对类志贺邻单胞菌8种o抗原分型的基因液相芯片及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种对样品中类志贺邻单胞菌8种菌株0抗原分型的基因液相忍片及 其制备方法。本发明还设计利用所述的基因液相忍片进行检测的方法。
【背景技术】
[0002] 液相忍片，也称为微球体悬浮忍片（suspensionarray,liquidchip),是基于 xMAP技术的新型生物忍片技术平台，它是在不同编码的微球上进行抗原-抗体、酶-底物、 配体-受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告巧 光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可W完成多达100种不同的生物学反应，是继 基因忍片、蛋白忍片之后的新一代高通量分子检测技术平台。迄今为止十年时间，全球已有 数百套基于xMAP技术的检测平台用于免疫性、蛋白质、核酸就爱南侧、基因研究等领域，该 技术已经成为一种新的蛋白质组学和基因组学研究工具，也是最早通过美国食品与药物管 理局（抑A)认证的可用于临床诊断的生物忍片技术。
[0003] 利用液相忍片检测时，先后加入样品和报告分子与标记微球反应，样品中的目的 分子能够与探针和报告分子特异性结合，使交联探针的微球携带上报告分子藻红蛋白，随 后利用仪器巧日Luminex100)对微球进行检测和结果分析。Luminex100采用微流技术使 微球快速单列通过检测通道，并使用红色和绿色两种激光分别对单个微球上的分类巧光和 报告分子上的报告巧光进行检测。红色激光可将微球分类，从而鉴定各个不同的反应类型 (即定性);绿色激光可确定微球上结合的报告巧光分子的数量，从而确定微球上结合的目的 分子的数量（即定量)。因此，通过红绿双色激光的同时检测，完成对反应的实时、定性和定 量分析。
[0004] 志贺邻单胞菌，是一种革兰氏阴性菌，隶属于肠杆菌科邻单胞菌属。类志贺邻单胞 菌在水、鱼类、多种哺乳动物及人类肠道中发现，能引起人的腹泻，是一种重要的肠道致病 -tt： 园〇
[0005]目前对类志贺邻单胞菌的分型鉴定主要根据有：细菌的形态学特征、细菌的生理 生化特征、血清学反应等方法，类志贺邻单胞菌的0抗原分型属于血清学反应的一种。由于 环境和抗体的多样性，形成了0抗原的多样性，而根据0抗原的多样性可W对类志贺邻单胞 菌的不同菌株进行分型鉴定。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的就是提供一种检测环境中八种致病微生物的基因液相忍片，该 忍片包括：巧光编码的微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链霉亲和素-藻红蛋白。其主 要特征在于所述的捕获探针包含从W下序列中选取的一种或多种序列： (1)从类志贺邻单胞菌W义W7,化次化&W义W7, 075, 076八种菌的0抗原基因簇 特异基因序列中所选取的核酸序列； (2)所述（1)中选取的DM序列的互补DM序列。
[0007] 其中上述的基因液相忍片的从类志贺邻单胞菌W义W7,化次化&W义W7, 075， 076八种菌的0抗原基因簇特异基因序列中所选取的核酸序列中所选取的核酸序列具有从 869 10^:17-沈9 10^:24所示的0臟序列中的一种或多种0臟序列； 另外，上述检测液相忍片还包括所述的引物序列：具有SEQIDNO: 1-SEQIDNO: 16所 示的一条或多条引物顺序；基因液相忍片的制备方法，包括核酸提取、微球偶联、PCR扩增 及上机检测； 本发明的一个重要目的就是液相忍片的实际应用，其特征在于该液相忍片用于类志贺 邻单胞菌W义W7,化次化&W义W7, 075, 076八种菌中至少一种的类志贺邻单胞菌分型 鉴定； 由上述的技术方案可见，本发明首次将液相忍片技术引入类志贺邻单胞菌0抗原分型 领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的样品中8种类志贺邻单胞菌0血清型检 测液相忍片及其检测方法，利用本发明的液相忍片可W达到鉴定样品中常见的类志贺邻单 胞菌0血清型菌株的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，该发明对于各级医疗部口 实时快速检测样品中类志贺邻单胞菌0抗原分型具有重要的应用价值。
