 不论何种原因导致肝细胞的损坏时，miR-122被释放，经血液带至全身，血液中的miR-122 水平变化就可W掲示肝脏受损的情形。血液中富含RNA降解酶，因此游离RNA分子在血液 中的存活期仅为几分钟，而成熟miRNA分子受蛋白质复合体的保护而不被降解。事实上，室 溫下放置24小时或10次W内反复冻融处理对血清miRNA浓度没有影响。血液，也包括其 它体液，如脑脊液、尿液、泪液等含有的miRNA,都具有运样的特质，使其成为最具潜力的无 创诊断生物标记物。
[0003] 大量的文献报道，都证实血清miR-122水平升高可W专一地掲示肝细胞的实时损 伤。肝细胞含有多达5万个miR-122度issels，2009)，肝脏一旦受到损害，受损肝细胞的 miRNA释放到血液，引起血液miRNA水平的改变。健康人血液中miR-122的含量维持在每微 升300个拷贝数左右。W成人4升血液计算，约100个肝细胞受损释放进入血液的miR-122 可W使每微升血液miR-122的水平升高1. 25个拷贝数，对应每微升血浆为2. 5个拷贝。 miRNA在血液中的半衰期小于24小时，因此血液中miR-122拷贝数的改变可W实时而专一 地反映肝损害的程度。因此血液miR-122绝对分子数目的定量测定对于肝细胞损伤程度的 实时研判具有特殊的意义，目前尚缺乏健康人血清miR-122浓度的基础值数据，和具有实 用价值的miRNA客观测定方法。
[0004] 目前应用的miRNA定量测定技术主要有：逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)、RNA-seq 深度测序法、microArray杂交测定法、NanoStringnCounter及纳米微孔测序法。运些测定 方法有一些共同点，如：需要纯化的RNA、灵敏度低、内源性标准、数据校准等，测定结果为 miRNA含量相对倍数，而非拷贝数。除了RT-qPCR法，其余方法均有测定灵敏度低的缺陷， 如其中最灵敏的NanoStringnCounter法的测定低限为lamol或6xl0~5个分子W上的水 平，而miR-seq和microArray的测定低限更高，0.Ifmol分子W上，不满足临床诊断的需要。 循环miRNA表达量的巨大变动，加上miRNA拥有超短的长度、相似的序列、二级构象、末端修 饰、含有相同序列的前体及长度差异性等特性，给目前miRNA定量测定技术的客观性带来 很大的挑战。
[0005]RT-qPCR等测定方法需要测定样本中至少一个内源性标准RNA分子作为衡量目标 分子定量的基准值。运个（些）内源性标准RNA分子必须是在样本中恒量表达的。迄今为 止，还没有发现理想的内源性标准RNA分子。有的测定方法，如NanoStringnCounter利用 表达丰度最高的前100个miRNA的平均值作为参照值，虽然在一些测定中运些校正方法可 能有帮助，但没有从根本上摆脱对内源性标准RNA分子的依赖，得到的定量结果仍然是相 对的。RNA极易被RNases降解，测定结果受样本采集方式、保存、纯化方法的影响导致不同 的结论。运是影响利用RNA作分子诊断的最大障碍，为了克服运个障碍有赖于发现与所研 究对象无关的'看家基因'作对照。Beta-actin、GAPDH、U6、RNU24等基因为常用的对照基 因，miR-16、miR-10b、miR-30a、miR-24等为常用的血清miRNA参照物，认为其表达水平是相 对恒定不变的，但愈来愈多的研究发现运些常用的看家基因的表达与疾病或病理状态是相 关的，不是理想的参照物。
[0006] 测定技术的灵敏度决定了运些方法对RNA纯化富集的依赖，不可能直接测定血清 样本中的miRNA的含量。例如，血清经加热处理后，可通过microArray杂交法可W直接测 量其中高度富集的miRNA的含量，因方法定量底限为1〇6拷贝W上，没有被广泛的采纳。
[0007] 健康人血清中可W测到miR-122的存在，但含量极低，肝损伤患者血清miR-122 浓度有上百倍的提升，因此对测定方法的灵敏度和测定范围要求极高，也正因为如此， RT-qPCR是目前应用于血清miRNA定量最灵敏的技术。qPCR定量法WDNA在PCR扩增的循环 数来间接地反映初始DNA/RNA的浓度，有两种报道方式：相对定量的扩增倍数和拷贝数的 绝对定量。前者需要在样本中同时测定目标miRNA和可W作为内参标准的恒定表达的RNA, W二者间的循环数之差，来衡量目标miRNA的浓度差异。后者需要进一步对独立测定的系 列稀释的合成RNA片段进行测定，得到校正曲线，从而获得待测物的绝对分子拷贝数目。前 者可W通过对内参RNA的同时测定来排除样本杂质对PCR效率的影响，但迄今还没能发现 理想的内参标准。后者可W给出更易于理解的miRNA拷贝数，但需要分别测定的校正曲线 进行勘校，不能排除样本杂质对PCR效率的影响，因此也对纯化RNA的质量要求极高，难于 大规模应用和客观重复。
