专利名称：：一种福氏志贺氏菌噬菌体菌株及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种噬菌体菌株及其应用，尤其是能够特异性裂解福氏志贺氏菌(SWge//a_/fecweW)的噬菌体及其应用。属于生物工程领域。
背景技术：
：志贺氏菌是胃肠疾病感染的主要病原菌之一，志贺氏菌属分4个种，至少47个血清型，其中福氏志贺菌(SWge^^/fec股W)是发展中国家痢疾发病的优势菌，每年全球约有1.64亿人发病，死亡人数高达110.6万，并且69%为5岁以下儿童。研究表明，由福氏志贺氏菌导致的儿童腹泻主要是误食了被福氏志贺氏菌污染的食物。目前，细菌污染是食品安全以及食品生产工业中存在的严重问题，由细菌污染引起的食物中毒死亡人数仍有上升趋势。面对日益严重的耐药毒株的出现，利用抗生素来防止细菌污染已经不是最佳防控方法。耐药毒株会在环境中进化并产生，抗生素的开发远不及耐药毒株出现的速度。因此，由细菌污染食品引起的中毒检测表明，导致疾病产生的源头来自于抗生素滥用所产生的耐药细菌。噬菌体是一类细菌依赖性的病毒，又称细菌病毒。裂解性噬菌体感染细菌后，可在宿主菌内快速增殖，并使之裂解，故又称毒性噬菌体。福氏志贺氏菌噬菌体可以特异性感染并裂解福氏志贺氏菌，因而具有杀菌作用。在感染模型中，噬菌体能够特异杀死福氏志贺氏菌；而在食品中，噬菌体能够作为抗菌剂来控制细菌污染，具有潜在的开发价值。
发明内容本发明的目的在于针对目前人们在防治福氏志贺菌(幼扭//"Ax"^/)引起的腹泻时，使用抗生素容易导致耐药致病菌进化并产生，提供一种新的能够特异性裂解福氏志贺氏菌的噬菌体及其应用。本发明的目的是这样实现的一种噬菌体菌株，其特征在于保藏号为CCTCCNO:M209029，该菌株对福氏志贺氏菌有强的裂解作用。在本发明中噬菌体菌株在405(TC中放置30min，其活性稳定；在9(TC中放置则失活；噬菌体菌株在pH5.09.0环境下，其活性稳定；4"C保存至180d，其效价降低10倍；-2(TC至-7(rC保存180d后，活性稳定；噬菌体菌株保存的保护剂为含10%或2(P/。甘油的SM溶液。一种上述噬菌体菌株的应用，其特征在于将噬菌体菌株纯化和扩增培养后，用于抑制福氏志贺氏菌。在噬菌体菌株的应用中用于抑制福氏志贺氏菌是指将纯化的噬菌体用水稀释至浓度》10Vfo/ml的喷洒液或淋洗液，用于对生产环境或生产器具的喷洒或消杀，防止食品加工过程中造成的福氏志贺氏菌污染。在噬菌体菌株的应用中用于抑制福氏志贺氏菌是指将纯化的噬菌体作为食品添加剂，在配料时加入10"pfii/ml或10fU/g浓度的纯化的噬菌体，用于防止食品储存过程中福氏志贺氏菌的生存和繁殖。在噬菌体菌株的应用中所述的食品是指由肉类，或蛋类，或奶制品，或粮食，或蔬菜，或它们之间的组合加工的固体或液体类食品。在噬菌体菌株的应用中用于抑制福氏志贺氏菌是指将纯化的噬菌体用水稀释至浓度》l(^pfil/ml后，作为消杀剂用于畜禽舍养殖区对福氏志贺氏菌的消杀和抑制。在噬菌体菌株的应用中用于抑制福氏志贺氏菌是指将纯化的噬菌体与赋形剂复配后，作为治疗由福氏志贺氏菌导致腹泻的药物。在噬菌体菌株的应用中所述的赋形剂为制药领域普遍使用的缓冲液、金属离子、表面活性剂。本发明的优点在于由于采用噬菌体特异性裂解福氏志贺氏菌可以杀死具有耐药性的福氏志贺氏菌；由于采用噬菌体特异性裂解福氏志贺氏菌能够防止福氏志贺氏菌进化和耐药毒株的产生；由于本发明涉及的噬菌体菌株具有亲水相，通过传统的方法很容易配制成喷洒液或淋洗液，对环境或器具进行消杀；由于本发明涉及的噬菌体菌株没有毒副作用，可以作为食品添加剂或药物，特异性裂解福氏志贺氏菌，防止福氏志贺氏菌对食品的污染，治疗由福氏志贺氏菌引起的疾病。图1是纯化SH72噬菌体双层平板检测结果；图2是不同温度对噬菌体的影响；图3是不同pH对噬菌体的影响；图4在4'C条件下，MOI为100时噬菌体在肉中的杀菌效果；图5在-20°(:条件下，MOI为100时噬菌体在肉中的杀菌效果；图6噬菌体在牛奶中的杀菌效果检测结果。具体实施例方式本发明试验用噬菌体宿主菌保藏于广东省微生物研究所菌种保藏中心，保藏号CMCC51572。购自广东省微生物研究。