一种构建自发性高尿酸血症小鼠模型的方法及其用途
【专利摘要】本发明公开了一种构建自发性高尿酸血症小鼠模型的方法。本发明所提供的构建自发性高尿酸血症小鼠模型的方法包括如下步骤：利用类转录激活因子效应物核酸酶敲除目的小鼠的尿酸氧化酶基因，得到所述尿酸氧化酶基因被敲除的纯合体小鼠即为自发性高尿酸血症小鼠模型。实验证明，利用本发明方法所得的自发性高尿酸血症小鼠模型的血尿酸水平为野生型小鼠的3-4倍，达到了高尿酸血症的水平，更好的模拟了原发性高尿酸血症的发病过程。另外，由于本发明所得血尿酸水平相对于之前文献报道的超高水平血尿酸值要低，不存在致死性高尿酸血症，小鼠存活时间长，利于对该类小鼠行长期实验。
【专利说明】一种构建自发性高尿酸血症小鼠模型的方法及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】。涉及一种自发性高尿酸血症小鼠的模型的方法及该模 型的用途。
【背景技术】
[0002] 高尿酸血症是尿酸合成增加和（或）尿酸排泄减少所引起的全身性疾病，目前已 成为常见的代谢性疾病，其患病率达5%-23. 5%，接近欧美发达国家水平。近年来国内外 研究资料显示，高尿酸血症患者中有20%可发生痛风。另外，作为心脑血管疾病的独立危险 因素，高尿酸血症可诱发和加重动脉粥样硬化性疾病，增加心脑血管疾病的发病率和死亡 率，同时，高尿酸血症也与代谢综合征、肾脏疾病密切相关。
[0003] 尿酸氧化酶可将尿酸分解为更易溶于水的小分子尿囊素排出体外，这是许多低级 动物（包括小鼠）维持尿酸稳态的主要途径。与低级动物不同，人类在进化过程中由于基 因突变，导致该基因不能表达尿酸氧化酶，这是人类易患高尿酸血症的重要原因。有关资料 显示，尿酸氧化酶基因敲除后，小鼠可出现高尿酸血症和痛风症状，成为与人类高尿酸血症 发病机制非常相似的自发性高尿酸血症小鼠动物模型。但之前文献报道的高尿酸血症小鼠 模型存在下列缺陷：（1)尿酸氧化酶基因缺失的纯合子小鼠于出生后4周内有超过一半死 亡；(2)纯合子小鼠血尿酸水平是野生型小鼠的10倍余，合并致死性肾脏疾病等，从而无法 模拟人类的发病过程。
[0004] 基于类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)的靶向基因修饰技术是一种崭新的分子生物学工具，其本质是一个人工 合成的核酸酶，主要有两个结构域：特异性识别靶核酸序列的结合功能域，切断DNA序列 的核酸酶功能结构域。人工构建的序列特异性核酸内切酶能够识别并切割特定的DNA靶 序列，造成双链断裂从而使得翻译提前终止或者蛋白读码框移位，基因功能性失活。TALEN 技术自2010年底开始成功应用于基因打靶，很快成为一种比锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN)更容易设计、特异性更高、毒性更低的人工核酸内切酶。TALE蛋白家族来 自一类特殊的植物病原体--黄单胞杆菌，TALE蛋白类似于真核生物的转录因子，它可以 通过识别特异的DNA序列调控宿主植物内源基因的表达，从而提高宿主对该病原体的易感 性。TALE蛋白N端一般有转运信号，C端有核定位信号和转录激活结构域，而中部则是介 导其与DNA特异识别与结合的结构域。TALE蛋白的中部包含一段很长的、串联排列的重复 序列，这种重复序列为这一蛋白家族所独有，是其DNA结合结构域的一个重要组成部分，具 有特异性识别并结合特异DNA序列的特性。其序列重复的部分由1到33个长度为33? 35个氨基酸残基的重复单位（或称重复单元）串联后，再加上末尾（C端）的一个含有20 个氨基酸残基的半重复单位构成。也就是说，TALE蛋白的DNA结合结构域包含一段连续的 1. 5?33. 5个重复单位，其中每个重复单位以及末尾的半重复单位可特异地识别并结合一 个特定的核苷酸靶位点。在每个重复单位中，+12和+13位的氨基酸残基是实现靶向识别 特异DNA碱基的关键位点，随靶点核苷酸序列的不同而异，被称作重复可变双残基（Repeat variable di-residue，RVD);其他位置的氨基酸残基则相对固定。不同的RVD能够相对特 异地分别识别A、T、C、G这4种碱基中的一种或多种，其中分别与这4种碱基相对应的最常 见的4种1^0分别是见仏811116)、如仏811617)、册〇^8 48口）和剛仏811六811)。由此可 见，TALE的重复单元跟靶序列具有很好的一一对应性。另外，应用TALEN技术构建周期短， 通常6个月即可得到基因敲除的杂合子小鼠。
