专利名称：Kras基因突变检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术及医学领域，尤其涉及一种人类KRAS基因突变检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
Ras为一种原癌基因，其参与人类肿瘤的发生发展，最初是从大鼠肉瘤病毒中克隆而得。自1982年Weinberg等人发现人的膀胱癌细胞中有活化的H-Ras基因后，Ras基因引起人们极大关注。Ras基因编码的蛋白质是P21蛋白，分子量为21KD，由188-189个氨基酸组成，也称之为P21高度相关蛋白。Ras基因家族中，KRAS对人类癌症影响最大。KRAS蛋白是EGFR信号传导通路中·的一个关键的下游调节因子，KRAS突变型编码异常的蛋白，刺激促进恶性肿瘤细胞的生长和扩散，且不受EGFR信号影响。在研究EGFR突变与吉非替尼治疗进展期NSCLC患者的疗效间的关系的过程中也发现了 KRAS基因点突变，而且研究表明，KRAS基因突变与NSCLC对吉非替尼、厄洛替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关。有研究发现KRAS基因的突变使结直肠癌患者对西妥昔单抗的治疗产生耐药性。因此检测KRAS基因的突变可作为EGFR靶向治疗耐药性产生的重要预测指标。美国国家癌症综合网络(NCCN) 2009年版的临床指南中明确指出KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。该基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15-30%，在结直肠癌患者中为20-50%。导致KRAS处于激活状态的突变部位主要是位于外显子2的密码子12和13。NCCN指出KRAS基因突变会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药；使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。所以NCCN提出肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行KRAS基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。因此KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。KRAS基因突变包括以下七种常见突变类型1. Glyl2Asp (GGT)GAT)，2.Gly12Ala (GGT>GCT), 3. Glyl2Val (GGT>GTT), 4. Glyl2Ser (GGT>AGT)，5.Glyl2Arg(GGT>CGT), 6. Glyl2Cys (GGT>TGT), 7. Glyl3Asp (GGOGAC)。KRAS 基因突变为体细胞突变，因此其检测方法也不同于一般性遗传突变的检测。其检测主要存在两个方面的难点一是需要高灵敏度，因为样品模板中突变比例未知，可能突变含量只有1%甚至更低，这就需要较高检测灵敏度以准确检出这些稀有细胞。另一方面是需要高特异性，因为样品中细胞可能绝大多数都是野生型，如何在大量野生型背景中准确检出突变细胞是KRAS基因突变检测的另一个难点。目前KRAS基因突变检测的方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线检测法(High Resolution Melting Analysis, HRM),高效液相色谱法,突光定量PCR法等。其中最常见方法还是直接测序法，该法费用较低，但操作耗时长，并且它有两个明显的缺点一是灵敏度低，一般需要突变基因丰度达到10%以上才能准确检测。二是由于后续需要对PCR产物进行处理，容易出现污染导致结果不准确。因此在本领域需要一种可以高效快速准确全面地检测出KRAS基因全部七种突变的产品及方法，以便及时准确地获得KRAS基因突变的信息。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种人类KRAS基因突变检测试剂盒及检测方法，旨在解决现有技术中检测周期长、灵敏度低且检测结果不够准确的问题。本发明实施例是这样实现的，一种KRAS基因突变检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，酶溶液，7对特异性引物，I对质控引物，特异性探针，锁核酸探针，内标系统和参比染料，其中，所述7对特异性引物序列分别为SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9 和SEQ ID NO: 10，SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14，所述 I 对 质控引物为 SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16。本发明还提供一种KRAS基因突变检测方法，包括以下步骤(I)制备本发明的KRAS基因突变检测试剂盒；(2)取I只质控管和7只突变检测管，分别向其中加入步骤(I)中的PCR缓冲液、酶溶液、参比染料、特异性探针和内标系统，并向该质控管中加入质控引物，向该7只突变检测管中分别加入7对特异性引物，且该7只突变检测管中均加入锁核酸探针；(3)提取待测样品DNA，分别加入至所述I只质控管和7只突变检测管中，进行PCR反应。本发明KRAS基因突变检测试剂盒采用TaqMan探针法，建立了针对人类KRAS基因12和13密码子7种常见突变的多重实时PCR检测方法，本发明KRAS基因突变检测试剂盒中采用锁核酸探针用于阻断野生型，大大降低野生型背景，提高特异性，同时引入内标系统和UNG酶防污染系统，能更加准确，稳定的对样品进行分型检测。本发明的检测试剂盒及检测方法具有以下优点1.灵敏度高，可以在IOng野生型基因组DNA背景下准确检出1%的突变DNA ；2.特异性强针对7种不同突变位点设计引物，同时结合锁核酸探针降低了背景，能特异的识别对应突变；3.使用荧光定量PCR技术进行检测，检测过程均为闭管反应，显著降低污染，并且加入UNG酶防污染系统，确保结果真实可信；4操作简单快速，能在100分钟内完成检测，并且结果判读简单客观，便于分析。
图I为本发明的KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因野生型样品的扩增曲线图；图2为本发明的KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因第12密码子GGTXTGT突变型样品的扩增曲线图；图3为本发明的KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因第12密码子GGT>AGT突变型样品的扩增曲线图；图4为本发明的KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因第12密码子GGT>CGT突变型样品的扩增曲线图5为本发明的KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因第12密码子GGT>GTT突变型样品的扩增曲线图；图6为本发明的KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因第12密码子GGT>GAT突变型样品的扩增曲线图；图7为本发明的KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因第12密码子GGT>GCT突变型样品的扩增曲线图；图8为本发明的KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因第13密码子GGOGAC突变型样品的扩增曲线图。