[0008]RNA提取步骤给循环miRNA定量测定造成很大的误差和不确定性。McDonald等人 测定RNA纯化步骤对相同血清样本含量颇丰的miR-15b、miR-16、miR-24的定量结果的误 差达到1倍W上（McDonald, 2011)。不同个体或不同处理的血清样本更会对定量结果产生 不可预估的影响。RNA提取步骤带来的测定误差，也与提取的方法和不同商家的提取试剂 盒有关。化unet-Vega等人分析了用5种RNA提取试剂盒分离纯化的血浆RNA中miR-18a/ miR-21/miR-29a的含量，尽管PCR步骤的重复性很好，不同样本间参入的合成RNA参照物的 测定误差超出了容忍的范围，总有一些miRNA的PCR扩增效率受到不同程度的影响，掲示了 使用外源合成RNA参照物衡量血浆miRNA水平的难度度runet-Vega，2015)。
[000引循环miRNA定量测定结果的客观性和重复性，受到样本类型、个体差异、RNA提纯 及所使用的miRNA测定技术平台的影响。miRNA定量检测方法的客观性、灵敏度及标准化是 将研究成果转化为临床疾病诊断应用的瓶颈和关键，对过去8年循环miRNA研究结果的总 结，一致认为miRNA的测定技术尚不能满足临床诊断的需求。
[0010] 为了抗衡RNA纯化、样本质量及机器、操作、耗材等外在因素对miRNA测定结果的 影响，本申请的发明人开发了通过DNA片段长度多态性巧光定量分析来完成miRNA的分子 数绝对定量检测的方法（即miRFLP定量分析法）。miRFLP测定法，采用欧米伽引物对样品 中miRNA和内置RNA标准在同一反应管中进行同时检测，由同步测得的标准分子数量为动 态定量的标准尺度，获得待测miRNA的相对峰值，从而滤掉样本杂质和RNA片段对反应效率 的影响，通过对比实测的标准曲线而得到miRNA绝对拷贝数。运样做，对RNA纯度的要求大 大降低，可对未经纯化的样本中少至10个拷贝数的目标miRNA进行直接测定，实现对miRNA 的客观定量测定，参见中国专利申请CN2014103626962，CN2012101083125。但运样的操作， 不能像纯化RNA那样对样本产生富集作用，上样量仅为0. 4μ1，经过PCR反应前的稀释，实 际测定样本体积仅为0.02μ1，产生较大的测定误差，限制了方法的应用。
[0011] 免抽提miRFLP测定法也可直接用于对细胞或血浆裂解液中游离miRNA和蛋白 质复合物中的miRNA进行定量测定，但是，健康人每微升血浆miR-122含量仅为数百个， miRFLP直接测定法需要对样本进行稀释W降低3'适配寡聚核巧酸引物对RT及PCR反应的 影响。miRFLP直接测定法的实际测定最大样本量为0. 02μ1，在412个分子水平时，miR-122 的测定变动范围为21. 7%，因此方法灵敏度和测定误差范围均有待提高。细胞产生的分 泌泡也经血液进行代谢，分泌泡内含有对病理状态更具诊断意义的生物标记物。细胞分泌 泡包含各种细胞组份，有RNA、蛋白质、miRNA前体等，也包括受蛋白质复合物保护的成熟 miRNA。由于受细胞膜的保护，免抽提miRFLP测定法无法测定细胞分泌泡里面的miRNA。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的就在于提供一种改进的miRFLP测定方法，W解决上述问题。
[0013] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是运样的：一种直接对miRNA进行绝 对定量检测的方法，采用miRFLP法，其步骤包括：将待测miRNA样本与动态miRNA标准混合 均匀，然后经过miRNA逆转录、cDNA加尾、PCR同步扩增及PCR扩增产物的巧光片段长度多 态性分析，在所述cDNA加尾步骤中，对适配寡聚核巧酸链3'末端进行修饰。
[0014] 作为优选的技术方案：对待测样本进行预处理，所述预处理采用的预处理试剂为 10%或90%的二甲基亚讽，预处理方式为室溫解育或加热处理。具体方法为：将待测miRNA 样本与预处理试剂混合，室溫解育或加处理，然后再与动态miRNA标准混合。
[0015] 作为优选的技术方案：所述对适配寡聚核巧酸链3'末端进行修饰的方法为碳链 修饰或氨基修饰或增加一个与所述适配寡聚核巧酸链序列相同的寡聚核巧酸链。
[0016] 作为优选的技术方案：对miRNA逆转录产物及PCR反应物进行富集。
[0017] 作为进一步优选的技术方案：富集时采用生物素-琼脂糖链霉素偶联试剂或链霉 素磁珠。
[001引作为优选的技术方案：所述待测miRNA样本为含有miR-122的样本。