[0005] 自发性高尿酸血症小鼠模型是研究高尿酸血症发病机制、筛选治疗高尿酸血症新 药的重要工具，因此构建自发性高尿酸血症小鼠模型势在必行。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种构建自发性高尿酸血症小鼠模型的方法。
[0007] 本发明所提供的构建自发性高尿酸血症小鼠模型的方法，包括如下步骤：利用类 转录激活因子效应物核酸酶（TALEN)技术敲除目的小鼠的尿酸氧化酶基因，得到所述尿酸 氧化酶基因被敲除的纯合体小鼠即为自发性高尿酸血症小鼠模型。
[0008] 在本发明中，所述类转录激活因子效应物核酸酶作用于所述尿酸氧化酶基因的其 中一个编码蛋白--尿酸氧化酶-001的第三个外显子，其核苷酸序列如序列表中序列5所 /Jn 〇
[0009] 具体而言，在本发明中，所述类转录激活因子效应物核酸酶对所述尿酸氧化酶基 因的两个作用靶点分别为：序列表中序列5的第20-34位，以及序列表中序列5的第51-66 位。
[0010] 更加具体的，在本发明中，组成所述类转录激活因子效应物核酸酶的两个TALEN 蛋白的氨基酸序列分别如序列表中序列3和序列表中序列4所示；序列3所示的TALEN蛋 白作用于序列5的第20-34位；序列4所示的TALEN蛋白作用于序列5的第51-66位。
[0011] 其中，序列3由934个氨基酸组成，第176-666位为RVD区域，第689-934位为Fok I结构域。序列4由966个氨基酸组成，第176-700为RVD区域，第723-966位为Fok I结 构域。
[0012] 所述序列3所示的TALEN蛋白的编码序列具体如序列表中序列1的第383-3187 位所示；所述序列4所示的TALEN蛋白的编码序列具体如序列表中序列2的第332-3232位 所示。
[0013] 在本发明中，所述方法具体可包括如下步骤：
[0014] (1)将序列表中序列1的第383-3187位和序列2的第332-3232位所示的两个DNA 片段分别进行体外转录，得到两段mRNA序列，分别记为TALEN-LlmRNA和TALEN-RlmRNA ;
[0015] 所述TALEN-LlmRNA的序列为将序列1中的T替换为U后得到的序列；所述 TALEN-RlmRNA的序列为将序列2中的T替换为U后得到的序列；
[0016] (2)将步骤（1)获得的所述TALEN-LlmRNA和所述TALEN-RlmRNA注射到所述目的 小鼠的受精卵胞质中，得到代小鼠；
[0017] 所述代小鼠在基因型上为嵌合体小鼠；
[0018] (3)将步骤⑵获得的所述R)代小鼠与新的所述目的小鼠（野生型）进行杂交， 从Fl代小鼠中获得所述尿酸氧化酶基因被敲除的杂合体小鼠；
[0019] (4)将雄性的所述杂合体小鼠与雌性的所述杂合体小鼠进行一次或多次杂交，从 杂交后代中获得所述尿酸氧化酶基因被敲除的纯合体小鼠；所述纯合体小鼠即为自发性高 尿酸血症小鼠模型。
[0020] 在所述方法的步骤⑵中，将所述TALEN-LlmRNA和所述TALEN-RlmRNA注射 到所述目的小鼠的受精卵胞质中，具体为：将5 μ g所述TALEN-L ImRNA和5 μ g所述 TALEN-RlmRNA注射到所述目的小鼠的所述受精卵胞质中。
[0021] 在本发明中，所述目的小鼠具体为C57BL/6J小鼠。
[0022] 本发明的另一个目的是用于构建自发性高尿酸血症小鼠模型的试剂盒。
[0023] 本发明所提供的用于构建自发性高尿酸血症小鼠模型的试剂盒，可包括如下（al) 和（a2):
[0024] (al) TALEN-LlmRNA，其序列为将序列1中的T替换为U后得到的序列；
