一种复合骨修复材料及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种复合骨修复材料，其特征在于：其由鱼鳞活性胶原蛋白、白芨胶与纳米羟基磷灰石冷冻干燥后添加交联剂进行交联，经水洗至中性，真空干燥而制成的多孔支架材料；所述鱼鳞活性胶原蛋白、白芨胶和纳米羟基磷灰石的质量比为20-30∶10-15∶50-70。本发明的胶原-壳聚糖-羟基磷灰石复合骨修复材料在体内可以完全降解，具有三维多孔的结构特点，其断裂强度范围为1-10.0MPa，延展范围为100-110%；相对于传统的骨修复材料，具有更优越的骨传导性能、亲水性能、更优秀的生物学性能、良好的强度和韧性；本发明的复合骨修复材料，可以有效地促进骨细胞的迁移、生长与分化，有利于提高受损骨组织的修复效率。
【专利说明】一种复合骨修复材料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及人工骨修复材料【技术领域】，具体涉及一种纳米羟基磷灰石-胶原蛋白-白芨胶构成的骨修复材料的制备方法。
【背景技术】
[0002]骨缺损修复是国内外临床医学和生物材料领域长期以来的一个重要的研究课题。迄今为止临床上对创伤、感染和肿瘤切除后所造成的大范围骨缺损的修复问题仍未得到有效的解决。自体骨由于来源有限，同时会给患者带来痛苦，其他骨修复材料，如异体骨，或异种骨容易导致免疫问题和疾病传染。而人工骨修复材料由于和自然骨高度精密的矿化结构差异较大，也还存在很多问题。作为人工骨修复材料，从成分和结构方面进行仿生是目前和今后发展的主要方向。
[0003]胶原蛋白或称胶原是由动物细胞合成的一种生物性高分子，广泛存在于动物骨、腿、软骨和皮肤及其它结缔组织中，胶原具有良好的生物学特性，可作为组织的支持物，对细胞、组织乃至器官行使正常功能并对外伤修复有重大影响。大量的研究结果表明，胶原的性能可以满足用于作为表皮细胞、成纤维细胞、角膜细胞、软骨细胞及骨细胞的培养基质。在组织修复中，胶原可参与组织愈合过程并能引导、促进细胞生长；具有显著引导/诱导组织再生的作用，使创面实现功能性、再生性的愈合，可广泛应用于软、硬组织损伤的修复，如口腔科、骨科、整形外科、五官科、神经外科及肌腿断裂和脏器穿孔等的治疗。单一的胶原，从强度和降解速度上都难以满足组织工程细胞培养的需要，将胶原和其它生物材料复合，是改善其性能的途径 之一。
[0004]羟基磷灰石(Hydroxyapatite,简称HA)是脊椎动物骨骼及牙齿中的主要无机成分，在骨质中，羟基磷灰石大约占60%。人工合成的羟基磷灰石具有与人体骨组织相似的无机成分，含有人体组织所必需的钙和磷元素，植入体内后，在体液的作用下，钙和磷会游离出材料表面，被机体组织所吸收，并能与人体骨骼组织形成化学键结合，生长出新的组织。因此，羟基磷灰石陶瓷是目前公认的具有良好的生物相容性，并具有骨诱引导性，即生物活性。但人工合成的羟基磷灰石通常以粉末状存在，在应用中由于其缺乏粘连性，操作不便，成型不佳，材料植入后常发生移位和漏出，使其应用受到一定限制。
[0005]而目前的骨修复材料多为满足一定性能要求的纳米羟基磷灰石/胶原复合材料，但是羟基磷灰石粉末很容易团聚，实际上很难均匀分散并且和胶原基体之间无法形成有效键合，陶瓷颗粒只能松散的分布于胶原框架内，并不能有效地实现纳米羟基磷灰石与胶原的仿生构建，从而限制其功能及在生物医学领域的应用。
[0006]白芨作为收敛、止血药应用由来已久，且止血效果确切可靠，其作用机理与其所含的大量的白芨胶有关。白芨质地黏腻，含有胶质，它能改善局部血液循环，促进上皮细胞修复，能止血、敛疮、润肤和生肌。白芨提取物还被实验证明具有缩短凝血时间、抑制肌体对纤维素的溶解作用，可迅速形成人工血栓，不仅外伤止血常用，对内脏出血也有较好的效果。白芨有明显的促进角质形成细胞作用，这种促游走作用对治疗皮肤创伤、止血和早期愈合有重要影响，进一步说明了白芨胶直接参与了受损组织或细胞的修复和代谢过程。
