基于石英晶体芯片原位定量检测金纳米颗粒表面吸附蛋白与细胞膜相关受体相互作用的方法与流程

本发明属于耗散性石英晶体微天平检测方法的创新开发领域，主要涉及一种基于石英晶体芯片原位定量检测金纳米颗粒手性表面吸附的蛋白与细胞膜相关受体相互作用的方法。

背景技术：

耗散性石英晶体微天平(qcm-d)利用石英晶体谐振器的压电特性，将石英晶体芯片电极表面质量变化转化为石英晶体振荡电路输出电信号的频率变化，进而通过计算机获得高精度的数据，是一种新型的灵敏的质量检测仪器，其测量精度可达纳克级。

当纳米材料进入人体内后，由于比表面积较大，会吸附人体液中的蛋白，在材料表面形成蛋白冠。蛋白冠对纳米材料进入人体后的生物效应、毒理效应以及代谢途径都有着决定作用。因此，研究纳米材料与蛋白质作用的界面结构有着重要意义。

人体液中存在着几百种蛋白，由于纳米材料进入体液中并吸附蛋白形成蛋白冠，被吸附的蛋白在结构和功能上或多或少有所改变。纳米材料与蛋白冠作为一个复杂的整体，对于同种材料，何种蛋白被吸附；蛋白被如何吸附；蛋白被吸附后的结构和功能被如何改变，这一系列的问题越来越受到人们关注。对于不同材料进入体内形成的蛋白冠的区别以及规律，也值得人们进一步研究。

目前，对纳米材料与蛋白质的界面结构研究存在着许多困难。尽管圆二色光谱、红外光谱、x射线晶体衍射等技术能检测到被吸附的蛋白的各级结构变化，但对被吸附的蛋白的生理功能的改变仍然束手无策。

手性是纳米材料的一个基本特性，不同的手性的纳米材料进入人体后，对蛋白的吸附方式也有所区别，并对蛋白功能的改变有所差异。但这种差异通常较小，常规检测手段很难精确地检测出结果。

qcm-d作为微质量传感器，操作简单，灵敏度高，可实现在线监测，在化学、物理、生物、医学和表面科学等领域中得到了广泛的应用。在生物领域，qcm-d通常用于监测生物分子之间的相互作用，如：抗原-抗体之间的亲和作用。通常在石英晶体芯片表面修饰一种生物分子，再直接通入另一种分子，从而检测芯片电极表面的质量变化引起的输出电信号的频率变化。而对于纳米材料-蛋白冠结构复杂，目前，关于基于石英晶体芯片原位定量检测金纳米颗粒手性表面吸附的蛋白与细胞膜相关受体相互作用的技术发明尚未见报导。

技术实现要素：

为了区分不同手性纳米材料对吸附的蛋白的功能的影响，针对qcm-d灵敏度高这一特点，本发明提出了一种基于石英晶体芯片原位定量检测金纳米颗粒手性表面吸附的蛋白与细胞膜相关受体相互作用的方法。

本发明设计了一种原位定量检测金纳米颗粒手性表面吸附的蛋白配体与细胞上受体相互作用的方法。将含有手性表面的金纳米颗粒、配体蛋白、细胞膜表面受体逐层原位结合在石英晶体芯片表面，检测被吸附的配体蛋白和受体的相互作用，从而进一步分辨出不同手性表面的金纳米颗粒对吸附的蛋白在功能改变方面的区别。该方法对纳米颗粒-蛋白冠复合物的进一步研究，有着至关重要的意义。

本发明是通过下述技术方案来实现的。

一种基于石英晶体芯片原位定量检测金纳米颗粒手性表面吸附的蛋白与细胞膜相关受体相互作用的方法，包括以下步骤：

1)采用2-巯基丙酸和2-巯基乙醇对石英晶体芯片预处理；

2)将处理过的石英晶体芯片放入qcm-d仪器中，通入edc/nhs，将芯片表面羧基活化；

3)通入表面修饰青霉胺小分子的纳米金颗粒，通过酰胺键与芯片结合；

4)通入配体蛋白，使配体蛋白吸附在纳米金的手性表面；

5)通入表面含有相关受体的细胞衍生的脂质体；通过频率信号的强弱来将配体蛋白与相关受体的相互作用进行定量。

具体地，上述方法包括以下步骤：

1)石英晶体芯片预处理：将洗净的石英晶体芯片用2-巯基丙酸和2-巯基乙醇处理12-24h，用三次水冲洗掉未结合到芯片上的巯基小分子，用氮气吹干待用；

2)石英晶体芯片表面羧基的活化：将步骤1)预处理的石英晶体芯片放入qcm-d仪器中，先100-150μl/min的流速通入(qcm-d仪器中，下同)三次水，等到信号曲线平稳，再以30-50μl/min的流速通入含75mm的edc(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)和30mm的nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)溶液1-2h，等到信号曲线平稳；