[0025] (a2) TALEN-RlmRNA，其序列为将序列2中的T替换为U后得到的序列。
[0026] 所述试剂盒中还含有记载有上述步骤（2)-(4)内容的说明书。
[0027] 其中，将所述TALEN-LlmRNA和所述TALEN-RlmRNA注射到所述目的小鼠的受精卵 胞质中，为：将5 μ g的所述TALEN-LlmRNA和5 μ g的所述TALEN-RlmRNA注射到所述目的小 鼠的所述受精卵胞质中。所述目的小鼠具体为C57BL/6J小鼠。
[0028] 在本发明中，所述尿酸氧化酶基因敲除是指尿酸氧化酶基因发生突变，导致尿酸 氧化酶蛋白读码框改变，尿酸氧化酶蛋白功能性失活。所述尿酸氧化酶基因被敲除的杂合 体小鼠是指来自父方和母方的两套染色体中有一套染色体的所述尿酸氧化酶基因被敲除， 另一套未被敲除。所述尿酸氧化酶基因被敲除的纯合体小鼠是指来自父方和母方的两套染 色体上的所述尿酸氧化酶基因均被敲除。进一步，在本发明的一个实施例中，所述尿酸氧化 酶基因被敲除具体体现为缺失序列表中序列5的第17-44位核苷酸。
[0029] 在本发明中，所述自发性高尿酸血症小鼠模型中的"自发性"主要体现为：所述小 鼠模型（即所述尿酸氧化酶基因被敲除的纯合体小鼠）的血尿酸含量相对于野生型小鼠的 水平为高尿酸血症状态，且不同于传统给药造模构建的继发性高尿酸血症。
[0030] 实验证明，利用本发明方法所得的自发性高尿酸血症小鼠模型（即所述尿酸氧化 酶基因被敲除的纯合体小鼠）的血尿酸水平为野生型小鼠的3-4倍（包括雌雄小鼠）。另 夕卜，由于本发明所得小鼠模型的血尿酸水平相对于之前文献报道的超高水平血尿酸值要 低，不存在致死性高尿酸血症，小鼠存活时间长，利于对该类小鼠实施长期实验。
[0031] 本发明的优势：现有的高尿酸血症动物模型尚缺乏稳定性和持久性，与人类发病 机制存在不同程度的差距，造模用药剂量和时间不统一，缺乏公认的建立模型的标准，造模 导致的肾损害和动物的死亡率问题需要仍待处理。本发明所制备的自发性高尿酸血症小鼠 模型更近似于人类嘌呤代谢障碍和（或）尿酸排泄障碍所形成的持久稳定的高尿酸血症动 物模型，利于观察治疗药物对尿酸排泄和嘌呤代谢的作用以及对尿酸盐沉积的影响，从而 为商尿酸血症治疗提供研究基础和思路。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图1为TALEN技术尿酸氧化酶基因敲除示意图。
[0033] 图2为体外转录mRNA的1%琼脂糖凝胶电泳结果图。其中，泳道1为不带有 po IyA的TALEN-LlmRNA ;泳道2为带有po IyA的TALEN-LlmRNA ;泳道3为纯化后带有 polyA 的 TALEN-LlmRNA ;泳道 4 为不带有 polyA 的 TALEN-RlmRNA ;泳道 5 为带有 polyA 的 TALEN-RlmRNA ;泳道 6 为纯化后带有 polyA 的 TALEN-RlmRNA ;泳道 7 为 DL2000DNA Marker (Takara) 〇
[0034] 图3为R)代小鼠基因型鉴定结果图（两个下划线区域为TALEN的两个靶序列， 中间区域为TALEN的spacer区域）。其中，WT为野生型小鼠；6#和12#为2个R)代小鼠 (12#小鼠的尿酸氧化酶基因的2个拷贝突变的不一样）。
[0035] 图4为尿酸氧化酶基因被敲除的Fl代杂合体小鼠的基因型比较分析一TALEN作 用位点附近敲除前后序列比对结果。其中，WT为野生型小鼠（即敲除前）；MT为Fl代杂合 体小鼠（即敲除后）。
[0036] 图5为Fl代杂合体小鼠的尿酸氧化酶基因敲除前后转录本1和3编码蛋白序列 比对结果。其中，WT为野生型小鼠（即敲除前）；MT为Fl代杂合体小鼠（即敲除后）。
[0037] 图6为F2代小鼠基因型鉴定电泳图结果。泳道10-21对应待测的F2代小鼠。其 中，泳道10和13对应的小鼠为纯合体（仅得到一条大小为206bp)，泳道12、14、15、16、17、 18、20对应的小鼠为杂合体（得到两条大小分别为234bp和206bp的目的条带），泳道11、 19和21为野生型（仅得到一条大小为234bp)。WT为作为对照的野生型C57BL/6J小鼠； H2O为以水代替模板的对照。
