一种重组复制缺陷型腺病毒载体马流感基因工程疫苗及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种重组复制缺陷型腺病毒载体马流感基因工程疫苗及其应用。本发明将所分离的马流感病毒的HA基因插入到复制缺陷型腺病毒载体中，构建了H3N8亚型马流感HA基因重组腺病毒活载体疫苗rAd-XJ3-HA。小鼠和马免疫试验结果表明，本发明rAd-XJ3-HA疫苗能够诱导所有马产生中和抗体，具有良好的免疫原性，可作为预防或治疗EI的候选疫苗。
【专利说明】—种重组复制缺陷型腺病毒载体马流感基因工程疫苗及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种重组复制缺陷型腺病毒载体马流感基因工程疫苗及其应用，尤其涉及一种预防和治疗H3N8亚型马流感的重组腺病毒活载体马流感基因工程疫苗及其应用，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]马流感(Equine influenza, EI)是由正黏病毒科、流感病毒属的A型流感病毒中的马流感病毒(Equine influenza virus, EIV)引起的马属动物一种严重的常见上呼吸道急性高度接触性传染疾病，多呈暴发性流行，传播非常迅速而且广泛。OIE规定EI为法定报告动物疫病，我国将其列为三类传染病。
[0003]目前流行的EI主要为H3N8亚型，然而由于各种压力H3N8亚型EIV也在不断发生变异导致多个谱系病毒的出现，而且EIV已经跨越种间障碍，犬和猪感染EIV事件的发生，使得EI的防控具有重要的公共卫生学意义。近年来EI频繁暴发，自2003年以来，在英国及其他欧洲国家和美国经常有EI暴发的报道。此外，其他很少发生EI疫情的地区也已受到影响，如2003年至2004年在南非以及2008年在印度也暴发了 EI疫情。澳大利亚这样从未发生过EI的国家于2007年也遭受了 EI的袭击。
[0004]我国大陆地区一直以来都是EI的高发区。自建国以来我国共发生5次EI疫情。2007-2008年，我国暴发了第四次EI疫情，给我国的养马业及即将兴起的赛马业以沉重的打击。疫情首先在新疆暴发，随后蔓延至全国各地。2007年从新疆疫情中分离到一株H3N8亚型 EIV，命名为 A/Equine/Xinjiang/3/07 (H3N8) (XJ3)。2009 年在广西省以及 2011 年在贵州省也暴发了小规模EI疫`情。自1974年我国首次暴发EI以来，除了海南，台湾和福建不曾有文献报道外，我国EI的分布几乎遍及大江南北。
[0005]当前疫苗接种是控制EI的效策略。我国曾开展EI疫苗研制工作，但这些疫苗早已不用，一旦EI发生后，主要采取一些对症治疗措施。目前我国所用疫苗都依赖于国外引进，主要是法国Merial公司生产的重组金丝雀活载体疫苗Proteq-Flul。在2008年北京奥运马术比赛举办之际，为了预防EI，我国不得不从国外引进EI疫苗进行紧急预防接种。对我国分离的H3N8亚型EIV的序列分析表明:我国流行的EIV属于美洲谱系佛罗里达2群，而我国所使用的疫苗Proteq-Flul所对应的美洲谱系疫苗株属于肯塔基亚谱系，两者比较，在HA基因上有15个位点氨基酸发生了变异，其中有8个分别位于A、B和C抗原区上，这警示我国的EIV正在进行变异，而且实验也证实进口疫苗对我国EI不能够提供完全保护。基于进口疫苗的昂贵价格，以及抗原针对性不强等缺点，开发一种拥有我国自主知识产权、保护性良好的新型高效EI基因工程活载体疫苗具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种重组复制缺陷型腺病毒载体马流感基因工程疫苗，具体涉及一种预防和治疗马流感(EI)的重组复制缺陷型腺病毒活载体马流感基因工程疫苗，这种疫苗是以EIV XJ3囊膜糖蛋白HA作为保护性抗原的El和E3联合缺失的复制缺陷型重组腺病毒rAd-XJ3-HA。
[0007]本发明以El和E3联合缺失的复制缺陷型人腺病毒为载体，在El区携带有EIV囊膜糖蛋白HA基因具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或者与SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列，或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列，或者它们的片段。 [0008]本发明的疫苗是以人腺病毒5型(ATCC VR5)为载体，将其缺失部分早期基因表达El编码区(A 481-3533bp)和E3编码区(A 28130_30820bp)，外源HA基因通过在大肠杆菌内同源重组整合入El编码区。