本发明试验用LB培养基(购自青岛高科园海博生物技术有限公司)、氯仿(上海化学试剂有限公司)。实施例l、噬菌体的分离制备本发明样品采自江苏省农业科学院养猪厂清洗场地污水，经双层滤纸过滤，3000xg.min"离心20min，再用0.22pm滤膜过滤上清。取50ml过滤上清，加入2ml噬菌体宿主菌过夜培养物，再加入CaCl2母液(已过0.22pm滤膜除菌)至终浓度lmM混匀后，加入20mlLB培养基，室温作用lh，再放置于37。C培养1216h。次日，取上述培养物以14000xg.mii^离心30min,取上清；14000xg.min"再次离心20min，取上清加入0.1%氯仿，形成噬菌体原液。将普通营养琼脂平板分为2个区域:吸取宿主菌液O.lml滴于普通营养琼脂平板正中央，将菌液均匀地涂开；待其晾干后，滴噬菌体原液0.05ml于其中一个区域，并将其涂布均匀；待自然晾干后，置于37'C温箱培养10h后，观察两个区域的变化。同时设立对照，对照中仅涂噬菌体原液，以鉴定噬菌体中是否含有宿主菌。取噬菌体原液O.lml，进行10倍稀释，取102、104和1(^稀释液各0.1ml与过夜培养的宿主菌液O.lml混匀，室温作用15min后，加入约5ml0.7%LB培养基，混匀后迅速倾倒入LB培养基平板上层，摇匀平置5min，待其凝固，置于37'C温箱培养12h后5观察，获得形成噬菌斑的双层平板。实施例2、噬菌体的纯化培养和扩增在形成噬菌斑的双层平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，用接种针穿刺目的噬菌斑，将穿刺后接种针伸入35mlLB培养基中，重复35次后，加入噬菌体宿主菌液O.lml，混匀，室温作用15min，37。C培养1014h，14000xg.mii!-1，4"C，离心20min，取上清，同时加入0.1ml氯仿，室温作用20min，无菌过滤(0.22nm)上清液；取2ml新鲜培养的宿主菌，离心，0.4mlLB培养基重悬，加O.lml噬菌体(以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1:1、1:10和1:100的比例)。加麦芽糖(0.2%)，MgS04(10mM)，37。C温育20min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入100mlLB液体培养基，其中含有麦芽糖(0.2%)，MgS04(10mM)，37匸摇震培养9-12h;力QO.lml氯仿，37'C继续摇震培养10-20min，获得裂解液。将裂解液转移至离心管，离心8000xg.min人去细菌碎片，取上清液；加RNaseA、DNaseI至lpg/ml，37"C温育30min;力卩9.3gPEG8000，5.8gNaCl，摇匀至溶解，冰浴lh或4。C过夜；4。C离心10000xg.min"20min，去上清液；加2mlSM液，充分洗溶管壁及沉淀，室温作用lh;通过加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬液中的PEG和细胞碎片，温和振荡30s;4'C，3000xg.min—i离心15min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体，双层平板检测纯化噬菌体(见图l)。纯化的噬菌体命名为Sh72，于2009年2月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCNO:M209029，分类命名为福氏志贺氏菌噬菌体Sh72，(幼1顧.phageSh72)。实施例3、温度及pH对噬菌体Sh72稳定性的影响分别取O.lml1X1()Spfii/ml纯化噬菌体于4(rC9(rC水浴作用30min和lh，将样品冰浴冷却后测其效价；分别取pH4.010.0的蛋白胨水和2x109pfU/ml纯化噬菌体等量混合，37'C水浴作用2h后测其效价。结果表明，如图2所示，噬菌体在4(TC和50'C作用30min后，其活性无明显变化；5(TC作用lh，活性有所降低；7(TC作用后，效价降低至初始效价的50%以下；至90'C，几乎失活。