专利名称：RhoA/ROKα信号传导通路在血管外膜重塑中的功能和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选通过RhoA/ROKα通路影响血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的化合物的方法。
背景技术：
1989年，Baumbach等(Baumbach GL，Heistad DD.Remodeling of cerebralarterioles in chronic hypertension.Hypertension.1989 Jun；13(6 Pt 2)968-972)发现易卒中自发性高血压大鼠的脑部小动脉的血管中层厚度/管腔内径值虽然升高，但管壁的横切面积并无改变，他将血管的这一适应性变化称为血管重塑(vascular remodeling)。简单地说，血管重塑是指管壁细胞增生，肥厚，重新排列并发生结构变化的过程。目前研究表明血管重塑广泛地存在于动脉粥样硬化、血管损伤后再狭窄、高血压等疾病的发生发展过程。血管重塑的过程包括小血管新生、炎性细胞浸润、局部细胞的分化、增生、迁移、凋亡并伴有细胞外基质的沉积(Saverio S，Angela C，et al.Contribution of adventitial fibroblasts toneointimaformation and vascular remodeling from innocent bystander to activeparticipant.Circ Res.2001；891111-1121)。
几十年来人们对于血管重塑的研究都集中于血管中膜，认为中膜平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)是血管重塑的主要参与者。而90年代以来的研究表明血管外膜在血管重塑中扮演着更为重要的角色。1991年朱鼎良(Zhu DL，Herembert T，Marche P.Increased proliferation of adventitial fibroblastsfrom spontaneously hypertensive rat aorta.J Hypertens 1991；91161-1168)等在国际上首先报道体外培养的自发性高血压大鼠(SHR)胸主动脉外膜成纤维细胞(adventitial fibroblasts，AF)的增殖明显快于正常对照大鼠(WKY)，且前者对于多种生长因子的增殖反应也强于后者。1996年Shi(Shi Y，Pieniek M，et al.Adventitial remodeling after coronary arterial injury.Circulation.1996 Jan15；93(2)340-348)等报道，在球囊扩张造成猪冠状动脉损伤时，血管外膜成纤维细胞(AF)被激活转化为肌成纤维细胞(myofibroblasts，MF)，后者迁移至内膜并增殖形成新生内膜，从而提出MF参与血管重塑的理论。这一发现对传统的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖形成新生内膜的观点提出了挑战。近年来Li等进一步将稳定表达LacZ基因的AF细胞导入即刻球囊损伤的大鼠颈动脉球，发现血管损伤后5-14天中膜及新生内膜LacZ基因的表达及α-半乳糖苷酶的活性，动态观察证实了AF参与血管重塑过程。之后许多实验都证实MF在动脉粥样硬化，动脉炎和血管移植术后等一系列血管病变中起了重要作用。
综合近年来的研究结果表明成纤维细胞(AF)是血管外膜的主要细胞成分，在血管损伤时血管外膜成纤维细胞迅速转化为肌成纤维细胞(MF)，后者具有增殖，迁移和分泌功能，并参与新生内膜的形成，因此AF/MF细胞表型转化是促发血管重塑的始动机制，MF在血管重塑过程中起重要作用。所以研究AF向MF表型转化的分子生物学机制是调控血管外膜细胞分化、阻断AF/MF表型转化乃至阻止血管重塑的根本措施，但迄今为止鲜有关成纤维细胞/肌成纤维细胞表型转化相关基因的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种影响血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的通路-RhoA/ROKα通路，以及该通路的用途。
在本发明的一个方面，提供了一种筛选通过RhoA/ROKα通路影响血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的化合物的方法，包括步骤(a)在测试组中，向血管外膜成纤维细胞的培养物中添加待筛选的候选物，并检测血管外膜成纤维细胞中ROKα的表达量；(b)将步骤(a)测试组中ROKα的表达量与未添加候选物的对照组中ROKα的表达量进行比较，如果测试组的ROKα表达量统计学上高于对照组，就表明该候选物是促进血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的促进剂；如果测试组的ROKα表达量统计学上低于对照组，就表明该候选物是抑制血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的抑制剂。