[0038] 图7为RNA水平验证F2代纯合体小鼠的尿酸氧化酶基因敲除。Homo :纯合体小 鼠 ；WT :野生型小鼠；*#p〈0. 001。
[0039] 图8为实施例1采用TALEN技术获得的基因敲除的8周龄雄性纯合体小鼠的照片。
[0040] 图9为实施例1采用TALEN技术获得的基因敲除的8周龄雌雄性纯合体小鼠及同 窝野生型小鼠血尿酸水平。Homo :纯合体小鼠 ；WT :野生型小鼠；#p〈0. 01。
[0041] 图10为实施例1采用TALEN技术获得的基因敲除的8周龄雄性纯合体小鼠肾脏 大体观察结果。A为纯合体小鼠肾脏大体肉眼观察照片，B为纯合体小鼠肾脏大体解剖镜下 观察结果（10倍）。
[0042] 图11为实施例1采用TALEN技术获得的基因敲除的8周龄雄性纯合体小鼠及同 窝野生型小鼠的肾脏病理检测。A为野生型小鼠肾脏HE染色（镜下X 40倍）；B为纯合体 小鼠肾脏HE染色（镜下X 40倍）。
【具体实施方式】
[0043] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0044] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045] 各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、Taq酶及PCR相关试剂购自NEB公司。常规化 学试剂主要购自Sigma和上海化学试剂公司。胶回收试剂盒，质粒抽提试剂盒购于Qiagen 公司，体外转录试剂盒购自Invitrogen公司。
[0046] C57BL/6J小鼠：斯莱克公司。
[0047] 实施例1、自发性高尿酸血症小鼠模型的构建
[0048] 本实施例利用类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN)技术敲除C57BL/6J小鼠的 尿酸氧化酶基因，得到所述尿酸氧化酶基因被敲除的纯合体小鼠即为自发性高尿酸血症小 鼠模型。
[0049] 一、TALEN 位点设计
[0050] 小鼠的尿酸氧化酶基因 （MGI :98907 ;基因染色体位置：Chr3:146597077-1466323 05bp,+strand)可产生4个转录本，2个可编码蛋白。尿酸氧化酶-001，尿酸氧化酶-003分 别为303aa和199aa。本发明的发明人针对尿酸氧化酶-001的第三个外显子设计TALEN， 该外显子的序列信息如下（设计TALEN的两个靶序列为下划线标记处，中间区域为TALEN 的spacer区域）：
[0051] 5, -ATCAGAAACATCGAGACCTTTGCAATGAACATCTGTGAGCACTTCCTCTCTTCTTTTAACCATGTC ACTCGAGCCCACGTCTACGTGGAAGAGGTCCCCTGGAAACGATTTGAAAAG-3'（序列 5)。
[0052] 最终设计并人工合成得到组成类转录激活因子效应物核酸酶的两个TALEN蛋白 对应的两段DNA序列，分别如序列表中序列1的第383-3187位和序列2的第332-3232位 所示。其中，序列1的第383-3187位编码序列表中序列3所示的TALEN蛋白；序列2的 第332-3232位编码序列表中序列4所示的TALEN蛋白。序列3由934个氨基酸组成，第 176-666位为RVD区域，第689-934位为Fok I结构域。序列4由966个氨基酸组成，第 176-700为RVD区域，第723-966位为Fok I结构域。
[0053] TALEN技术基因敲除示意图如图1所示。
[0054] 二、TALEN 体外转录
[0055] 采用mMESSAGE mMACH丨NE ? T7Ultra Kit对步骤一设计合成的序列1的 第383-3187位和序列2的第332-3232位所示两个DNA序列分别进行体外转录，产物使 用MEGAclearTM Kit纯化。相关操作步骤详见相关产品说明书。体外转录mRNA的1% 琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。最终得到两段mRNA序列，分别记为TALEN-LlmRNA和 TALEN-RlmRNA。