具体实施例方式
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为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例提供一种KRAS基因突变检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，酶溶液，7对特异性引物，I对质控引物，特异性探针，锁核酸探针，内标系统和参比染料，其中，所述7对特异性引物序列分别为SEQ ID NO: I和SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3和SEQ IDNO:4，SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9 和 SEQ IDNO: 10，SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14，所述 I 对质控引物为 SEQ ID NO:15 和 SEQ ID NO:16。具体地，所述PCR缓冲液中含有I. 0 5· OmM的MgCl2,1. 0 5· OmM的dNTP，即dATP、dUTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 0 5· OmM0具体地，所述7对特异性引物序列及其对应的突变的碱基如表I所示表17对特异性引物序列及对应的突变的碱基
权利要求
1.一种KRAS基因突变检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，酶溶液，7对特异性引物，I对质控引物，特异性探针，锁核酸探针，内标系统和参比染料，其中，所述7对特异性引物序列分别为 SEQ ID NO: I 与 SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3 与 SEQ ID NO:4,SEQ ID NO: 5 与SEQ ID NO:6,SEQ ID N0:7 与 SEQ ID NO:8,SEQ ID N0:9 与 SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11与 SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 与 SEQ ID NO: 14，所述 I 对质控引物为 SEQ ID NO: 15 和SEQ ID NO:16。
2.如权利要求I所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述酶溶液含有Taq酶和UNG酶。
3.如权利要求I所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述锁核酸探针结构为5’ -T+AG+T+TGG+AGC+TGGTGGC-3’ -P04。
4.如权利要求I所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述特异性探针序列为SEQ ID NO: 17，且所述特异性探针5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。
5.如权利要求I所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述内标系统包含内标引物、内标探针和内标模板，且所述内标引物序列为SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 20，所述内标探针序列为SEQ ID NO:21，所述内标模板序列为SEQ ID NO:22。
6.如权利要求5所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述内标探针5’端修饰有VIC或FAM，3’端修饰有TAMRA。
7.如权利要求I所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液含有7种质粒DNA混合液，所述7种质粒DNA分别含有7种不同的KRAS突变基因，所述空白对照液为Tris-HCl缓冲液。
8.一种KRAS基因突变检测方法，包括以下步骤 (O制备如权利要求1-7中任一项所述的KRAS基因突变检测试剂盒； (2)取I只质控管和7只突变检测管，分别向其中加入步骤(I)中的PCR缓冲液、酶溶液、参比染料、特异性探针和内标系统，并向所述I只质控管中加入步骤(I)中的质控引物，向所述7只突变检测管中分别加入步骤(I)中的7对特异性引物，且所述7只突变检测管中均加入锁核酸探针； (3)提取待测样品DNA，分别加入至所述I只质控管和7只突变检测管中，进行PCR反应。
9.如权利要求8所述的KRAS基因突变检测方法，其特征在于，所述步骤(3)的PCR反应体系中各组分终浓度及含量如下PCR 缓冲液12.5-15 μ各对引物0.2 μΜ-1μΜ各条探针O. I μΜ-0.5 μ.ΜTaq 酶0.5 U-1 .OU UNG 酶0.1U-0_5U内标模板50-100 copies 参比染料1-2 μ待测样品DNA2μ1· 加水至25 μ1
10.如权利要求8所述的KRAS基因突变检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR反应条件为 ·37 0C 10 分钟，95°C 5 分钟， · 40 个循环95°C 15 秒，60°C 60 秒。
全文摘要
本发明适用于生物技术及医学领域，提供了一种KRAS基因突变检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，7对特异性引物，1对质控引物，特异性探针，锁核酸探针，内标系统，酶溶液和参比染料。本发明还提供了一种人类KRAS基因七种突变检测方法。本发明的检测试剂盒具有以下优点1.灵敏度高；2.特异性强；3.减少污染，确保结果真实可信；4操作简单快速。
文档编号C12Q1/68GK102888466SQ201210422269
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月30日 优先权日2012年10月30日
发明者蔡从利, 张喆, 周鹏飞 申请人:武汉友芝友生物制药有限公司