[0009]本发明的疫苗中，所述的EIV囊膜糖蛋白，来源于我国流行的现地分离株XJ3HA基因全长cDNA，如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，也可为编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列，或其部分编码序列，如HAl区(30-1067bp)，或者与SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。在本发明的疫苗中，调控EIV囊膜糖蛋白HA基因进行表达的元件包括CMV启动子和SV40多聚腺苷酸加尾信号。rAd-XJ3-HA在动物细胞中并不复制，但能表达外源基因HA，其基因组在连续传代过程中保持稳定。
[0010]本发明的EIV HA基因重组腺病毒的基本特征:1、透射电镜观察到所得的重组腺病毒具有典型的腺病毒形态；2、提取不同代次的重组腺病毒DNA进行测序，表明重组腺病毒具有良好的遗传稳定性；3、重组腺病毒在AD293细胞中的滴度至少能够达到IO8TCID5tl/ml以上；4、Western blot实验表明表达的HA蛋白约为72ku,并可被马抗EIV血清所特异性识别，与天然HA蛋白具有相似的生物学活性。
[0011]4X107TCID50rAd-XJ3-HA肌肉免疫小鼠能够诱导产生较高的中和抗体效价，并能够对亲本强毒株XJ3的攻击提供100%临床保护。
[0012]4X108TCID5QrAd-XJ3-HA肌肉免疫马能够诱导产生中和抗体。由此可见，本发明EIV HA基因重组腺病毒活载体疫苗具有良好的免疫原性，可作为预防或治疗EI的候选疫苗。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为本发明实施例1重组腺病毒rAd-XJ3_HA的制备流程图；
[0014]图2为小鼠免疫重组腺病毒rAd-XJ3_HA疫苗后中和抗体效价图；
[0015]图3为马免疫重组腺病毒rAd-XJ3-HA疫苗后中和抗体效价图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0017]实施例1本发明重组EIV HA基因复制缺陷型腺病毒rAd-XJ3-HA的构建(图1所示)[0018]1、EIV XJ3HA 基因的 RT-PCR 扩增
[0019]使用华舜柱式病毒RNA提取试剂盒(上海华舜生物技术有限公司)提取EIVXJ3的RNA，具体步骤参见试剂盒说明书。以A型流感病毒反转录通用引物Un1-12:5，-AGCAAAAGCAGG-3’为反转录引物制备XJ3cDNA，反转录体系如下:DEPCH2019.0 μ L、LN27RNA5.0 μ L、AMV RT buffer8.0 μ L、2.5mmol/L dNTP mixture4.0 μ L,Un1-12 通用引物2.0 μ L>RNase Inhibitorl.0 μ L 和 AMV Reverse Transcriptasel.0 μ L,总体积 40.0 μ L。将上述反转录体系混匀，室温静置IOmin后，放于42°C水浴锅中反转录lh，然后将反转录产物立即冰浴静置2min，随后使用或置于_20°C保存。以XJ3cDNA为模板，用HA基因的特异性引物XJ3-HAF:
[0020]5，-CCCTCGAGATGAAGACAACC-3，和 XJ3-HAR:
[0021]5’ -CCCAAGCTTCTATCAGTTTAC-3’ 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为:10 X PCRbuffer 10.0 μ L> Ex Taq 酶 0.5 μ L、2.5mmol/L dNTP mixture2.0 μ L, lOpmol/L HA基因上、下游引物各1.0 μ L、cDNA模板2.0 μ L和ddH2083.5 μ L,总体积100.0 μ L。PCR反应程序如下:94°C预变性5min、94°C变性30sec、53°C退火45sec、72°C延伸2min、72°C后延伸lOmin，共计30个循环。同时设无模板的阴性对照。反应结束后，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定大小。结果可见大小为1.7kb左右的HA基因片段，与预期的相符。
[0022]2、EIV HA基因重组腺病毒转移载体的构建
[0023]HA基因的纯化:将1.7kb的EIV HA基因片段从琼脂糖凝胶上切下来，置于离心管中进行纯化，具体试验方法参见试剂盒说明书进行。