[0056] 其中，所述TALEN-LlmRNA的序列为将序列1中的T替换为U后得到的序列；所述 TALEN-RlmRNA的序列为将序列2中的T替换为U后得到的序列。
[0057] 三、TALEN mRNA注射受精卵获得R)代嵌合体小鼠
[0058] 用 I X TE 缓冲溶液（配方：1M Tris-HCl(pH 8.0) lml，加 0.5M EDTA(pH 8. 0)0. 2ml，用去离子水定容至100ml)将步骤二体外转录获得的两段mRNA配制成100 μ I 体系，使其中TALEN-LlmRNA和TALEN-RlmRNA的终浓度均为50ng/ μ 1。将配置好的样品注 射到C57BL/6J小鼠的受精卵胞质中，于37°C培养24小时至二细胞期后移植到代孕雌鼠中， 至代小鼠出生。
[0059] 四、FO代小鼠基因型的鉴定
[0060] 1、H)代小鼠基因组制备
[0061] 代小鼠出生14天剪取鼠尾0. 3cm，加400 μ 1裂解液（由上海南方模式生物研 究中心提供，产品目录号：匪S014)及40μ 1蛋白酶Κ(浓度为10mg/ml)，56°C消化过夜。离 心取上清，两倍体积无水乙醇沉淀，75 %乙醇洗涤，稍晾干后溶解于100 μ 1纯水中，50°C烘 箱助溶1小时。
[0062] 2、R)代小鼠基因型鉴定
[0063] 以步骤1获得的各R)代小鼠的基因组为模板，使用NEB LongAmpR Taq DNA Polymerase 扩增鉴定片段，引物为 5' -ggctgggtttagtggcgatttc-3' 和 5'-tcccgtgagtaggcatttggtgat_3'。可扩增出约 1500bp 条带。反应条件为 94°C30s 变性 后；94°C 20s，65°C 90s，进行31个循环；65°C延伸lOmin。PCR体系参见NEB说明书。1%琼 脂糖凝胶电泳后割胶回收约1500bp条带，使用Qiagen胶回收Kit，最后直接用水回收DNA， 体积为20 μ 1。回收产物连接T-载体，转化后涂于Amp+LB平板上，37°C培养16小时。每块 平板挑取6个单克隆送测序，测序引物为5'-ggctgggtttagtggcgatttc_3'。测序结果发现 尿酸氧化酶-OOl的第三个外显子区出现缺失或移码的小鼠为阳性。
[0064] 结果显示，通过受精卵胞质注射和移植，受体小鼠数为8只，怀孕数为3只，怀孕率 37. 50%;移植卵数为144,出生小鼠（R)代）数为19,出生率13. 19%。阳性11只，阳性率 57. 89%。部分阳性小鼠（6#和12#)的基因型鉴定结果如图3所示。
[0065] 五、Fl代杂合体小鼠的获得及基因型鉴定
[0066] 1、Fl代小鼠的获得
[0067] 根据步骤四对R)代小鼠的基因测序结果，选取尿酸氧化酶编码蛋白序列出现移 码的代雄鼠（12#)与野生型C57BL/6J雌鼠交配，得到Fl代小鼠（野生型和杂合型）。
[0068] 2、F1代小鼠基因组制备
[0069] 参照步骤四1进行。
[0070] 3、F1代小鼠基因型鉴定
[0071] 参照步骤四2进行。
[0072] 结果显示，最终获得的Fl代杂合体小鼠为缺失28个碱基对的尿酸氧化酶基因敲 除杂合子小鼠（即缺失序列表中序列5的第17-44位核苷酸）（图4)。相应的，由此而引起 的Fl代杂合体小鼠的尿酸氧化酶基因敲除前后转录本1和3编码蛋白序列比对结果如图 5所示。
[0073] 六、F2代纯合体小鼠的获得及基因型鉴定
[0074] 1、F2代小鼠的获得
[0075] 选取步骤五获得的Fl代杂合体雄性小鼠与步骤五获得的Fl代杂合体雌性小鼠， 进行杂交，得到F2代小鼠（野生型、杂合型和纯合型）。
[0076] 2、F2代小鼠基因组制备
[0077] 参照步骤四1进行。
[0078] 3、F2代小鼠基因型鉴定
