一种检测鲜活农产品中致病菌的五重pcr检测方法及其检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及食品检测技术领域，特别设及一种检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR检测方法。
【背景技术】
[0002] 鲜活农产品是我国消费者除粮食外最主要的食物营养来源，在日常生活中占据着 举足轻重的位置。鲜活农产品在原料，加工，储藏，运输过程中容易受到多种病原微生物 (主要是细菌和真菌）的侵染。因微生物侵染产生的病害发生后的交叉感染会造成果蔬的 大量损失，失去商品价值，极大地限制了果蔬产业的发展。同时被各种病原微生物污染的鲜 活农产品一旦被消费者购买、食用会造成食物中毒，疾病传播等严重后果，危害食品安全， 给消费者的身体健康和生命安全带来巨大威胁。
[0003]基因忍片检测微生物的基本原理是在忍片表面合成待检验微生物的特异性核酸 探针，微生物样品DNA经巧光标记PCR扩增，然后再与忍片上寡核巧酸点杂交，最后通过扫 描仪分析巧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。与传统的检测方法（细 菌培养、生化鉴定、血清分型等）相比，基因忍片技术的先进性主要体现在：①基因忍片可 W实现微生物的高通量和并行检测，一次实验即可得出全部结果；②操作简便快速，整个检 测只需24h基本可W出结果（而传统方法一般需4~7d);③特异性强，敏感性高。
[0004] 多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR的基础上加W改进，于一个PCR反应体 系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的 PCR技术。采用运一技术可同时扩增多种病原微生物特异核酸序列，可大大提高病原微生物 的检测效率。目前同时对食品或食源性疾病多种病原菌进行分子诊断时常常采用多重PCR 方法，因为该方法可同时检测3~4种病原菌，既提高检测速度降又降低了检验成本，由此 得到广泛应用。但传统的多重PCR体系中，由于存在多对引物，引物之间的干扰W及引物 与模板的错配而造成灵敏度下降与非特异性扩增反应增加等问题，制约多重PCR技术的发 展。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR检测方法，结合 多重PCR技术和基因忍片技术，可同时检测沙口氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大 肠杆菌0-157和单核细胞增生李斯特菌等5种致病菌，该方法具有准确性高，灵敏度高，特 异性强，高效快速等优点。
[0006]本发明还提供了检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR检测试剂盒。
[0007]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008]-种检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR检测方法，提取样品增菌液DNA模板，W 5对引物对提取的DNA模板进行五重PCR反应，在五重PCR反应过程中加入巧光标记分子， 得到的携带巧光标记PCR产物与基因忍片上合成的杂交探针进行杂交反应，清洗后，通过 扫描忍片上的巧光信号即可快速检测致病菌；
[0009] 5对引物对分别为：
[0010] 沙口氏菌正向引物，序列信息见SEQIDNo.1所示，沙口氏菌反向引物序列信息见 沈Q IDNo.2所示；
[0011] 金黄色葡萄球菌正向引物，序列信息见SEQIDNo. 3所示，金黄色葡萄球菌反向引 物序列信息见SEQIDNo. 4所示；
[0012] 大肠杆菌0-157正向引物，序列信息见SEQIDNo. 5所示，大肠杆菌0-157反向引 物序列信息见SEQIDNo. 6所示；
[0013] 副溶血弧菌正向引物，序列信息见SEQIDNo.7所示，副溶血弧菌反向引物序列信 息见SEQIDNo. 8所示；
[0014] 单核细胞增生李斯特菌正向引物，序列信息见SEQIDNo. 9所示，单核细胞增生李 斯特菌反向引物序列信息见SEQIDNo. 10所示。
[0015] 本发明针对沙口氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌0-157和单核细 胞增生李斯特菌，筛选出各个菌种种间特异性强同时种内保守性强的基因区段设计引物。 引物特异性强，本发明特定设计的5对引物对，引物之间的干扰小，非特异性扩增反应少， 保证了检测的灵敏度与特异性，既提高检测速度降又降低了检验成本。
[0016] 作为优选，五重PCR反应体系W总体积50μL计，其组成如下：
[0017] lOXEx Taq buffer 10 μ L,
[001引 dATP 1.0化，
[001引 dTTP 1.0化，
[0020] dGTPΙ.ΟμΙ,
[0021] dCTP 0. 75μL,
[0022] cy3-dCTP2. 0μL,
[0023] 引物混合物5.0 μ L，
[0024]DM模板 20ng或lOng，
[00巧]Ex Taq酶0. 5 μ L，
[0026](1地2〇补足至50yL。