在另一优选例中，在步骤(b)中还包括检测测试组血管外膜成纤维细胞中α-SM-肌动蛋白的表达量，并与对照组中α-SM-肌动蛋白的表达量进行比较。
在另一优选例中，在步骤(a)中培养物中还添加了α-SM-肌动蛋白表达的TGF-β1。
在另一优选例中，所述的血管外膜成纤维细胞是人、大鼠、小鼠的血管外膜成纤维细胞。
在本发明的第二方面，提供了一种RhoA/ROKα通路抑制剂的用途，它被用于制备抑制血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的药物。
在另一优选例中，所述的抑制剂选自Y27632胞外酶C、ROKα蛋白的抗体、ROKα的反义核酸。
在本发明的第三方面，提供了一种RhoA/ROKα通路促进剂的用途，它被用于制备促进血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的药物。
在本发明的第四方面，提供了一种用本发明上述方法获得的通过RhoA/ROKα通路影响血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的化合物。
在本发明的第五方面，提供了一种筛选调节血管外膜成纤维细胞(AF)转化为肌成纤维细胞(MF)的基因的方法，它包括步骤(b)建立AF/MF转化模型；(b)用TGF-β1处理AF/MF细胞；(c)对AF/MF细胞进行基因分析，分离差异片断；(d)对差异片断测序鉴定，序列分析，获得MF上调或下调基因。
图1显示了α-SM-肌动蛋白免疫细胞化学结果。其中，A未经TGF-β1处理的AF细胞，B为TGF-β1处理24小时的AF细胞(放大200倍)。
图2显示了α-SM-肌动蛋白Western blot结果。其中，上排为α-SM-肌动蛋白条带，下排为β-肌动蛋白作为内参照，左侧为经TGF-β1处理24小时的AF细胞，右侧为未经TGF-β1处理的AF细胞。
图3显示了血管外膜AF和MF的mRNA差异显示图。其中，A为AF细胞，M为MF细胞，差异片段以箭头标出，最左侧为分子量标记。
图4显示了差异片段的Northern印迹杂交结果。其中，上排为ROKα条带，下排为18s RNA作为内参照。
图5显示了RhoA免疫印迹结果。其中，上排为RhoA条带，下排为β-肌动蛋白作为内参照。
图6显示了Y27632抑制TGF-β1诱导的α-SM-肌动蛋白表达。其中，上排为α-SM-肌动蛋白条带，下排为β-肌动蛋白作为内参照。
图7显示了胞外酶抑制TGF-β1诱导的α-SM-肌动蛋白表达。其中，上排为α-SM-肌动蛋白条带，下排为β-肌动蛋白作为内参照具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，首次发现了1.血管外膜成纤维细胞存在RhoA/ROKα信号传导通路；2.血管外膜成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞的过程涉及RhoA/ROKα信号传导途径。在此基础上完成了本发明。
具体而言，成纤维细胞是血管外膜的主要细胞成分，在血管损伤时血管外膜成纤维细胞(AF)迅速转化为肌成纤维细胞(MF)，后者具有增殖、迁移和分泌功能，在血管重塑过程中起重要作用，因此AF/MF细胞表型转化是促发血管重塑的始动机制。为了寻找血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的相关基因，本发明人制备了血管外膜成纤维细胞和肌成纤维细胞二种细胞模型，利用荧光差异显示聚合酶链反应(Fluo-DDPCR)技术筛选这两种细胞差异表达基因。DDPCR结果显示19个差异表达片段，其中14条为已知基因，5条为EST。经Northern blot证实，ROKα是肌成纤维细胞中表达上调的基因之一。
ROKα是一分子量为160KD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其主要功能是与其上游的效应分子RhoA共同参与细胞骨架的重排，已知ROKα在骨骼肌、平滑肌等细胞骨架重排中起了重要作用，但血管外膜细胞中是否存在ROKα基因尚未见文献报道。本发明在基因及蛋白水平均证实血管外膜成纤维细胞存在ROKα基因，TGF-β1可上调血管外膜成纤维细胞ROKα和RhoA的表达，ROKα表达上调始于TGF-β1刺激后2小时而RhoA表达上调始于TGF-β1刺激后30分钟。使用ROKα和RhoA的特异性抑制剂Y27632和胞外酶C3可以阻断TGF-β1诱导的血管外膜成纤维细胞α平滑肌肌动蛋白(α-SM-肌动蛋白)的表达。
这些结果表明，血管外膜成纤维细胞存在RhoA/ROKα信号传导通路，并且血管外膜成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞的过程涉及RhoA/ROKα信号传导途径。