噬菌体经不同pH作用后结果如图3，噬菌体在pH5.09.0作用后，其效价均在109以上，其活性无明显变化；当pH为4.0和10.0时，其效价降至5xl()Spfti/ml以下。实施例4、不同保藏温度和保藏溶液对噬菌体SH72的影响将纯化的噬菌体10iVU/ml分别保藏于4t:、-20°(:及-70°(:中，分别于30d、90d、180d检测噬菌体效价。纯化噬菌体分别在SM、生理盐水、含10。/。甘油和20。/。甘油的SM中保存于-20'C，并于180d后进行检测。结果见表l，显示为180d后检测数据，4T:保存至180d，其效价下降一个数量级；-2(TC及-7(rC保存180d后，效价有微弱变化，其活性较稳定。表l不同保藏温度下的噬菌体活性检测温度。c4°C-20°C-70°C保藏前效价(pfij/ml)101110111011保藏后效价(pfia/ml)1.01xl0109.7xl01Ql.llxlO11表2结果表明，噬菌体在SM中保存180d后，效价下降至1.9xl01G;生理盐水中，效价下降至9.3xl09;而在10%及20%甘油SM中，180d后效价与初始效价无显著性差异。由此表明，10。/。和20。/。甘油的SM可作为噬菌体的保护剂。表2不同溶液对噬菌体的效价的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例5、噬菌体宽检测分别取O.lml105纯化噬菌体与大肠杆菌、肠炎沙门菌、痢疾杆菌和福氏志贺菌分离株菌液各O.lml混匀，室温放置15min后，加入上层0.7%LB培养基约5ml，将该混合液迅速倾倒入下层LB培养基平板上，37t:温箱培养1012h后观察噬菌斑形成情况。结果表明大肠杆菌、肠炎沙门菌和痢疾杆菌在双层平板上层培养基生长良好，无噬菌斑形成，而福氏志贺菌分离株中有噬菌斑，说明噬菌体特异性针对福氏志贺氏菌。实施例6、毒力实验8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠，27g土2g，共30只，购自南京大学实验动物中心。随机分为两组，各10只，口服噬菌体10^pfia/0.1ml/只，对照组口服等量PBS，连续口服14d，脱劲致死小鼠，观察内脏、消化道及黏膜变化情况。结果显示，此计量的噬菌体对小鼠日常行为没有影响，解剖检查无异常，且在饲喂结束两天后，在小鼠粪便便中检测不到噬菌体。实施例7、噬菌体在食品中的灭菌实验(不同温度)熟肉制品(卤牛肉)，将其切成约2x2cm的小块(约lg)，将肉块过火焰灭菌；制备5xl04cfii/ml福氏志贺氏菌菌液；制备5xl05pfU/ml(MOI10)、5xl06pfli/ml(MOI100)的Sh72噬菌体样品。无菌环境下，将福氏志贺氏菌菌液以20ul(lxl03cfii/ml)滴于肉块表面，约5min后，滴20pl制备不同浓度的噬菌体(104pfWml、105pfWml)，同时设立福氏志贺氏菌对照；将制备好的样品分别置于4-C和-2(TC，分别于lh、2h、4h、12h、24h检测福氏志贺氏菌数量。结果如图4中所示，4"C作用lh后，与对照组相比较，MOI为10及100的噬菌体均能够杀灭宿主菌，宿主菌数量下降；至2h，已检测不到宿主菌；如图5中所示，-20。C作用lh后，MOI为IO及IOO的噬菌体均能杀灭宿主菌，与对照相比较，宿主菌数量亦有下降，至2h，检测不到宿主菌。实施例8、噬菌体液体中的杀菌作用将巴氏杀菌牛奶，分成两组，A组接种宿主菌105cfWml，同时加入10"mlSh72噬菌体，B组中仅加入宿主菌作为对照，4"C作用30min，60min，90min，120min，240min，300min测定宿主菌数量变化。结果如图6所示，作用30min后，宿主菌数量降至起始接种数量50%以下；至60min，仅检测到约30cfti/ml的宿主菌；至90min，检测不到宿主菌。实施例9、噬菌体体内体外的感染实验挑取福氏志贺氏菌单克隆，经过夜培养后，调整其浓度为109cfWml;以每只108cfii/100^U的剂量口服BALB/c小鼠(8周龄，SPF级，实验前体内福氏志贺氏菌检测为阴性)，并在lh后，口服10、fu/100til剂量的噬菌体(用PBS作为赋形剂)，分别在1211、2411、3611将小鼠致死，取肠道，加入2111185，匀浆，4°。