[0027] 本发明在反应体系中渗入一定比例的cy3-dCTP是为了在PCR产物中渗入巧光素， 在后续的杂交反应中，如果带有巧光素的PCR产物与忍片上的探针成功杂交，则在杂交清 洗完毕后，W扫描仪对忍片进行扫描时（扫描波长根据染料进行选择，比如cy3采用532nm) 成功杂交的探针位置会发巧光，从而可W得知样品中是否存在探针对应的细菌。
[0028]作为优选，dATP、dTTP、dGTP及dCTP浓度均为 2. 5mmol/l，(：y3-dCTP浓度为Inmol/ μLExTaq酶浓度为抓/μL。
[0029] 作为优选，所述引物混合物的由W下浓度为20mmol/L的各引物混合而成：
[0030] 沙口氏菌正向引物19 μ L沙口氏菌反向引物19 μ L ;
[0031] 金黄色葡萄球菌正向引物20 金黄色葡萄球菌反向引物20μL;
[0032] 大肠杆菌0-157正向引物7. 3化，大肠杆菌0-157反向引物7. 3μL;
[0033] 副溶血弧菌正向引物20μL副溶血弧菌反向引物20μL;
[0034] 单核细胞增生李斯特菌正向引物20μ以单核细胞增生李斯特菌反向引物20μL。
[0035] 作为优选，五重PCR反应的条件为：95°C预变性2min，95°C30sec;55°C30sec; 72°C30sec;35个循环，72°C补充延伸lOmin;4°C保持。
[0036] 作为优选，清洗溫度为40°C。清洗忍片溫度确定为40摄氏度来降低忍片总体的背 景值，相对提高探针杂交的特异性。
[0037] 作为优选，针对沙口氏菌的探针有20个，序列见SEQIDNo. 132~151所示；针对 金黄色葡萄球菌的探针有24个，序列见SEQIDNo. 108~131所示；针对大肠杆菌0-157的 探针有25个，序列见SEQIDNo. 11~35所示；针对副溶血弧菌的探针有46个，序列见SEQ IDNo. 62~107所示；针对单核细胞增生李斯特菌的探针有26个，序列见SEQIDNo. 36~ 61所示。
[0038] 一种检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR检测试剂盒，包括五重PCR反应体系，所 述五重PCR反应体系W总体积50μL计，其组成如下：
[0039]lOXExTaqbuffer10μL,
[0040]dATPΙ.ΟμΙ,
[0041]dTTPΙ.ΟμΙ,
[0042] dGTP Ι.ΟμΙ,
[0043]dCTP 0. 75μL，
[0044]cy3-dCTP2. 0μL,
[0045] 引物混合物5.0 μL^，
[0046]DM模板 20ng或lOng，
[0047]ExTaq酶 0. 5μL，
[0048] (1地2〇 补足至 50yL。
[0049]作为优选，dATP、dTTP、dGTP及dCTP浓度均为 2. 5mmol/l，(：y3-dCTP浓度为Inmol/ μLExTaq酶浓度为抓/μL。
[0050] 作为优选，所述引物混合物的由W下浓度为20mmol/L的各引物混合而成：
[0051] 沙口氏菌正向引物19化，沙口氏菌反向引物19μL;
[0052] 金黄色葡萄球菌正向引物20 金黄色葡萄球菌反向引物20μL;
[0053] 大肠杆菌0-157正向引物7. 3化，大肠杆菌0-157反向引物7. 3μL;
[0054] 副溶血弧菌正向引物20μL副溶血弧菌反向引物20μL;
[00巧]单核细胞增生李斯特菌正向引物20 单核细胞增生李斯特菌反向引物20μL;
[0056] 沙口氏菌正向引物，序列信息见SEQIDNo. 1所示，沙口氏菌反向引物序列信息见 SEQIDNo. 2所示；金黄色葡萄球菌正向引物，序列信息见SEQIDNo. 3所示，金黄色葡萄球 菌反向引物序列信息见SEQIDNo. 4所示；大肠杆菌0-157正向引物，序列信息见SEQID No. 5所示，大肠杆菌0-157反向引物序列信息见SEQIDNo. 6所示；副溶血弧菌正向引物， 序列信息见SEQIDNo. 7所示，副溶血弧菌反向引物序列信息见SEQIDNo. 8所示；单核细 胞增生李斯特菌正向引物，序列信息见SEQIDNo. 9所示，单核细胞增生李斯特菌反向引物 序列信息见SEQIDNo. 10所示。
[0057] 本发明的有益效果是：本发明结合多重PCR技术和基因忍片技术，可同时检测沙 口氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌0-157和单核细胞增生李斯特菌等5种 致病菌，该方法具有准确性高，灵敏度高，特异性强，高效快速等优点
【附图说明】
[0058] 图1是巧光多重PCR验证结果图；图中：1、五种菌混合，2、副溶血弧菌（理论扩 增长度44化P) 3、沙口氏菌（理论扩增长度93化P)，4、金黄色葡萄球菌（理论扩增长度 547bp)，5、单核细胞增生李斯特菌（理论扩增长度958bp)，6、大肠杆菌0-157 (理论扩增长 度 350bp)，L、Marker。
[0059] 图2是沙口氏菌巧光多重PCR产物杂交结果图。
[0060] 图3是金黄色葡萄球菌巧光多重PCR产物杂交结果图。
[0061] 图4是大肠杆菌0-157巧光多重PCR产物杂交结果图。
[0062] 图5是副溶血弧菌巧光多重PCR产物杂交结果图。
[0063] 图6是单核细胞增生李斯特菌巧光多重PCR产物杂交结果图。
【具体实施方式】
[0064] 下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案