[0079] 以步骤2获得的F2代小鼠的基因组为模板，使用NEB LongAmp? Taq DNA Polymerase 扩增鉴定片段，引物为 5' -acagatcagaaacatcgaga-3' 和 5'-tggacgtgtttgatcccatt_3'。反应条件为 94°C 30s 变性后；94°C 20s，65°C 90s,进行 31 个循环；65°C延伸lOmin。PCR体系参见NEB说明书。反应结束后进行1 %琼脂糖凝胶电泳。 同时设置了野生型C57BL/6J小鼠作为对照，设置以水代替模板的对照。
[0080] 电泳结果如图6所示，泳道10-21对应待测的F2代小鼠。其中，泳道10和13对应 的小鼠为纯合体（仅得到一条大小为206bp的目的条带），泳道12、14、15、16、17、18、20对 应的小鼠为杂合体（得到两条大小分别为234bp和206bp，泳道11、19和21为野生型（仅 得到一条大小为234bp的目的条带）。进一步经测序证实，234bp的目的条带与206bp的目 的条带相差的28bp正为序列表中序列5的第17-44位核苷酸。
[0081] 七、RNA水平验证F2代纯合体小鼠的尿酸氧化酶基因敲除成功
[0082] 1、RNA抽提：取野生型及F2代纯合体小鼠肝脏组织，剪碎，置于硬壁管，力口 入Iml Trizol (Roche公司）及瓷珠10粒，于全自动样品快速研磨仪（上海净信科技； TiSSuelySer48)中震荡60秒，震荡频率为70Hz。离心取上清液。后续RNA抽提步骤按 TIANGEN-kit(PRlOOll)说明书进行。
[0083] 2、反转录：按TaKaRa(RR047A)反转试剂盒说明书对抽提的RNA进行反转。
[0084] 3、RT-PCR :尿酸氧化酶基因的检测引物为 5' -gtgagcacttcctctcttcttt-3' 和5' -ggacgtgtttgatcccattct-3'，作为内的Actin基因的检测引物为 5,-Ctccctggagaagagctatga-Sj和 5'-ggcatagaggicttiacggatg-S'。反应条件为 94。。30s 预变性后；94°C 10s，57°C 20s，72°C 20s，进行40个循环。反应体系参见TaKaRa(RR047A)说 明书。应用软件OriginProS进行统计分析，得到结果如图7。说明从RNA水平来说，尿酸氧 化酶基因已经敲除成功。
[0085] 实施例2、F2代纯合体小鼠的表型及生理特性鉴定
[0086] 一、小鼠表型观察
[0087] 实施例1得到的F2代纯合体小鼠、杂合体小鼠及同窝野生型小鼠均与普通的C57 小鼠相似。毛色均为黑色，饮食活动均正常，且无发育不全及畸形。其中图8为实施例1采 用TALEN技术获得的基因敲除的8周龄雄性纯合体小鼠的照片。
[0088] 二、血尿酸水平检测
[0089] 检测实施例1应用TALEN技术获得的基因敲除8周龄雌雄性纯合体及同窝野生型 小鼠血尿酸水平。具体如下：
[0090] 8周龄雌雄性纯合体及同窝野生型小鼠分为4组，即雄性纯合子小鼠、雌雄纯合 子小鼠、雄性野生型小鼠及雌雄野生型小鼠，每组各5只小鼠。将小鼠禁食不禁水14小时 后，称取体质量，将浓度为10% (l〇g/l〇〇mL)的水合氯醛水溶液按照3mL/kg体重的用量对 小鼠进行腹腔麻醉，并于内眦静脉处采取静脉血，3500r/min离心15分钟分离出血清，在 TOSHIBA TBA-40FR全自动生化分析仪上检测血尿酸（UA)值。每份测试样本重复测定三次， 结果取平均值。
[0091] 结果显示，纯合体小鼠血尿酸水平为同窝野生型小鼠的3-4倍（包括雌雄小鼠）， 且差异有统计学意义。详细结果见图9。可见，纯合体小鼠的血尿酸水平达到了高尿酸血症 的水平，更好的模拟了原发性高尿酸血症的发病过程。
[0092] 三、病理观察
[0093] 解剖实施例1应用TALEN技术获得的基因敲除纯合体小鼠，肉眼见大体表面呈不 规则形态，布满黄色结节样物，结果见图10中A。解剖镜下见明显肾盂积水，肾脏结构异常， 结果见图10中B。
[0094] 解剖实施例1应用TALEN技术获得的基因敲除纯合体、野生型小鼠，制备肾脏切 片，通过HE染色检查病理变化。从病理切片可见，野生型小鼠为正常肾脏形态，纯合体小鼠 见肾小球结构异常，有肾结石形成，结果见图11。
