专利名称：多孔骨修复材料及其制造方法
技术领域：
本发明涉及医疗领域中用于修复骨缺损部的多孔骨修复材料及其制造方法。
背景技术：
作为针对肿瘤或坏死等骨病变的骨组织切除手术、或针对外伤引起的骨组织缺损部位的治疗方法，近年来使用再生医疗的手法。迄今为止，针对骨的缺损部位，填充金属等非生物体吸收性材料，只是单纯修复缺损部的形态，没有考虑骨组织本身的再生。再生医疗的手法根据组织学的概念、结合构成生物体组织的细胞和固定材料以及诱导细胞分化的因子(信号物质等)而使失去的生物体组织(此处是指骨组织)再生的医疗手法。
作为脚手架材料，要求具有对生物体的危害性低且在一定时间内可被代谢吸收的特性，在有机材料中，正在尝试使用胶原、明胶、壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸等。另外，特别是在骨组织或牙齿再生中，正在应用无机材料如磷酸三钙等磷酸钙类材料。
羧甲基壳多糖(下面称为CM壳多糖)与壳聚糖一样，是构成螃蟹等甲壳类的外骨骼的甲壳质的衍生物，通过适当的交联处理而具有脚手架材料的特性。
例如，对混入了磷酸钙类化合物粉末的壳多糖(含有壳多糖、壳聚糖以及它们的衍生物)溶液实施真空热干燥等，交联状态的壳多糖形成承载有磷酸钙类化合物粒子的复合体，进而通过未交联的壳多糖使该复合体表面形成被膜，该生物体移植材料和生理盐水等液体进行捏炼而具有适当的粘合性(参照专利文献1)。
根据专利文献1，通过该手法，由未交联的壳多糖构成的被膜具有水溶性，所以和生理盐水等液体进行捏炼而具有适当的粘度，进而因为壳多糖进行交联形成的承载磷酸钙类化+物粒子的复合体不溶于水，所以在复合体内牢固地承载上述粒子并填充在骨的缺损部，且没有出现移动、脱落，骨骼在骨缺损部早期出现再生增殖，从而能够提供具有很大治疗效果的生物体移植材料。
另外，也公开了由热交联后的壳多糖或其衍生物构成的吸收性生物体材料、以及以实施真空热交联处理为主要特征的吸收性生物体材料的制造方法(参照专利文献2)。
根据专利文献2，相对容易地提供作为生物体内的安全的吸收性材料的生物体材料，同时能够通过使用该材料而提供促进骨生成的环境。
另外，为了改善在吸收性生物体材料中修正(trimming)时的强度以及生物体内环境下的强度，充分减缓在生物体内的吸收速度，也有由通过环氧化合物交联的衍生物构成的、且含钙的吸收性生物体材料(参照专利文献3)。
另外，作为促进生物体骨形成的材料，示出由包括下述工序的方法形成的骨形成材料，即，通过有机酸溶解壳多糖·壳聚糖以成为壳多糖·壳聚糖溶胶的工序、在该壳多糖·壳聚糖溶胶中混合骨形成用蛋白质制作含有该骨形成用蛋白质的壳多糖·壳聚糖溶胶的工序、把混合了上述骨形成用蛋白质的上述壳多糖·壳聚糖溶胶与羟基磷灰石、α-TCP、β-TCP、CaCO3、CaO、ZnO、CaSiO3、MgO等的粉末进行捏炼而得到捏炼物的工序(参照专利文献4)。
专利文献1特开平6-105901号公报，专利文献2特开平7-116241号公报，专利文献32002-11090号公报，专利文献4特开平11-347112号公报。
如前所述，再生医疗的手法是根据组织学的概念，组合构成生物体组织的细胞和成为脚手架的材料以及诱导细胞分化的因子(信号物质等)而使失去的生物体组织(此处是指骨组织)再生的医疗手法。当在生物体内只埋置材料时，生物体内预先存在的细胞以及因子进入到材料内部，由此在该处(in situ)期望出现组织的再生。从这种观点出发，如果研究现有技术需要考虑下述问题。
首先，专利文献1所述的生物体移植材料，是用生物体吸收性较慢的壳多糖或其衍生物覆盖磷酸钙类化合物颗粒，从而减慢成骨细胞与磷酸钙类颗粒的接触。
另外，对于专利文献2，3所述的材料，由于通过溶液的冻结干燥形成多孔体，因此得到的成形体的微细结构，成为用溶质凝聚形成的(此时是指壳多糖衍生物)的隔膜遮蔽冰的晶体升华而残留的空洞的形状(所谓蜂窝状结构)。当为这种结构时，因为各气孔没有形成完全的连续气孔，所以减慢再生骨组织的成骨细胞等细胞群进入到材料内部。当为专利文献3所述的材料时，由于进一步地用环氧化合物交联壳多糖衍生物，所以也担心有交联剂残留。