基于本发明的新发现，RHOA/ROKα信号传导通路(或ROKα和RHOA蛋白)有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)筛选抑制通过RhoA/ROKα信号传导通路进而抑制血管外膜成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞的物质(抑制剂或拮抗剂)。
这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够有效治疗与通过RhoA/ROKα信号传导通路导致血管外膜成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞有关的血管病变的药物。
在本发明中，使用常规的检测方法，利用血管外膜成纤维细胞上的RHOA/ROKα信号传导通路(或ROKα和RHOA蛋白)，可筛选出与影响血管外膜成纤维细胞上RHOA/ROKα信号传导通路(或ROKα和RHOA蛋白)(如RHOA/ROKα信号传导通路的抑制剂、激动剂或拮抗剂等)。
RHOA/ROKα信号传导通路(或ROKα和RHOA蛋白)的拮抗剂或抑制剂，可以施用于个体时，以抑制血管外膜成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞，进而改善与血管外膜成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞有关的血管病理变化。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、静脉内、或皮下给药。
本发明还提供了一种组合物(如药物组合物)，它含有安全有效量的(a)RHOA/ROKα信号传导通路(或ROKα和RHOA蛋白)的拮抗剂或抑制剂(例如抗ROKα的抗体、抗RHOA蛋白的抗体、ROKα反义核酸或RHOA反义核酸等)，以及药学上可接受的载体或赋形剂。这些组合物可以抑制血管外膜成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞。
通常，这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。
本发明还涉及定量和定位检测血管外膜成纤维细胞上RHOA/ROKα信号传导通路水平(或ROKα和RHOA蛋白数量)的方法。这些检测结果可用于辅助判断血管外膜成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞的能力。
一种检测血管外膜成纤维细胞RHOA/ROKα信号传导通路(或ROKα和RHOA蛋白)数量的方法是利用抗ROKα和RHOA蛋白的特异性标记物进行检测，它包括将含血管外膜成纤维细胞的样品与抗RHOA抗体和/或抗ROKα抗体接触；观察所形成抗体复合物的数目。
本发明的主要优点在于首次证实了血管外膜成纤维细胞上RHOA/ROKα信号传导通路(或ROKα和RHOA蛋白)与血管外膜成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞之间的相关性，从而提供了通过RhoA/ROKα信号传导通路抑制血管外膜成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞的新途径。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1实验方法如下1.AF及MF两种表型细胞的建立及鉴定。采用贴片法获得并培养SD大鼠胸主动脉外膜的AF细胞，实验使用4～6代细胞；用TGF-β1(10ng/ml)处理静止状态的AF细胞24h后获MF。采用免疫细胞化学技术及Western blot对AF和MF进行细胞表型鉴定。SD大鼠购自中国科学院实验动物中心，TGF-β1购自Valbiotech公司。
2.总RNA提取及DNA酶处理。总RNA提取应用Trizol试剂(Gibco公司)分别提取AF及MF两种细胞的总RNA。各取10μg RNA，用DNA酶(Promega公司)处理去除DNA混杂，再以乙醇沉淀获得处理后的RNA。
3.逆转录。取1μg RNA用M-MLV(Promega公司)300U进行逆转录。引物使用Genomyx的差异显示PCR试剂盒的12条锚定引物。
4.差异显示PCR(DDPCR)。用HIEROPLPH mRNA Profile试剂盒(Beckman公司)，两种细胞的逆转录产物分别选1个3′端锚定引物与16个5′端随机引物配对后，进行PCR扩增，共32个反应。反应总体积为10μl，内含1×buffer，3.75mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTP、荧光锚定引物和随机引物各0.35μmol/L、1μl逆转录产物、0.05U/μl高保真Taq DNA聚合酶(Takara公司)。反应程序95℃ 2min，1个循环；92℃ 15s、50℃ 30s、72℃ 2min，4个循环；92℃ 15s、60℃ 30s、72℃ 2min，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