[0007]单纯的胶原或白芨胶载体从强度和降解速度上都难以满足组织工程细胞培养的需要，而将胶原和白芨胶复合后，增加了载体机械强度。另外，胶原中加入白芨胶可延迟开始降解的时间，将有利于细胞和新生组织的长入。若将胶原、白芨胶与羟基磷灰石复合制备复合材料，既有天然高分子材料的良好生物相容性和生物可降解性，又有良好的力学性能，材料的性能将得到很大的改善。
[0008]目前，国内使用的胶原蛋白主要来自猪和牛的皮肤和跟腱，但牛、猪等哺乳动物为主要来源的胶原蛋白产品存在原料来源有限、生产成品高以及疯牛病、口蹄疫等病源传播的潜在危险等诸多问题。因此，迫切需要寻求质量和安全性更好的胶原蛋白来源。我国每年鱼鳞鱼皮等水产品废弃物约有40多万吨，这些水产品废弃物均含有丰富的胶原蛋白(如皮、骨、鳞等)，鱼鳞中主要成分为胶原蛋白和羟基磷灰石，其中胶原蛋白约占20-40%，羟基磷灰石约占30%。目前鱼鳞胶原蛋白的制备方法很多，包括酸法、碱法、酶法、盐法、热水法等等，但这些传统方法均存在制备时间长、工艺复杂等缺点。鱼源胶原蛋白的变性温度在30°C左右，提取温度过高导致胶原蛋白失去了生物活性，胶原蛋白内部结构发生改变、功能下降，从而难以达到预期效果。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供了一种具有生物相容性好、综合性能优良和良好的强度和韧性等优点的纳米羟基磷灰石-胶原蛋白-白芨胶构成的骨修复材料的制备方法。
[0010]本发明是通过如 下技术方案实现的:
[0011]一种复合骨修复材料，其特征在于:其由一定比例的鱼鳞活性胶原蛋白、白芨胶与纳米羟基磷灰石冷冻干燥后添加交联剂进行交联，经水洗至中性，真空干燥而制成的多孔松软的骨修复材料；所述鱼鳞活性胶原蛋白、白芨胶和纳米羟基磷灰石的质量比为20-30:10-15:50-70。
[0012]优选的，所述的复合骨修复材料的制备方法，其特征在于包括下列步骤:
[0013]I)将鱼鳞活性胶原蛋白溶于体积分数为2%的乙酸溶液中，制成质量分数为1-2%的胶原蛋白溶液，加入配制的质量浓度为5%的纳米羟基磷灰石水溶液，采用高速分散机充分混合得到悬浮液；
[0014]2)将白芨胶浸入蒸馏水，待充分膨胀后，置50_60°C的水浴中使其溶解，加水稀释至制成质量分数为1-5%的白芨胶溶液；
[0015]3)将上述制得的胶原蛋白溶液和白芨胶溶液混合，采用高速分散机充分混合均匀；
[0016]4)将混匀后的混合溶液浇模，经冷冻干燥得到海绵状材料，将海绵状材料浸入交联剂进行交联，交联产物反复经蒸馏水冲洗至中性；所述交联剂为体积分数为0.2-0.3%的戊二醛，交联时间为12_24h;
[0017]5)将反复冲洗至中性的制备的海绵状交联产物置于真空干燥箱中干燥，得到复合骨修复材料，然后经切成不同规格后，环氧乙烷消毒，包装，即得。
[0018]更进一步的，所述鱼鳞活性胶原蛋白的制备方法为:以下所有操作均在低于10°C的条件下进行；[0019]I)鱼鳞处理:采用鲜活的鱼体，在冰水中取鱼鳞，将鱼鳞清洗干净，水分浙干；干净后置于冰箱中冷冻待用；
[0020]2)去杂:将上述解冻后的鱼鳞原料，用0.lmol/L NaOH溶液浸泡，料液比1:20，采用组织匀浆机搅拌10-30min便可完全处理干净鳞片表面的鱼银等杂质，然后用冰水冲洗干净，使pH至中性；