此外，专利文献4中所述的骨形成促进材料，采用在生物体内或生物体外固化捏炼物的方法。在该手法中，固化物只含有数微米以下的气孔，实质上阻断了再生骨组织的细胞。为此，骨组织只在材料被生物体吸收之后才出现再生。
综上所述，现有手法的缺点都在于，减慢磷酸钙类粒子与对成骨细胞等骨进行再构建的细胞群之间的接触。
另外，从壳多糖和磷酸钙颗粒的复合体形成方法的观点来看，存在下述的课题。
上述的现有技术都使用在壳多糖溶液中混合磷酸钙颗粒的手法。通常情况下，壳多糖溶液的密度稍超过1，磷酸钙颗粒的密度约为3。为此，密度差在成形过程中引起颗粒的沉淀，制作的复合体成为磷酸钙下部的配合比较高的不均匀物质。为了避免这种问题，必须采用在溶液冰点以下的温度下进行颗粒的搅拌混合以及成形等繁琐的手法。
发明内容
鉴于现有技术的这种问题，本发明的目的在于，通过防止磷酸钙颗粒分布的偏差而使骨均匀进入其内部，通过使骨修复材料内部的气孔处于基本连通状态而使骨大量进入其内部，增大磷酸钙颗粒在骨修复材料内部的气孔内的露出面积，从而促进骨进入其内部。
为了解决上述课题，本发明者进行了潜心研究，其结果发现，当使用由壳多糖或其衍生物构成的纤维形成集合体时，能够构成基本上完全连续的气泡，其实质上能在集合体纤维之间均匀地承载磷酸钙颗粒，从而完成了本发明。
即，本发明提供一种多孔骨修复材料，在含有由壳多糖或其衍生物构成的脚手架材料和由磷酸钙构成的细胞分化诱导材料的骨修复材料中，上述壳多糖或其衍生物形成纤维状并成为多孔集合体，同时磷酸钙成为颗粒状并在上述集合体的纤维间被承载。
另外，本发明在制造由壳多糖或其衍生物的纤维集合体和其纤维间所承载的磷酸钙颗粒构成的多孔骨修复材料时，提供一种多孔骨修复材料的制造方法，包括壳多糖或其衍生物形成纤维的工序、在减压条件下交联该纤维的工序、把该交联纤维与磷酸钙颗粒以及该交联纤维的保水量以下的水相混合而形成大致均匀的混合物的工序、冻结干燥该混合物而成为多孔性材料的工序。
在本发明的多孔骨修复材料中，壳多糖或其衍生物在再生医疗手法中是作为脚手架的材料，磷酸钙颗粒是诱导细胞分化的材料。
在本发明中，使壳多糖或其衍生物成为纤维的集合体有下述理由。
即，通过形成在纤维集合体的纤维之间承载磷酸钙颗粒的结构，能够防止在制造骨修复材料时出现颗粒沉淀且颗粒分布出现偏差。另外，纤维集合体具有基本上完全连续的气孔，所以骨细胞能够大量进入到其内部。而且，能够成为磷酸钙颗粒在连续气孔内露出的状态，所以能够很好地诱导细胞分化。
作为壳多糖或其衍生物，在制造工序上优选可以溶解于中性水的羧甲基壳多糖(钠盐)或水溶性壳聚糖。另外，也可以使用羟乙基壳多糖(乙二醇壳多糖)或乙二醇壳聚糖等水溶性壳多糖衍生物。
这里，衍生物是指对天然存在的壳多糖进行了化学修饰后的物质。
作为磷酸钙，也可能是磷灰石、磷酸三钙、磷酸八钙等各种材料。
作为磷酸钙颗粒的尺寸，只要为2000微米以下就能够使用，根据应用部位的骨种类(皮质骨、海绵骨)或基于部位不同而产生的骨反应性的变化，可以选择最佳尺寸。
在本发明的制造方法中，作为形成壳多糖或其衍生物的纤维的方法，当为水溶性壳多糖衍生物时，把该材料的水溶液与乙醇或丙酮等水溶性有机溶剂相混合，通过快速搅拌而析出短纤维状的沉淀物，收集、清洗该沉淀物之后，干燥并除去溶剂，由此能够得到纤维。另外，用下述的方法也能够得到纤维。即，使用碱性溶剂使壳多糖溶液化并将其从细孔(数十微米)的喷嘴中高压挤出到热水中，由此使其凝固而成为纤维状。
另外，关于上述水溶性壳多糖衍生物，进行交联处理以使纤维在体内不容易被溶出。
交联处理是通过在2kPa左右的减压情况下120℃至180℃的加热情况下进行热交联而实现的。与上述的磷酸钙颗粒相同，能够根据应用部位选择最佳温度。
