[0019] 作为进一步优选的技术方案：所述待测miRNA样本来自血浆、血清、血液或体液， 待测miRNA样本不经过RNA提取，直接进行检检测。
[0020] 作为进一步优选的技术方案：所述待测miRNA样本中加入细菌RNA。
[0021] 作为进一步优选的技术方案：在低溫冷冻保存样本时，加入10%的二甲基亚讽W 保持细胞分泌泡的完整性
[0022] 作为更进一步优选的技术方案：所述待测miRNA样本中加入表面活性剂，在75°C下保溫3min，W释放受蛋白质保护的miRNA。
[0023] 作为优选的技术方案：所述miRNA逆转录过程中，采用的引物为经过生物素标记 的欧米伽引物。
[0024] 现有的miRFLP定量分析方法，其步骤如图1中A所示，首先利用欧米伽引物对 miRNA进行逆转录，WmiRNA为模版合成出相应的欧米伽引物次生探针。用含有与相应次生 探针序列和PCR祀点序列互补的适配寡聚核巧酸链（adapter)为模版，利用新生成的欧米 伽引物次生探针进行cDNA加尾，形成PCR扩增模版。最后用一对巧光标记的PCR通用引物 对反应中所有PCR扩增模版进行竞争性同步扩增，完成miRFLP的反应步骤。该方法的缺陷 是适配寡聚核巧酸链既可W作为欧米伽次生引物的模版，也可用作为DNA合成引物。利用 产物的长度，适配寡聚核巧酸链作为欧米伽次生引物的模版可W精确地区分成熟miRNA与 其前体产生的片段，但作为引物时，不能区分miRNA的成熟体及前体的降解产物。本发明对 适配寡聚核巧酸链的3'末端进行了一系列的修饰，阻止适配寡聚核巧酸引发的多聚反应。 采用的修饰方法可W是对适配寡聚核巧酸链3'末端进行修饰，如碳链修饰，可W改造寡核 巧酸的空间距离，修改和抑制DNA聚合酶活性；必要时也可W加长碳链长度，达到所需的效 果。其它的修饰方法如对适配寡聚核巧酸链3'末端进行氨基修饰等，也可达到同样的效果。 在适配寡聚核巧酸链的3'末端加上一个序列相同的寡聚核巧酸短链，如：AATTAAA，也可起 到阻止DNA聚合酶活性的功效。运样3'末端修饰过的适配寡聚核巧酸链，只能用作模版， 用于对待测miRNA的长度进行精确分析，本发明的定量分析检测方法如图1中的B所示，在 适配寡聚核巧酸3'末端加上不同的序列，也能使从适配寡聚核巧酸链产生的PCR产物用长 度差异加W区分。
[00巧]欧米伽引物可W专一识别miRNA3'末端，低溫杂交条件下高效地逆转录捕获的miRNA;适配寡聚核巧酸链序列与目标miRNA的序列互补，可W识别miRNA5'末端。miRNA前 体等RNA片段可能生成的欧米伽次生探针与adapter序列产生错配，或无法延长，或产生不 同长度的PCR扩增模版。
[0026]本发明中，优选采用生物素标记的欧米伽引物对短链RNA进行捕获，RT反应，然后 用琼脂糖链霉素或链霉素磁珠进行纯化，使样本的实际上样量达到0. 4μ1，并因此大大改 善了方法的测定误差。
[0027]游离RNA极易受到核酸酶攻击而降解，难于保存和定量，一直是RNA临床诊断应用 的难题。循环miRNA受蛋白质包裹保护，部分循环miRNA还可能进一步受到细胞分泌泡脂质 膜的保护，因而异常的稳定。将miRNA从蛋白质中释放后用RNA酶抑制剂巧I)保护，可直接 进行测定，避免样本收集、运输、保存、RNA纯化过程带来的丢失和降解。已有用RT-qPCR技 术对血清样本中miRNA利用高浓度表面活性剂（1. 25%Tween-20)裂解，直接测定的实验报 道，但没有考虑到样本个体差异和酶反应效率的影响，高浓度表面活性剂对反应的抑制，因 而没有实用价值。利用内置标准RNA的miRFLP测定法可W排除样本个体差异和反应效率 的影响，客观地对不同样本中的miRNA释放处理后直接进行定量测定，避免了RNA的提取， 简化操作，避免RNA丢失和降解，降低测定误差和增加测定的重复性。