3)手性表面的纳米金颗粒的固定：将三次水以100-150μl/min的流速通入，直到信号平稳，再以20-40μl/min流速通入含有青霉胺分子修饰的手性表面的纳米金颗粒，信号曲线大幅度变化，直到信号平稳；

4)配体蛋白的吸附：先用ph＝7.4的hepes(即4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液以50-100μl/min流速通入，到信号平稳，以40-60μl/min流速通入含0.5-2mg/ml的配体蛋白的hepes缓冲液，信号曲线变化，直到再次平稳；

5)配体-受体相互作用检测：将pbs缓冲液以40-60μl/min流速通入，到信号平稳，再将表面含有相关受体的细胞衍生的脂质体溶液以20-40μl/min流速通入，根据信号的变化值，判断配体-受体的相互作用强弱。

上述方法还包括以下步骤：

6)后处理：检测结束后，将石英晶体芯片取出，浸没在三次水:浓氨水:30％过氧化氢体积比为5:1:1的溶液中，水浴70℃，15min后倒掉混合液，用三次水清洗3遍，再用氮气吹干；石英晶体芯片可循环使用。

进一步，所述石英晶体芯片的表面为金材质。

进一步，步骤1)采用含有体积分数0.97％的2-巯基丙酸和含有体积分数0.95％的2-巯基乙醇的混合液对石英晶体芯片进行预处理。

进一步，步骤1)具体包括：将原液体积浓度为97％的2-巯基丙酸和原液体积浓度为95％的2-巯基乙醇按1:1体积比例混合后再稀释100倍，加到细胞培养板中(例如12孔板)，每孔1-1.5ml，将洗净的石英晶体芯片放入孔内，完全浸没，处理12-24h，用三次水冲洗掉未结合到芯片上的巯基小分子，用氮气吹干待用。

进一步，步骤3)所述含有青霉胺分子修饰的手型表面的金纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：

(1)取10ml用柠檬酸还原法制备的纳米金胶体溶液，加入10mg/ml的青霉胺手性分子500μl(过量)，室温反应12-24h；

(2)将修饰青霉胺分子的纳米金溶液于9500-12000r/min，离心40-60min，弃上清，用三次水重悬，除去未修饰的青霉胺分子，制得含有青霉胺分子修饰的手性表面的纳米金颗粒。

进一步，本发明所述方法中，每通入一种新的溶质的溶液之前，都必须先通入不含溶质的溶剂，等到信号平稳，以免不同体系之间信号的干扰。

进一步，将配体蛋白溶液置于在ph＝7.4的hepes缓冲体系下，以免ph变化造成的蛋白的电位变化，从而改变蛋白的正常生理构型。

相应地，本发明给出一种表面含有相关受体的脂质体的制备方法，包括以下步骤：

(1)培养相关质粒转染的半贴壁的hek293a细胞，用流式细胞仪检测相关受体蛋白表达量；

(2)收集相关受体过表达的hek293a细胞，取4-8×10⁵/ml的细胞悬液10ml，1000r/min离心，弃上清培养基，用含有蛋白酶抑制剂的pbs缓冲液重悬；