5.分离差异片段。配制5.6％非变性聚丙烯酰胺凝胶，长61cm，宽33cm。扩增产物加荧光染料变性处理后，经Genomyx LR电泳仪上样及Genomyx SC荧光成像系统扫描仪(Beckman公司)获取图像，显示差异片段。
6.差异片段的回收及再扩增。经割胶系统(Beckman公司)切割差异片段凝胶，用T7及M13引物(Beckman公司)对差异片段再扩增，然后用QIAquick Gel抽提试剂盒(QIAGEN公司)纯化扩增产物。
7.再扩增产物的克隆及序列分析将纯化产物连接到pGEM-T载体(Promega公司)，转染DH5α感受态细胞，经平板筛选单克隆，扩增后抽提质粒DNA，然后酶切鉴定。用末端荧光标记法进行DNA序列分析。所获测序结果通过Blast软件与GenBank收录序列进行同源性比较。
8.Northern blot鉴定取RNA 15μg，经1.2％琼脂糖变性电泳后，用虹吸法将变性RNA转移至尼龙膜(Sigma公司)。以ROK再扩增产物为模板，体外转录获得地高辛标记(Roche公司)RNA探针。杂交，洗膜，与抗地高辛抗体免疫反应，显影。
9.细胞总蛋白抽提。以lysis buffer(10mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1％SDS、1％TritonX-100、10ng/ml Aprotinin、2ug/ml Leupeptin、1mM PMSF)抽提细胞总蛋白，Bradford法蛋白定量。
10.Western blot。取细胞总蛋白行SDS PAGE(检测-SM-肌动蛋白用1μg总蛋白行10％SDS PAGE；检测RhoA用20μg总蛋白行12％SDS PAGE)，转至硝酸纤维素膜(Amersham公司)，封闭，α-SM-肌动蛋白一抗1∶3000(Sigma公司)，羊抗鼠二抗1∶10000(Santa Cruz公司)，RhoA一抗1∶1000(Santa Cruz公司)，羊抗鼠二抗1∶2000(Santa Cruz公司)各室温下工作一小时，加Western ECL发光剂(Amersham公司)，曝光成像。
实验结果1.细胞表型鉴定免疫细胞化学和Western blot结果显示，TGF-β1(10ng/ml)诱导AF细胞平滑肌α肌动蛋白表达。免疫细胞化学显示(图1)，经TGF-β1处理24小时的细胞中，α-SM-肌动蛋白表达阳性，胞浆中见大量微肌丝；而在未经TGF-β1处理的AF细胞，则α-SM-肌动蛋白表达呈阴性。Western blot显示(图2)，经TGF-β1处理24小时的细胞α-SM-肌动蛋白表达量明显上升(P＜0.05，n＝3)，较未处理的AF细胞升高达约3倍。表明TGF-β1成功诱导AF转化为MF。
2.差异片段的分离和识别由图3可见，虽然AF及MF两种表型细胞间大部分扩增片段无显著差异，但仍显示部分明显的差异片段。本图为一次实验结果，荧光扫描显示6个cDNA差异片段，全部以箭头标出。三次实验共找到20个差异片段，全部克隆至pGEM-T载体(Promega公司)，并测序。
3.差异片段的序列分析测序结果与GenBank进行序列同源性比对，除一个克隆为线粒体基因组DNA外，15个片段为已知基因(同源性＞95％)，4个为表达序列标签(EST)。其中11个已知基因在MF上调，4个已知基因在MF下调。其中在MF上调的一个片段与ROKα基因同源性为99％(475bp/478bp)。表1和表2显示在MF上调及下调的基因，表3为这些已知基因的功能分类。
表1.在MF表达上调的基因
表2.在MF表达下调的基因
表3.15条已知基因的功能分类
4.Northern blot分析如图4所示，ROKα基因表达在TGF-β1刺激2小时后即明显上升(p＜0.05，n＝4)，并随TGF-β1刺激时间延长而逐步增加，至24-48小时达高峰，表达量为未刺激时的5倍(p＜0.01，n＝4)。18s RNA作为内参照。
5.RhoA免疫印迹如图5所示，AF细胞经TGF-β1(10ng/ml)刺激30分钟后RhoA表达开始上调，2小时达到最大值(p＜0.05，n＝3)。6小时表达开始下降，但仍高于AF水平。12小时进一步下降，至24小时RhoA表达量与AF细胞RhoA表达量基本一致。
本实施例采用荧光差异显示PCR(DDPCR)的方法来筛选血管外膜成纤维细胞/肌成纤维细胞的差异表达基因。结果发现差异表达14条已知基因和5条EST，在14条已知基因中10条在肌成纤维细胞中表达上调，4条在肌成纤维细胞中表达下调。这14条已知基因功能涉及细胞信号传导、细胞外基质和基因转录、翻译和翻译后修饰。本发明人进一步选取参与细胞信号传导的差异表达基因ROKα，以Northern blot方法进行验证。
结果显示TGF-β10ng/ml)刺激2小时后ROKα mRNA表达量开始上升，至24小时表达量达高峰，48小时持续高表达，表明DDPCR的结果可信。