[0028] 血浆样本中核酸酶活性各不相同，加上循环miRNA的含量低，因此，核酸酶的降解 W及试管管壁的吸附均可对定量结果带来不可预期的影响。本发明的免提取miRFLP直接 测定法，优选利用细菌RNA作为保护载体对血浆进行稀释，对样本进行保护，增加测定的重 复性，尤其是对低含量循环miRNA的测定。所述细菌可W采用大肠杆菌D册a等等。原核生 物不产生miRNA，因此任何一种细菌产生的RNA均可用于本发明作为miRNA测定时的RNA保 护载体。测试结果表明，Wng/μ1的细菌RNA对表2是对用TRIZol试剂纯化的肝损伤患者 血浆RNA和血浆直接测定结果的比较。由于RNA纯化过程的丢失和降解，纯化RNA的定量 结果低于血浆直接测定的结果，仅为直接测定结果的33. 5% -38. 9%。人工合成RNA或M2 隧菌体RNA等不含有待测miRNA片段的RNA均可作为细菌RNA的代替物。
[0029] 经过上述改进的免提取miRFLP直接测定法在检测的专一性、灵敏度和重复性方 面均有提高，可用与于对血浆中循环miR-122和循环miR-451的直接测定。对25个健康人 血浆测定结果显示，女性循环miR-122的平均值为每微升血浆1409个分子，男性每微升血 浆含3169个分子。对运两组数据进行t-检验，得出的P值为0. 046,显示二者的差别具有统 计意义。而血浆miR-122水平与年龄的统计结果显示没有关联。与常用的肝损伤血清学指 标ALT、AST等相比，循环miR-122显示出更好的灵敏度。对8个ICU住院病人血浆miR-122 的测定结果，证实循环miR-122高表达是一个普遍现象。
[0030] 血浆miRNA可W在低溫条件下长期保存，并在经历了 10次W上的反复冻融后，纯 化RNA为测定样本，含量不会发生明显的改变。miRNA在血浆中的存在形式有两种，大部分 血浆miRNA嵌合于ago蛋白质内，如血浆中的miR-122/21/155等，成熟miRNA主要被蛋白 质包裹的形式存在（游离miRNA);而let-7/miR-451等则除了被蛋白质包裹，还进一步被 细胞分泌泡裹挟。细胞分泌泡的多寡与被检测目标的生理病理状态有关，如肿瘤病人血浆 中细胞分泌泡的数量就比正常人高出数倍。目前还没有直接的测定方法对DNA、RNA和蛋白 质在血浆中不同存在形式的数量比例作出准确的评估。免抽提miRFLP测定法利用加热松 散蛋白质结构，释放出miRNA,并进行定量测定，因为表面活性剂含量甚微，不破坏膜结构， 因而不能测定细胞分泌泡中的RNA。因此，miRFLP测定法测定的是自由态的、蛋白质包裹的 miRNA。在不加入冻存保护剂时，反复冻融对细胞分泌泡膜结构造成破坏，释放出的miRNA 会增加血浆中能被免抽提miRFLP检测法检测到的。