离心400(^8.1^11-120min，取O.lml上清进行稀释，并取不同稀释度涂布SS琼脂平板，计算福氏菌志贺氏菌总量。结果如表4所示，在口服噬菌体12h后，检测到的细菌菌落总数为4.05xl0、fo，显著低于初始接种量；24h及36h后，检测不到福氏志贺氏菌。表4小鼠体内噬菌体杀菌实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>挑取福氏志贺氏菌单克隆，经过夜培养后，调整期浓度为104cfWml，喷洒在器具(金属托盘)表面；然后将纯化噬菌体以104、105、10Spfb/ml浓度，对器具(金属托盘)实施喷洒消杀，60min后，检测宿主菌。检测结果显示，在以104、105、10Spfu/ml浓度噬菌体实施喷洒消杀60min后，器具表面已检测不到宿主菌，因此以浓度》10"pfb/ml噬菌体能够有效的杀灭器具表面污染的福氏志贺氏菌。以上各实施例不是对本发明的限制，具体实施时，可以将本发明所述的方法制备喷洒液或淋洗液，或食品添加剂，以及选择常用的缓冲液、金属离子、表面活性剂作为赋形剂制备药物，用于抑制福氏志贺氏菌生长、繁殖，预防和控制因福氏志贺氏菌导致的污染和腹泻。权利要求1、一种福氏志贺氏菌噬菌体菌株，其特征在于保藏号为CCTCCNOM209029，该菌株对福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)有强的裂解作用。2、根据权利要求1所述的一种福氏志贺氏菌噬菌体菌株，其特征在于噬菌体菌株在405(TC中放置30min，其活性稳定；在9(TC中放置则失活；噬菌体菌株在pH5.0~9.0环境下，其活性稳定；4-C保存至180d，其效价降低10倍；-20°〇至-70°。保存180d后，活性稳定；噬菌体菌株保存的保护剂为含10n/a或20M甘油的SM溶液。3、一种如权利要求1所述噬菌体菌株的应用，其特征在于将福氏志贺氏菌噬菌体菌株纯化和扩增培养后，用于抑制福氏志贺氏菌。4、根据权利要求3所述噬菌体菌株的应用，其特征在于用于抑制福氏志贺氏菌是指将纯化的噬菌体用水稀释至浓度》10、fU/ml的喷洒液或淋洗液，用于对生产环境或生产器具的喷洒或消杀，防止食品加工过程中造成的福氏志贺氏菌污染。5、根据权利要求3所述噬菌体菌株的应用，其特征在于用于抑制福氏志贺氏菌是指将纯化的噬菌体作为食品添加剂，在配料时加入10fWml或l(^pfti/g浓度的纯化的噬菌体，用于防止食品储存过程中福氏志贺氏菌的生存和繁殖。6、根据权利要求4或5所述噬菌体菌株的应用，其特征在于所述的食品是指由肉类，或蛋类，或奶制品，或粮食，或蔬菜，或它们之间的组合加工的固体或液体类食品。7、根据权利要求3所述噬菌体菌株的应用，其特征在于用于抑制福氏志贺氏菌是指将纯化的噬菌体用水稀释至浓度》10、fo/ml后，作为消杀剂用于畜禽舍养殖区对福氏志贺氏菌的消杀和抑制。8、根据权利要求3所述噬菌体菌株的应用，其特征在于用于抑制福氏志贺氏菌是指将纯化的噬菌体与赋形剂复配后，作为治疗由福氏志贺氏菌导致腹泻的药物。9、根据权利要求8所述噬菌体菌株的应用，其特征在于所述的赋形剂为制药领域普遍使用的缓冲液、金属离子、表面活性剂。全文摘要本发明涉及一种噬菌体菌株及其应用，噬菌体菌株的保藏号为CCTCCNOM209029，该菌株对福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)有强的裂解作用。将噬菌体菌株纯化和扩增培养后，可以用于抑制福氏志贺氏菌。其优点是由于采用噬菌体特异性裂解福氏志贺氏菌可以杀死具有耐药性的福氏志贺氏菌，同时能够防止福氏志贺氏菌进化和耐药毒株的产生；由于本发明涉及的噬菌体菌株具有亲水相，通过传统的方法很容易配制成喷洒液或淋洗液，对环境或器具进行消杀；由于本发明涉及的噬菌体菌株能特异性裂解福氏志贺氏菌，且没有毒副作用，可以作为食品添加剂，防止福氏志贺氏菌对食品的污染，作为药物治疗由福氏志贺氏菌引起的疾病。文档编号A01N63/00GK101519651SQ20091002930公开日2009年9月2日申请日期2009年4月8日优先权日2009年4月8日发明者辉张,冉王,明陈,魏瑞成申请人:江苏省农业科学院