实施例2筛选通过RhoA/ROKα通路影响血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的化合物候选化合物Y27632，胞外酶C3。
对照组不用候选物处理AF细胞。
测试组用前述候选物处理AF细胞。AF细胞经TGF-β1(10ng/ml)刺激24小时后，α-SM-肌动蛋白表达明显上调。接着，用Y27632预处理细胞30分钟，胞外酶C3使用Lipofectamine2000导入细胞(参见Tsutsumi S，Gupta SK，et al.Activation of small GTPase Rho is required for autocrine motility factor signaling.Cancer Res.2002 Aug 1；62(15)4484-4490)，预处理5小时。再取10ng的TGF-β1溶于50ul DMEM培养液中，添加于培养皿中，混匀，37℃培养。
首先，在测试组中，向血管外膜成纤维细胞的培养物中添加待筛选的候选物，并检测血管外膜成纤维细胞中ROKα的表达量；接着，将测试组中ROKα的表达量与未添加候选物的对照组中ROKα的表达量进行比较，如果测试组的ROKα表达量统计学上高于对照组，就表明该候选物是促进血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的促进剂；如果测试组的ROKα表达量统计学上低于对照组，就表明该候选物是抑制血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的抑制剂。
如图6所示，AF细胞经TGF-β1(10ng/ml)刺激24小时后，α-SM-肌动蛋白表达明显上调，而ROKα的抑制剂Y27632剂量依赖性地抑制TGF-β1诱导的AF细胞α-SM-肌动蛋白表达。0.1uM浓度的Y27632对α-SM-肌动蛋白表达没有抑制作用；1uM的Y27632开始抑制α-SM-肌动蛋白表达；10uM的Y27632明显抑制α-SM-肌动蛋白表达，有统计学差异(p＜0.05，n＝3)；100uM的Y27632可完全抑制α-SM-肌动蛋白表达。证明，ROKα的抑制剂Y27632抑制TGF-β1诱导的α-SM-肌动蛋白表达。
使用Lipofectamine将RhoA抑制剂胞外酶C3导入AF细胞。如图7所示，AF细胞经TGF-β(10ng/ml)刺激24小时后α-SM-肌动蛋白表达明显上调，而RhoA的抑制剂胞外酶C3剂量依赖性地抑制TGF-β1诱导的AF细胞α-SM-肌动蛋白表达。0.1ug/ml浓度的胞外酶C3对α-SM-肌动蛋白表达没有抑制作用；1ug/ml的胞外酶C3开始抑制α-SM-肌动蛋白表达；3ug/ml的胞外酶C3明显抑制α-SM-肌动蛋白表达，有统计学差异(p＜0.05，n＝3)。证明，RhoA抑制剂胞外酶C3抑制TGF-β1诱导的α-SM-肌动蛋白表达。
讨论肌成纤维细胞(MF)最初发现于损伤后的肉芽组织，这类细胞由局部的成纤维细胞转化而来。它们具有平滑肌细胞的特征，能够表达一些平滑肌细胞特有的蛋白分子，例如α-SM-肌动蛋白，这些蛋白赋予肌成纤维细胞收缩、迁移的能力，从而促使伤口愈合。之后在许多组织、器官诸如肝脏、肺脏、肾脏等都发现了肌成纤维细胞存在并且参与肝纤维化、肺纤维化及肾间质纤维化的病理、病理生理过程。
目前在不同的组织、器官发现了至少5种不同的肌成纤维细胞，分类的标准取决于肌成纤维细胞表达平滑肌细胞特征蛋白α-SM-肌动蛋白、肌间线蛋白(desmin)、波形蛋白(vimentin)的差异情况。例如，在肿瘤组织的肌成纤维细胞表达desmin(Hirose T，Kudo E，et al.Expression of intermediate filaments inmalignant fibrous histiocytomas.Hum Pathol.1989 Sep；20(9)871-877)，而血管外膜肌成纤维细胞只表达α-SM-肌动蛋白和波形蛋白，不表达肌间线蛋白。因此血管外膜肌成纤维细胞具有不同于其他肌成纤维细胞的特征，并且鉴于外膜肌成纤维细胞对于血管重塑的重要性，因此尽管对于肌成纤维细胞表型转化的研究已经比较深入，但研究血管外膜肌成纤维细胞表型转化的分子生物学机制仍然十分必要。
本发明采用荧光差异显示PCR(DDPCR)的方法来筛选血管外膜成纤维细胞/肌成纤维细胞的差异表达基因。结果发现差异表达14条已知基因和5条EST，在14条已知基因中10条在肌成纤维细胞中表达上调，4条在肌成纤维细胞中表达下调。这14条已知基因功能涉及细胞信号传导、细胞外基质和基因转录、翻译和翻译后修饰。本发明人进一步选取参与细胞信号传导的差异表达基因ROKα，以Northern blot方法进行验证。结果显示TGF-β10ng/ml)刺激2小时后ROKα mRNA表达量开始上升，至24小时表达量达高峰，48小时持续高表达。表明DDPCR的结果可信。