[0031] 活细胞冻存时，优选加入冻存保护剂，如二甲基亚讽或甘油，增加膜的通透性，避 免微晶的形成，降低细胞受冻融过程所受的损伤。没有冻存保护剂，反复冻融对细胞膜结构 造成破坏，破坏的程度与冻融次数有关。细胞分泌泡（exosome)的膜成份来自细胞膜，二者 具有相同的特性。用反复冻融的方法处理，血浆中细胞分泌泡裹挟的内含物可W随着膜结 构的破坏而释放，增加样本中能被免抽提miRFLP检测法检测到的miRNA的数量。10%的 二甲基亚讽避免水溶液形成微晶，增加细胞膜的通透性，广泛应用于细胞的冻存保护；血浆 中加入10%的二甲基亚讽可W在低溫冻存时保存细胞分泌泡的完整性，可用于区分细胞分 泌泡内外的物质成份及含量的分别测定。高浓度二甲基亚讽使蛋白质变性，并在浓度达到 93%时使蛋白质完全结晶，灭活核酸酶。含90%二甲基亚讽的血浆在20°C溫度下不影响细 胞分泌泡的膜结构，加热后，膜结构被破坏，miRNA游离出来，增加被检测目标的浓度，测定 结果与经过6次及W上的冻融处理引起血浆miR-122/451浓度的升高一致。含90%二甲 基亚讽的血浆，经加热处理，可释放出细胞分泌泡内的物质，具有与经过6次及W上反复冻 融相等的效果。含10%二甲基亚讽的血浆在20°C的低溫条件下对RT及PCR反应没有抑制 作用，并增加细胞膜的通透性，降低miRFLP测定处理过程中对膜结构的损伤。在本发明中， 10%浓度的二甲基亚讽用于血浆冷冻保存时对细胞分泌泡完整性的保护，和游离蛋白质包 裹的miRNA的测定；90%浓度的二甲基亚讽则用于对细胞分泌泡包裹的miRNA或RNA或DNA 的测定。
[0032] 本发明进一步应用是制备任何用于miRNA测定的试剂或试剂盒套装。本发明可W 单独进行商业化利用，也可W作为特定应用试剂盒的组成部分。本发明也包括在任何试剂 盒、服务、指导和手册中利用免抽提miRFLP直接测定法对待测miRNA相对巧光强度的计算 方法。也包括在任何试剂盒、服务、指导和手册中利用对数回归方程模型作为miRNA相对巧 光强度-miRNA分子数校正曲线换算miRNA绝对数目的计算方法。
[0033]W上的描述说明仅WmiR-122为例，不应解读为对本发明应用范围的限制。成熟 miRNA、siRNA具有与miR-122-样的物理、化学特性，将上述的miR-122改为miRNA或siRNA 一样适用。本发明也适用于鉴定各种大分子RNA中的一段或几段较小的序列，从而达到对 体液中各种不同RNA片段的定性、定量测定。
[0034] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0035] (1)利用3'修饰的适配寡聚核巧酸，降低反应背景信号，避免RNA3'末端同源序列 的干扰；
[003引 似利用比如生物素-链霉素偶联试剂对RT及PCR反应物进行富集，增加上样量， 减低方法误差；
[0037] 做加入细菌RNA作为保护试剂，降低测定误差；
[003引 （4)经过改进的miR化P直接测定法可W对0. 4μ1血浆进行直接测定，比现有的方 法提高了 20倍；在128个分子的测定水平时，测定变动范围降低至9. 9%，比现有的方法降 低50%W上，检测的专一性、灵敏度和重复性方面均有显著提高。
[0039] (5)利用90 %浓度的二甲基亚讽对样本预处理，可W对游离miRNA和细胞分泌泡 内含miRNA的进行区别定量测定。
【附图说明】
[0040] 图1 :miRFLP的测定原理图；
[0041] 图中A为现有的即改进前的miRFLP的测定原理；B为本发明即改进后的miRFLP的 测定原理；
[0042] 图2 :不同浓度SDS、TritonX-100W及Tween-80对miRFLP测定法的影响。
[0043] 图3:免抽提miRFLP直接测定法测定血浆miR-122浓度的线性范围评估结果图。
[0044] 图4 :冻融次数对血浆miR-122浓度测定的影响。