另外，当混合交联纤维和磷酸钙颗粒时，添加交联纤维的保水量以下的水。这里，交联纤维的保水量是指当纤维集合体浸渍于大量水中后取出来时，纤维集合体摄入至纤维间以及纤维内并保持的水量。这是因为当添加保水量以上的水时，在和磷酸钙颗粒进行混合时，由于剩余的水具有过度的流动性，所以出现因重力造成的颗粒沉淀或凝聚，造成其分散不均匀。当为保水量以下时，纤维集合体所保持的水分难以流动，抑制磷酸钙颗粒的凝聚或沉淀，其结果是形成均匀的复合体。
交联纤维和磷酸钙颗粒的混合比(重量)在1∶0.1至1∶10之间是可以制作的。
为了使该混合物能够成可使用状态，进行混合物的冻结干燥。冻结干燥是在医药品、干燥食品的制造中等通常进行的工序，通过使冻结干燥机内部的温度保持在混合物中所含的水分的凝固点以下(0℃以下)，使用真空泵等进行减压而使水分升华蒸发而实现的。作为冻结干燥的条件，对温度、减压程度、干燥时间等没有特别限制。
根据本发明的多孔骨修复材料，通过形成纤维集合体的纤维间承载磷酸钙颗粒的结构，能够防止在制造骨修复材料时出现颗粒沉淀以及颗粒分布出现偏差。因此，能够实现骨细胞没有偏差地进入内部。另外，因为纤维集合体具备基本上完全连续的气孔，所以骨细胞能够大量进入内部。而且，成为磷酸钙颗粒在连续气孔内露出的状态，所以能够大量诱导细胞分化。
另外，根据本发明的制造方法，通过下述工序能够制造上述多孔骨修复材料，即，壳多糖或其衍生物形成纤维的工序、在真空中交联该纤维的工序、把该交联纤维与磷酸钙颗粒以及该交联纤维的保水量以下的水相混合而形成大致均匀的混合物的工序、冻结干燥该混合物而成为多孔性材料的工序。
图1是表示实施例的多孔骨修复材料表面的SEM图像。
图2是表示实施例的多孔骨修复材料断面的SEM图像(反射电子图像)。
具体实施例方式
下面，表示上述发明的优选实施例，不过本发明如上所述，交联处理能够在2kPa左右的减压情况下120℃至180℃的加热情况下进行热交联，与上述的磷酸钙颗粒相同，能够根据应用部位选择最佳温度。
另外，当混合交联纤维和磷酸钙颗粒时，添加交联纤维保水量以下的水而可以实现。另外，交联纤维和磷酸钙颗粒的混合比(重量)在1∶0.1至1∶10之间是可以制作的。因此，本发明并不限于下面的实施例。
(优选的制造方法)精密称取CM壳多糖原料3g，连同纯水(mil Q水)72g一起添加到玻璃制容器中，使用电磁式搅拌器进行搅拌、溶解，制成4wt％的CM壳多糖水溶液。为了加快CM壳多糖的溶解，水浴中加热容器至30～50℃，搅拌3～5小时，得到目视情况下均质的溶液。
把溶液倒入内装150ml乙醇的烧杯中并用玻璃棒快速搅拌。通过这一操作，析出短纤维状的CM壳多糖沉淀物。把沉淀物转移到其他容器中，接着使用乙醇100ml清洗数次。在尽可能除去乙醇之后，把该沉淀物放置在40℃的干燥器中12小时以上，使乙醇以及残留的水分蒸发。然后，在真空热处理装置在140℃减压条件下(约2kPa以下)处理12小时。
以重量比1∶5∶32的比例称量上述的CM壳多糖以及βTCP颗粒(粒径50～150微米)以及纯水放在容器中，用刮勺搅拌混合。把该混合物填充到尺寸适于以后的试验的聚苯乙烯制圆筒中，用PET薄膜封闭圆筒的两端，然后迅速放置到-80℃的冷冻库中。经过1小时以上且混合物完全冻结之后，去除两端的PET薄膜并移至冻结干燥器中，在冻结状态下直接蒸发水分。然后，从聚苯乙烯制圆筒中取出试验体，供于下述试验。
使用扫描型电子显微镜[SEM]实施。对试样进行汽化镀金之后，使用35倍的倍率、以2维电子图像进行观察(参照图1)。观察到纤维状的CM壳多糖(纤维集合体)中的纤维间承载有TCP颗粒的状态。气孔的尺寸为数十～数百μm。
为了观察TCP颗粒的分散状态，把试验体包埋于环氧树脂中之后，切断并研磨切断面，平整化之后实施相同的SEM观察。此时，为了只清楚地看到TCP颗粒，采用反射电子图像进行观察(参照图2)。在所观察的整个断面(约4×8mm)上，观察到大致均匀分散有TCP颗粒，没有观察到颗粒因沉淀造成的偏载。