ROKα(Rho binding kinase alpha)是一分子量为160KD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，1995年Leung等首先克隆该基因。ROKα与其上游的胞浆内小分子G蛋白RhoA共同组成RhoA-ROKα信号传导通路，调节细胞行为。目前的研究表明RhoA-ROKα信号传导通路最主要的功能是参与调节细胞骨架的重排。多种刺激因子如凝血酶、溶血磷脂酸(LPA)，FGF，PDGF和TGF-β均可激活该信号通路，激活的方式包括加强的ROKα激酶活性，或是上调RhoA与ROKα的表达，从而引起细胞骨架重排，细胞表型转化。
本发明采用荧光DDPCR方法筛选到并由Northern blot证实ROKα在肌成纤维细胞表达上调，同时发现结合RhoA的表达在AF/MF表型转化过程中也上调。尽管ROKα的蛋白表达在AF/MF表型转化过程中没有变化(结果未显示)，但使用ROKα和RhoA的特异性抑制剂Y27632和胞外酶C3阻断了AF/MF表型转化的标记蛋白α-SM-肌动蛋白的表达，表明RhoA-ROKα信号通路确实参与了AF/MF表型转化过程。而ROKα的蛋白表达无变化提示TGF-β可能通过加强的ROKα激酶活性来激活该信号通路。
总之，本发明证实了血管外膜存在RhoA/ROKα信号传导通路，并且该信号通路参与了AF向MF细胞表型转化的过程，针对该信号通路的研究就可能发现阻断乃至逆转AF向MF细胞表型转化的方法，从而为逆转血管重塑提供新的策略和思路。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种筛选通过RhoA/ROKα通路影响血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的化合物的方法，其特征在于，包括步骤(a)在测试组中，向血管外膜成纤维细胞的培养物中添加待筛选的候选物，并检测血管外膜成纤维细胞中ROKα的表达量；(b)将步骤(a)测试组中ROKα的表达量与未添加候选物的对照组中ROKα的表达量进行比较，如果测试组的ROKα表达量统计学上高于对照组，就表明该候选物是促进血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的促进剂；如果测试组的ROKα表达量统计学上低于对照组，就表明该候选物是抑制血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中还包括检测测试组血管外膜成纤维细胞中α-SM-肌动蛋白的表达量，并与对照组中α-SM-肌动蛋白的表达量进行比较。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中培养物中还添加了α-SM-肌动蛋白表达的TGF-β1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的血管外膜成纤维细胞是人、大鼠、小鼠的血管外膜成纤维细胞。
5.一种RhoA/ROKα通路抑制剂的用途，其特征在于，用于制备抑制血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的药物。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂选自Y27632胞外酶C、ROKα蛋白的抗体、ROKα的反义核酸。
7.一种RhoA/ROKα通路促进剂的用途，其特征在于，用于制备促进血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的药物。
8.一种用权利要求1所述的方法获得的通过RhoA/ROKα通路影响血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的化合物。
9.一种筛选调节血管外膜成纤维细胞(AF)转化为肌成纤维细胞(MF)的基因的方法，其特征在于，包括步骤(a)建立AF/MF转化模型；(b)用TGF-β1处理AF/MF细胞；(c)对AF/MF细胞进行基因分析，分离差异片断；(d)对差异片断测序鉴定，序列分析，获得MF上调或下调基因。
全文摘要
本发明公开了一种筛选通过RhoA/ROKα通路影响血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的化合物的方法，包括步骤(a)在测试组中，向血管外膜成纤维细胞的培养物中添加待筛选的候选物，并检测血管外膜成纤维细胞中ROKα的表达量；(b)将步骤(a)测试组中ROKα的表达量与未添加候选物的对照组中ROKα的表达量进行比较，获得血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的促进剂或抑制剂。本发明还公开了RhoA/ROKα通路促进剂和/或抑制剂的用途。
文档编号A61P43/00GK1928113SQ20051002953
公开日2007年3月14日 申请日期2005年9月9日 优先权日2005年9月9日
发明者高平进, 朱鼎良, 陈闻东, 张怡, 周晓鸥 申请人:中国科学院上海生命科学研究院, 上海市高血压研究所