[0008]
【附图说明】： 图1八种菌探针特异性比较； 图2类志贺邻单胞菌026液相忍片灵敏度检测； 图3类志贺邻单胞菌075液相忍片灵敏度检测； 图注：图1-3中W义W7,化次化&W义W7, 075, 07刮戈表类志贺邻单胞菌0血清型 八种菌株。
[000引 实施方式 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解运些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。本发明所用到的类志贺邻单胞菌菌种来源如下表1所示： 表1本实验所用到的菌种
a,CNCTC:CzechNationalCollectionofTypeCultures,theCzech民epublic实施例1 引物、探针的设计与制备 1、探针的筛选 特异性探针是整个液相忍片技术核屯、部分，一般采用先设计特异性探针，然后再根据 探针位置来设计相应的引物。由于后期多重PCR的要求，因此在前期设计探针时，应注重保 证探针的长度控制在18bp左右，GC含量控制在30-60%。前期设计探针时，利用生物信息学 脚本对0抗原基因簇中特异基因进行多重比对，对每一个祀基因设计了多条特异探针运样 不仅保证可W筛选出既保守又特异的探针，还能更加确保检测结果的可靠性。要想得到既 保守又特异的探针如果仅仅靠生物信息学分析是远远不够的，有时候很符合上述条件的探 针在实际杂交过程中却得不到稳定的阳性信号。因此设计好的探针必须经过实际忍片上机 检测进行反复的筛选，才能保证真正有效地探针。
[0010] 本研究经过反复多次的实验筛选，最终获得了每种菌特异的探针序列，如表2所 示： 表2本发明基因忍片上选用的寡核巧酸探针序列及可检测出的致病菌
2、特异基因的筛选 类志贺邻单胞菌0抗原通过两种途径合成0抗原，一种是wzy依赖型途径合成0抗原， 另一种是通过ABC-transporter途径合成0抗原。在前者中，wzx/w巧基因是十分特异的， 可W直接作为设计探针的候选基因，而在后者中，因为没有像wzx/wzy运么特异的基因，所 W只能选择相对特异的基因，通常会是一些稀有的单糖基因或者是糖基转移酶。本发明通 过对基因簇中所有的基因进行all_vs_all_blast的方法，进行比对，特异基因的匹配数必 然会远小于保守基因。综合上述方法找到特异基因并对其设计探针引物。
[0011] 3、引物的设计 W挑选出来的八种类志贺邻单胞菌的特异基因为模板设计液相忍片引物。利用Primer Premier5.0设计引物，设定好引物的长度、引物类型、碱基数目等参数后运行软件，从输出 结果中找出Tm值=50°C±3°C、碱基数在18-25bp之间、引物间无二聚体、引物内部无二级 结构且扩增片段包含探针序列的引物。并且最终要保证所有引物PCR扩增出来的目的片段 在100~300bp之间。利用设计好的引物多重PCR，最终得到的引物如表3所示： 表3忍片所用到的引物：
实施例2 基因液相忍片的制备 1、 选取编码微球（bio-rad或Luminex公司），每一条探针对应一个微球编号，8种类志 贺邻单胞菌的8条探针就需要8个不同的微球编号，如075号微球偶联大肠杆菌012血清 型的探针，取约1. 25X106个置于离屯、管，12000巧m/min，离屯、3-5分钟，小屯、移去上清； 2、 加入10uL0. 1M的2- (η-吗嘟代）乙横酸溶液，充分震荡混匀，稍微离屯、； 3、 用蒸馈水将合成的寡核巧酸探针稀释至0.Immol/L;加入4uL稀释类志贺邻单胞菌 012血清型的探针于075号微球悬浮液中，振荡混匀； 4、 加入2. 5uL新鲜配制的lOmg/mL的邸C溶液至微球与探针混合液中，振荡，室溫避 光解育30分钟； 5、 重复步骤4; 6、 用 1 血 0. 02%Tween20 洗涂一次，12000巧m/min离屯、3-5 分钟； 7、 小屯、弃上清，微球重悬于1mL0. 1%SDS中，振荡混