将本材料埋置到形成在家兔下颌骨上的直径为4mm的骨缺损处，术后4、8周后与周围组织一起回收，调查骨组织的再生状况。针对在规定时间后回收的组织，按照一般方法制作非脱灰树脂包埋组织标本，计算各标本中再生骨组织占骨缺损部位的面积比。作为比较，只形成骨缺损且不埋置任何材料的例子(空白例)、埋置有通过现有技术即上述专利文献2(特开平7-116241号公报)中所述的手法制造的试验体的例子，以供于相同的试验。把空白例的骨修复面积作为1，比较研究各种材料埋置例子的面积比的值。
该现有技术样本的制作如下所示。在冷却浴(-10℃)中搅拌CM壳多糖4.24wt％的CM壳多糖水溶液，同时使其冻结，制成微细的晶体冰和溶液混合的状态(frozen)。添加规定量的TCP颗粒(粒径50～150μm)并搅拌，使其均匀分散。在尺寸适于以后的试验的聚苯乙烯制圆筒中填充该冻结物，用PET薄膜封闭圆筒两端之后，迅速放到-80℃的冷冻库中，然后使其冻结干燥。除掉圆筒，使用真空热处理装置在140℃或160℃的减压条件下(2kPa以下)加热处理24小时，得到海绵状体。常温冷却后，用体积是成形体表观体积20倍以上的纯水清洗3小时，把液体部分置换成乙醇，在80℃的干燥器中干燥。制作的试验体经由25kGy的伽马射线进行灭菌处理，供于试验。
其中，只使用通过现有技术的手法，则出现TCP颗粒的偏载，但是，通过与如上所述在溶液冰点以下的温度下对颗粒进行搅拌混合以及成形等的手法并用，制作颗粒大致均质分散的试验体以用于试验。
其试验结果汇总如表1所示。
表1
由表1可知，和空白例相比，当埋置本发明制成的材料时，在4周后、8周后的任何时点都有很好的骨修复。通过现有技术制造的材料，其在4周后骨修复稍微差于空白例，在8周后则相同。
权利要求
1.一种多孔骨修复材料，含有由壳多糖或其衍生物构成的脚手架材料和由磷酸钙构成的细胞分化诱导材料，其特征在于，所述壳多糖或其衍生物形成为纤维状并构成为多孔集合体，同时磷酸钙形成为颗粒状并被承载在所述集合体的纤维间。
2.根据权利要求1所述的多孔骨修复材料，其特征在于，多孔集合体具有大致完全连续的气泡。
3.根据权利要求1所述的多孔骨修复材料，其特征在于，磷酸钙颗粒在所述纤维间大致均匀分散。
4.根据权利要求1所述的多孔骨修复材料，其特征在于，所述壳多糖或其衍生物是水溶性羧甲基壳多糖或壳聚糖并被交联。
5.一种多孔骨修复材料的制造方法，所述多孔骨修复材料由壳多糖或其衍生物的纤维集合体和承载在其纤维间的磷酸钙颗粒构成，其特征在于，具有壳多糖或其衍生物形成纤维的工序、在减压条件下交联该纤维的工序、把该交联纤维与磷酸钙颗粒以及该交联纤维的保水量以下的水相混合而形成大致均匀的混合物的工序、冻结干燥该混合物而成为多孔性材料的工序。
6.根据权利要求5所述的制造方法，其特征在于，交联工序是通过在120～180℃、2kPa减压条件下加热而进行的，
7.根据权利要求5所述的制造方法，其特征在于，所述交联纤维和磷酸钙颗粒的混合比(重量)为1∶0.1～1∶10。
8.根据权利要求1所述的多孔骨修复材料，其特征在于，磷酸钙颗粒在2000μm以下。
全文摘要
本发明提供一种多孔骨修复材料，其特征在于，由壳多糖或其衍生物形成的纤维集合体构成，且所述集合体的纤维间承载有磷酸钙颗粒。本发明还提供一种多孔骨修复材料的制造方法，其特征在于，具有壳多糖或其衍生物形成纤维的工序、在真空中交联该纤维的工序、把该交联纤维与磷酸钙颗粒以及该交联纤维的保水量以下的水相混合而形成大致均匀的混合物的工序、冻结干燥该混合物而成为多孔性材料的工序。根据本发明，通过防止磷酸钙颗粒分布的偏差而使骨均匀进入其内部，通过使骨修复材料内部的气孔处于基本连通状态而使骨大量进入其内部，增大磷酸钙颗粒在骨修复材料内部的气孔内的露出面积，从而促进骨进入其内部。
文档编号A61L27/00GK1621097SQ20041009550
公开日2005年6月1日 申请日期2004年11月25日 优先权日2003年11月26日
发明者增田真吾, 吉原雄祐 申请人:京瓷株式会社