【权利要求】
1. 一种构建自发性高尿酸血症小鼠模型的方法，包括如下步骤：利用类转录激活因子 效应物核酸酶敲除目的小鼠的尿酸氧化酶基因，得到所述尿酸氧化酶基因被敲除的纯合体 小鼠即为自发性高尿酸血症小鼠模型。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述类转录激活因子效应物 核酸酶作用于所述尿酸氧化酶基因的如下片段：序列表中序列5所示的DNA片段。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述类转录激活因子效应物核酸酶对所 述尿酸氧化酶基因的两个作用靶点分别为：序列表中序列5的第20-34位，以及序列表中序 列5的第51-66位。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：组成所述类转录激活因子效应物核酸酶 的两个TALEN蛋白的氨基酸序列分别如序列表中序列3和序列表中序列4所示；序列3所 示的TALEN蛋白作用于序列5的第20-34位；序列4所示的TALEN蛋白作用于序列5的第 51-66 位。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述序列3所示的TALEN蛋白的编码序 列如序列表中序列1的第383-3187位所示；所述序列4所示的TALEN蛋白的编码序列如序 列表中序列2的第332-3232位所示。
6. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤： (1) 将序列表中序列1的第383-3187位和序列2的第332-3232位所示的两个DNA片 段分别进行体外转录，得到两段mRNA序列，分别记为TALEN-LlmRNA和TALEN-RlmRNA ; (2) 将步骤（1)获得的所述TALEN-LlmRNA和所述TALEN-RlmRNA注射到所述目的小鼠 的受精卵胞质中，得到代小鼠； (3) 将步骤（2)获得的所述R)代小鼠与所述目的小鼠进行杂交，从F1代小鼠中获得所 述尿酸氧化酶基因被敲除的杂合体小鼠； (4) 将雄性的所述杂合体小鼠与雌性的所述杂合体小鼠进行一次或多次杂交，从杂交 后代中获得所述尿酸氧化酶基因被敲除的纯合体小鼠；所述纯合体小鼠即为自发性高尿酸 血症小鼠模型。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，将所述TALEN-LlmRNA和所 述TALEN-RlmRNA注射到所述目的小鼠的受精卵胞质中，为：将5 y g的所述TALEN-LlmRNA 和5 y g的所述TALEN-RlmRNA注射到所述目的小鼠的所述受精卵胞质中。
8. 根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述目的小鼠为C57BL/6J小 鼠。
9. 用于构建自发性高尿酸血症小鼠模型的试剂盒，包括如下（al)和（a2): (al)TALEN-LlmRNA，其序列为将序列1中的T替换为U后得到的序列； (a2)TALEN-RlmRNA，其序列为将序列2中的T替换为U后得到的序列。
10. 根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有记载有权利要求 6中的步骤（2)-⑷内容的说明书； 所述说明书中，所述"将步骤（1)获得的所述TALEN-LlmRNA和所述TALEN-RlmRNA注 射到所述目的小鼠的受精卵胞质中"，具体为：将5 y g的所述TALEN-LlmRNA和5 y g的所述 TALEN-RlmRNA注射到所述目的小鼠的所述受精卵胞质中； 所述目的小鼠具体为C57BL/6J小鼠。
【文档编号】C12N15/89GK104388467SQ201410584163
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】李长贵, 路杰 申请人:李长贵