[0021]3)去钙:取上述处理后的鱼鳞，用0.4mol/L HCl溶液浸泡，料液比1:20，采用磁性搅拌器搅拌，转速为300r/m，1-2h，用冰水冲洗至pH至中性，然后放入冷冻干燥器干燥，目的是去除水分，从而可以在以下步骤中节约药品、缩短时间、节约冷藏空间等。
[0022]4)提取:采用匀浆机将前处理好的鱼鳞打碎，加入瞬间变压提取灌上的高压浸溃罐中，加适量0.5mol/L冰乙酸溶液，充气加压8~lOkgf/cm2，浸泡1_2小时；将高压浸溃罐内的物料放入瞬间变压提取灌上的低压提取灌内，加的料液比1:20的0.5mol/L的乙酸溶液搅拌提取3次，每2h更换溶液一次，搅拌器搅拌转速为300r/m ；
[0023]所述瞬间变压提取灌包括设有搅拌器的低压提取灌，低压提取灌上设有通过联通阀连接的高压浸溃罐，所述高压浸溃罐上部设有可封闭的进料口、压力表、和连接气泵的进气阀；所述低压提取灌的罐体上设有可封闭的进料口、出渣口和放料阀；
[0024]5)提纯:将3次提取液混合，用冷冻离心机在4°C、转速5000r/m条件下离心，取上清液，用0.9mol/L NaCl溶液进行盐析，离心取沉淀；用0.5mol/L冰乙酸溶液溶解沉淀，离心取上清液，再盐析取沉淀，用截留分子量8000-14000Da透析袋透析3d，透析液分别为
0.5mol/L冰乙酸、0.lmol/L冰乙酸、超纯水,透析期间每天更换2_3次溶液；
[0025]6)冷冻干燥:最后冷冻干燥后得到鱼源胶原蛋白样品。
[0026]更进一步的，所述白`芨胶的制备方法为:将白芨，粉碎，加6-8倍量的50_60°C水浸泡6-8h，时时搅拌、滤过，滤液备用；药渣再4-6倍量的50-60°C水浸泡2次，每次浸泡4h，滤过；合并3次滤液，浓缩成稠膏状，冷却后加95%乙醇，使含醇量达70%-75%，搅拌，即析出大量絮状沉液，静置lh，真空抽滤至干，真空干燥，研细，即得。
[0027]相对于现有技术，本发明的有益效果是:
[0028]I)本发明采用胶原蛋白、白芨胶和纳米羟基磷灰石为主要原料，研制一种新型的胶原-壳聚糖-羟基磷灰石复合骨修复材料在体内可以完全降解，具有三维多孔的结构特点，孔径为100-400um，且孔隙率达到60-80% ;其断裂强度范围为1_10.0Mpa，延展范围为100-110% ;相对于传统的胶原-羟基磷灰石骨修复材料，本材料拥有更优越的骨传导性能；由于白芨胶的修饰作用，胶原纤维表面的极性集团明显增加，进而使材料整体的亲水性能有所提高，使材料整体用过更优秀的生物学性能；由于HA的规则分布和白芨胶的辅助修饰作用，使材料拥有传统结晶胶原-羟基磷灰石骨修复材料所没有的良好的强度和韧性，便于切割修整。本发明的复合骨修复材料具有生物相容性好、综合性能优良和使用方便等优点，可以有效地促进骨细胞的迁移、生长与分化，有利于提高受损骨组织的修复效率，具有良好的应用前景。
[0029]2)白芨胶、纳米羟基磷灰石与胶原蛋白的结合除了可促进伤口愈合外，还可能增强其力学性能；白芨胶属多糖类，胶原属蛋白质类，蛋白质和糖类在一起可能存在氢键作用和静电作用，再加上交联作用，在胺基、羟基等之间相互交联，通过化学交联来控制有机基质的交联度，得到具有不同生物降解性能和力学性能的复合支架，进一步提高其力学强度。[0030]3)本发明采用酸法提取胶原蛋白，方法操作简便，产品纯度高，产品收率高(与常规酶法提取的收率相同)，酸提取法将原料中未交联的游离状态为主的胶原蛋白提取出来后，在整个提取、纯化过程中，多次采用NaCl盐析手段来去除降解或变性的胶原部分，同时因为提取环境温度始终保持在10°C以下，使提取的胶原蛋白生物活性没有得到破坏，很好的保证了胶原蛋白的品质；本发明将前处理后的原料经高压浸溃后，水大量进入细胞膜内，然后经瞬间释放压力进入低压提取灌内，可有效撑破细胞膜，有利于有效成分的快速溶出，其方法操作简便，产品收率高。采用温浸+醇沉法提取纯化白芨胶，不但减少了杂质含量，而且工艺简单、大大降低了生产成本，所制得的白芨胶纯度高。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]下面结合附图对本发明用到的设备作进一步说明:
[0032]图1是瞬间变压力提取灌的结构示意图；
[0033]图中:1为高压浸溃罐、2为视镜、3为可封闭的进料口、4为压力表、5为连接气泵的进气阀、6为低压提取罐、7为搅拌器、8为联通阀、9为出渣口、10为放料阀。
【具体实施方式】
[0034]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0035]实施例一:
[0036]1、鱼鳞活性胶原蛋白的制备:
[0037]以下所有操作均在低于10°C的条件下进行；
[0038]I)鱼鳞处理:采用鲜活的鱼体，在冰水中取鱼鳞，将鱼鳞清洗干净，水分浙干；干净后置于冰箱中冷冻待用；
[0039]2)去杂:将上述解冻后的鱼鳞原料，用0.lmol/L NaOH溶液浸泡，料液比1:20，采用组织匀浆机搅拌10-30min，然后用冰水冲洗干净，使pH至中性；传统方法一般需浸泡4_6h，我们用组织匀浆机搅拌，10-30min便可完全处理干净鳞片表面的鱼银等杂质。
[0040]3)去钙:取上述处理后的鱼鳞，用0.4mol/L HCl溶液浸泡，料液比1:20，传统方法需浸泡6h,本发明采用磁性搅拌器搅拌,转速为300r/m, l_2h,便可完全处理干净；用冰水冲洗至PH至中性，然后放入冷冻干燥器干燥，目的是去除水分，从而可以在以下步骤中节约药品、缩短时间、节约冷藏空间等。
[0041]4)提取:采用匀浆机将前处理好的鱼鳞打碎，加入瞬间变压提取灌上的高压浸溃罐中，加适量0.5mol/L冰乙酸溶液，充气加压8~lOkgf/cm2，浸泡1_2小时；将高压浸溃罐内的物料放入瞬间变压提取灌上的低压提取灌内，加的料液比1:20的0.5mol/L的乙酸溶液搅拌提取3次，每2h更换溶液一次，搅拌器搅拌转速为300r/m ;传统做法是浸泡72h，每24h更换一次溶液。本发明先用匀浆机将前处理好的鱼鳞打碎，在浸泡时使用磁力搅拌器搅拌，每2h更换溶液一次，节约了大量时间，胶原蛋白提取率与常规酶解法提取差别不大。
[0042]如图1所示，所述瞬间变压提取灌包括设有搅拌器7的低压提取灌6，低压提取灌6上设有通过联通阀8连接的高压浸溃罐I，所述高压浸溃罐I上部设有可封闭的进料口 3、压力表4和连接气泵的进气阀5 ;所述低压提取灌6的罐体上设有可封闭的进料口 3、出渣口 9和放料阀10。[0043]5)提纯:将3次提取液混合，用冷冻离心机在4°C、转速5000r/m条件下离心，取上清液，用0.9mol/L NaCl溶液进行盐析，离心取沉淀；用0.5mol/L冰乙酸溶液溶解沉淀，离心取上清液，再盐析取沉淀，用截留分子量8000-14000Da透析袋透析3d，透析液分别为
0.5mol/L冰乙酸、0.lmol/L冰乙酸、超纯水,透析期间每天更换2_3次溶液；
[0044]6)冷冻干燥:最后冷冻干燥后得到鱼源胶原蛋白样品。经检测，羟脯氨酸含量均达到7.5g/100g以上。 [0045]2、白芨胶的制备:将白芨，粉碎，加8倍量的60°C水浸泡8h，时时搅拌、滤过，滤液备用；药渣再加6倍量的60°C水浸泡2次，每次浸泡4h，滤过；合并3次滤液，浓缩成稠膏状，冷却后加95%乙醇，使含醇量达70%，搅拌，即析出大量絮状沉液，静置lh，真空抽滤至干，真空干燥，研细，即得。
[0046]3、复合骨修复材料的制备:
[0047]I)将鱼鳞活性胶原蛋白溶于体积分数为2%的乙酸溶液中，制成质量分数为1-2%的胶原蛋白溶液，加入配制的质量浓度为5%的纳米羟基磷灰石水溶液，采用高速分散机充分混合得到悬浮液；
[0048]2)将白芨胶浸入蒸馏水，待充分膨胀后，置50_60°C的水浴中使其溶解，加水稀释至制成质量分数为1-5%的白芨胶溶液；
[0049]3)将上述制得的胶原蛋白溶液和白芨胶溶液混合，采用高速分散机充分混合均匀；所述鱼鳞活性胶原蛋白、白芨胶和纳米羟基磷灰石的质量比为20:10:50 ；
[0050]4)将混匀后的混合溶液浇模，经冷冻干燥得到海绵状材料，将海绵状材料浸入交联剂进行交联，交联产物反复经蒸馏水冲洗至中性；所述交联剂为体积分数为0.2-0.3%的戊二醛，交联时间为12_24h;
[0051]5)将反复冲洗至中性的制备的海绵状交联产物置于真空干燥箱中干燥，得到复合骨修复材料，环氧乙烷消毒，包装，即得。
[0052]实施例二:
[0053]1、鱼源胶原蛋白的制备:同实施例一。
[0054]2、白芨胶的制备:将白芨，粉碎，加6倍量的50°C水浸泡6h，时时搅拌、滤过，滤液备用；药渣再加4倍量的50°C水浸泡2次，每次浸泡4h，滤过；合并3次滤液，浓缩成稠膏状，冷却后加95%乙醇，使含醇量达75%，搅拌，即析出大量絮状沉液，静置lh，真空抽滤至干，真空干燥，研细，即得。
[0055]3、复合骨修复材料的制备:
[0056]I)将鱼鳞活性胶原蛋白溶于体积分数为2%的乙酸溶液中，制成质量分数为1-2%的胶原蛋白溶液，加入配制的质量浓度为5%的纳米羟基磷灰石水溶液，采用高速分散机充分混合得到悬浮液；
[0057]2)将白芨胶浸入蒸馏水，待充分膨胀后，置50_60°C的水浴中使其溶解，加水稀释至制成质量分数为1-5%的白芨胶溶液；
[0058]3)将上述制得的胶原蛋白溶液和白芨胶溶液混合，采用高速分散机充分混合均匀；所述鱼鳞活性胶原蛋白、白芨胶和纳米羟基磷灰石的质量比为30:15:70 ；
[0059]4)将混匀后的混合溶液浇模，经冷冻干燥得到海绵状材料，将海绵状材料浸入交联剂进行交联，交联产物反复经蒸馏水冲洗至中性；所述交联剂为体积分数为0.2-0.3%的戊二醛，交联时间为12_24h;
[0060]5)将反复冲洗至中性的制备的海绵状交联产物置于真空干燥箱中干燥，得到复合骨修复材料，环氧乙烷消毒，包装，即得。
[0061]实施例三:
[0062]复合骨修复材料的制备:
[0063]I)将鱼鳞活性胶原蛋白溶于体积分数为2%的乙酸溶液中，制成质量分数为1-2%的胶原蛋白溶液，加入配制的质量浓度为5%的纳米羟基磷灰石水溶液，采用高速分散机充分混合得到悬浮液；
[0064]2)将白芨胶浸入蒸馏水，待充分膨胀后，置50_60°C的水浴中使其溶解，加水稀释至制成质量分数为1-5%的白芨胶溶液；
[0065]3)将上述制得的胶原蛋白溶液和白芨胶溶液混合，采用高速分散机充分混合均匀；所述鱼鳞活性胶原蛋白、白芨胶和纳米羟基磷灰石的质量比为25:12.5:60。
[0066]4)将混匀后的混合溶液浇模，经冷冻干燥得到海绵状材料，将海绵状材料浸入交联剂进行交联，交联产物反复经蒸馏水冲洗至中性；所述交联剂为体积分数为0.2-0.3%的戊二醛，交联时间为12-24h; [0067]5)将反复冲洗至中性的制备的海绵状交联产物置于真空干燥箱中干燥，得到复合骨修复材料，环氧乙烷消毒，包装，即得。
[0068]实施例四:复合骨修复材料的力学强度测试
[0069]本发明的复合骨修复材料的力学强度列表:
[0070]
【权利要求】
1.一种复合骨修复材料，其特征在于:其由一定比例的鱼鳞活性胶原蛋白、白芨胶与纳米羟基磷灰石冷冻干燥后添加交联剂进行交联，经水洗至中性，真空干燥而制成的多孔支架材料；所述鱼鳞活性胶原蛋白、白芨胶和纳米羟基磷灰石的质量比为20-30:10-15:50-70。