(3)将细胞悬液通过800nm孔径的碳纤维滤膜，制得表面含有相关受体的脂质体。

进一步，本发明使用hek293a细胞，一方面利于转染，另一方面在收集细胞时，半贴壁状态易收集，避免使用胰蛋白酶从而破坏表面受体。

进一步，本发明使用蛋白酶抑制剂，可以防止细胞通过滤膜时，由细胞破裂导致的溶酶体中的蛋白酶外漏，破坏表面受体。

本发明还包括上述基于石英晶体芯片的原位定量检测金纳米颗粒手性表面吸附的蛋白与细胞膜相关受体相互作用的方法在研究蛋白冠中蛋白的生物效应方面的应用。

本发明的优点及有益效果为：

(1)对石英晶体芯片逐层修饰，用qcm-d仪器可以直观地检测出每一步芯片上的质量改变情况。逐层修饰，以避免了配体蛋白直接与芯片表面接触，从而引起结构改变；

(2)直接使用含有相关受体的细胞膜在原位检测，可以更有效地模拟人体内环境，为该方法的实用性奠定了基础。

本发明方法操作简单，实用性强，对纳米颗粒表面形成的蛋白冠的结构和功能的研究有着重要的意义。

附图说明

图1为本发明基于石英晶体芯片原位定量检测金纳米颗粒手性表面吸附的蛋白与细胞膜相关受体相互作用的方法的原理示意图。

图2a为实施例1中的石英芯片表面结合手性表面的纳米金颗粒的原子力显微镜表征图；

图2b为实施例1中的纳米金颗粒的手性表面结合转铁蛋白的原子力显微镜表征图；

图2c为实施例1中的转铁蛋白结合表面含有转铁蛋白受体的细胞衍生的脂质体的原子力显微镜表征图。

图3为实施例1中的石英芯片表面原位逐层结合手性表面的纳米金颗粒、转铁蛋白、含有转铁蛋白受体的脂质体的qcm-d信号图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

下列实施例中所用到的qcm-d仪器型号为q-sensee4(瑞典百欧林科技有限公司)。

本发明基于石英晶体芯片原位定量检测金纳米颗粒手性表面吸附的蛋白与细胞膜相关受体相互作用的方法的原理示意图见图1。

实施例1

(1)石英晶体芯片预处理：

将洗净的石英晶体芯片放在12孔板中，在12孔板中加入含有体积分数0.97％的2-巯基丙酸和含有体积分数0.95％的2-巯基乙醇的混合液，每孔1ml，处理12h，用三次水冲洗掉未结合到芯片上的巯基小分子，用氮气吹干待用；

(2)石英晶体芯片表面羧基的活化：

将预处理的石英晶体芯片放入qcm-d仪器中，先100μl/min的流速通入三次水，清洗10min，等到信号曲线平稳，再以30μl/min的流速通入含75mm的edc和30mm的nhs溶液1h，等到信号曲线平稳；

(3)手性表面的纳米金颗粒的制备与固定：

分别取10ml用柠檬酸还原法制备的纳米金胶体溶液，分别加入10mg/ml的l型和d型青霉胺手性分子500μl(过量)，室温反应12h；

将修饰青霉胺分子的纳米金溶液9500r/min，离心1h，弃上清，用三次水重悬，除去未修饰的青霉胺分子，制得含有青霉胺分子修饰的手性表面的纳米金颗粒；

将三次水以100μl/min的流速通入，直到信号平稳，再以20μl/min流速通入含有青霉胺分子修饰的手性表面的纳米金颗粒，信号曲线大幅度变化，直到信号平稳；

石英芯片表面结合手性表面的纳米金颗粒的原子力显微镜表征图见图图2[a]；

(4)配体蛋白的吸附：

先用ph＝7.4的hepes缓冲液以50μl/min流速通入，到信号平稳，以50μl/min流速通入含1mg/ml的转铁蛋白的hepes缓冲液，信号曲线变化，直到再次平稳；

纳米金颗粒的手性表面结合转铁蛋白的原子力显微镜表征图见图2[b]；

(5)配体-受体相互作用检测：

培养质粒转染转铁蛋白受体过表达的半贴壁的hek293a细胞，用流式细胞仪检测转铁蛋白受体蛋白表达量；

收集转铁蛋白受体过表达的hek293a细胞，取5×10⁵/ml的细胞悬液10ml，1000r/min离心，弃上清培养基，用含有蛋白酶抑制剂的pbs缓冲液重悬；

将细胞悬液通过800nm孔径的碳纤维滤膜，制得表面含有转铁蛋白受体的细胞衍生的脂质体；

将pbs缓冲液以40μl/min流速通入，到信号平稳，再将表面含有转铁蛋白受体的细胞衍生的脂质体溶液以30μl/min流速通入，根据信号的变化值，判断转铁蛋白-转铁蛋白受体的相互作用强弱。

石英芯片表面原位逐层结合手性表面的纳米金颗粒、转铁蛋白、含有转铁蛋白受体的脂质体的qcm-d信号图见图3。图3中横坐标指时间，纵坐标为频率信号，au为纳米金颗粒，transferrin为转铁蛋白，liposome为细胞衍生的脂质体。

进一步，上述方法还包括以下步骤：

(6)后处理：检测结束后，将石英晶体芯片取出，浸没在三次水:浓氨水:30％过氧化氢体积比为5:1:1的溶液中，水浴70℃，15min后倒掉混合液，用三次水清洗3遍，再用氮气吹干。石英晶体芯片可循环使用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。