2.权利要求1所述的复合骨修复材料的制备方法，其特征在于包括下列步骤: 1)将鱼鳞活性胶原蛋白溶于体积分数为2%的乙酸溶液中，制成质量分数为1-2%的胶原蛋白溶液，加入配制的质量浓度为5%的纳米羟基磷灰石水溶液，采用高速分散机充分混合得到悬浮液； 2)将白芨胶浸入蒸馏水，待充分膨胀后，置50-60°C的水浴中使其溶解，加水稀释至制成质量分数为1-5%的白芨胶溶液； 3)将上述制得的胶原蛋白溶液和白芨胶溶液混合，采用高速分散机充分混合均匀； 4)将混匀后的混合溶液浇模，经冷冻干燥得到多孔支架材料，将多孔支架材料浸入交联剂进行交联，交联产物反复经蒸馏水冲洗至中性；所述交联剂为体积分数为0.2-0.3%的戊二醛，交联时间为12-24h; 5)将反复冲洗至中性的制备的交联产物置于真空干燥箱中干燥，得到复合骨修复材料，环氧乙烷消毒，包装，即得。
3.根据权利要求2所述的复合骨修复材料的制备方法，其特征在于所述鱼鳞活性胶原蛋白的制备方法为:以下所有操作均在低于10°c的条件下进行； 1)鱼鳞处理:采用鲜活 的鱼体，在冰水中取鱼鳞，将鱼鳞清洗干净，水分浙干；干净后置于冰箱中冷冻待用； 2)去杂:将上述解冻后的鱼鳞原料，用0.lmol/L NaOH溶液浸泡，料液比1:20，采用组织匀浆机搅拌10-30min便可完全处理干净鳞片表面的鱼银等杂质，然后用冰水冲洗干净，使pH至中性； 3)去钙:取上述处理后的鱼鳞，用0.4mol/LHCl溶液浸泡，料液比1:20，采用磁性搅拌器搅拌，转速为300r/m，1-2h，用冰水冲洗至pH至中性，然后放入冷冻干燥器干燥，目的是去除水分，从而可以在以下步骤中节约药品、缩短时间、节约冷藏空间等。 4)提取:采用匀浆机将前处理好的鱼鳞打碎，加入瞬间变压提取灌上的高压浸溃罐中，加适量0.5mol/L冰乙酸溶液，充气加压8~lOkgf/cm2，浸泡1_2小时；将高压浸溃罐内的物料放入瞬间变压提取灌上的低压提取灌内，加的料液比1:20的0.5mol/L的乙酸溶液搅拌提取3次，每2h更换溶液一次，搅拌器搅拌转速为300r/m ； 所述瞬间变压提取灌包括设有搅拌器的低压提取灌，低压提取灌上设有通过联通阀连接的高压浸溃罐，所述高压浸溃罐上部设有可封闭的进料口、压力表、和连接气泵的进气阀；所述低压提取灌的罐体上设有可封闭的进料口、出渣口和放料阀； 5)提纯:将3次提取液混合，用冷冻离心机在4°C、转速5000r/m条件下离心，取上清液，用0.9mol/L NaCl溶液进行盐析，离心取沉淀；用0.5mol/L冰乙酸溶液溶解沉淀，离心取上清液，再盐析取沉淀，用截留分子量8000-14000Da透析袋透析3d，透析液分别为0.5mol/L冰乙酸、0.lmol/L冰乙酸、超纯水,透析期间每天更换2_3次溶液； 6)冷冻干燥:最后冷冻干燥后得到鱼源胶原蛋白样品。
4.根据权利要求2所述的复合骨修复材料的制备方法，其特征在于所述白芨胶的制备方法为:将白芨，粉碎，加6-8倍量的50-60°C水浸泡6-8h，时时搅拌、滤过，滤液备用；药渣再4-6倍量的50-60°C水浸泡2次，每次浸泡4h，滤过；合并3次滤液，浓缩成稠膏状，冷却后加95%乙醇，使含醇量达70%-75%，搅拌，即析出大量絮状沉液，静置lh，真空抽滤至干，真空干燥，研细，即 得。
【文档编号】A61L27/12GK103705976SQ201410010290
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】宋理平, 许 鹏, 张延华, 冒树泉, 马国红, 王秉利, 王爱英, 吴君 申请人:山东省淡水渔业研究院