[0024]HA基因以及载体的酶切:将纯化后的HA基因和腺病毒转移载体pShuttle_CMV分别用Hind III和Xhol I进行双酶切。体系如下:ddH2013.0 μ L/34.0 μ L、HA/pShuttle-CMV30.0μ L/10.0μ LUOXM Buffer5.0 μ L、Hind III 和 Xhol I 各 1.0μ L和石蜡油50.0 μ L，总体积100.0 μ L。37°C水浴2h后，`HA基因酶切产物用PCR纯化试剂盒进行纯化；pShuttle-CMV质粒酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定完全切开后，用胶回收试剂盒进行纯化。
[0025]HA与载体的连接和转化:在T4DNA连接酶作用下，将经限制性内切酶处理的HA基因与线性化的pShuttle-CMV进行连接，体系如下HA (Hind III +Xhol I Λ) 10.0 μ L、pShutt Ie-CMV (Hind III +Xhol I Δ) 5.Ομ LUOX T4DNA 连接酶 Buffer2.0 μ L、T4DNA 连接酶1.0 μ L和dd H202.0 μ L，总体积20.0 μ L。上述连接反应混合物置于16°C水浴锅中连接过夜。将连接产物加入到TOPlO感受态细胞中，轻轻混匀后，冰浴30min，42°C热激90sec，立即冰浴2min，加入800 μ LSOC培养基，于37°C摇床内，震荡培养45min ;取出后于4000r/min离心2min ;弃去大部分上清，留200 μ L重悬培养物，涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上，37 °C温箱过夜培养。
[0026]HA基因重组质粒的鉴定:将菌落PCR初步鉴定为阳性的菌液分别接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C摇床振荡培养过夜。每个样品分别取1.5mL菌液提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并设有pShuttle-CMV质粒作为阴性对照。将进一步鉴定为阳性的重组质粒送往北京华大基因公司测序鉴定。利用DNASTAR软件中Seqman程序进行序列拼接比对，结果表明重组质粒pShutt I e-XJ3-HA构建成功，HA基因如SEQ ID N0.1所示。
[0027]3、EIV HA基因重组腺病毒穿梭质粒的构建[0028]将pShuttle-XJ3_HA重组腺病毒转移质粒用限制性内切酶Pme I线性化，反应体系如下:pShuttle-XJ3-HA44.0uL, IOXM Buffer5.0 u L, Pme I l.0u L,总体积 50.0u L037°C水浴2h，经1%琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒进行纯化。然后将其电转化至含有腺病毒骨架质粒PAdeasy-1的BJ5183感受态细胞中进行同源重组，同时设Pme I酶切的pShuttle-CMV空载体作为电转化阴性对照。涂布卡那霉素抗性LB琼脂板，37°C培养过夜。挑取菌落置于卡那霉素抗性LB液体培养基中增菌，提取质粒后，取10 y L质粒经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并用Pac I进行酶切鉴定，反应体系如下:ddH2013.0iiLiiL，pAd-XJ3-HA 或 pAd-Negtive 分别为 30.0 u L, IOXM Buffer5.0 u L, Pac I l.0u L,总体积50.0uL0同时用XJ3-HAF和XJ3-HAR特异性引物进行PCR鉴定。结果显示经Pac I酶切能够产生3kb DNA条带，PCR扩增出1.7kb的片段，表明EIV HA基因重组腺病毒穿梭质粒构建成功，命名为pAd-XJ3-HA，阴性对照命名为pAd-Negtive。
[0029]为了获得大量高质量的重组质粒，将pAd-XJ3_HA和pAd-Negtive分别转化T0P10感受态细胞，然后增菌大量提取重组质粒，Pac I酶切后，通过PCR纯化试剂盒进行纯化，然后用分光光度计进行DNA浓度测定，用于转染实验。
[0030]4、重组腺病毒的获得
[0031]将AD293细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM完全培养液中，转染前Id均匀铺于6孔板，每孔约5X IO5个细胞。过夜培养后，将用经Pac I线性化的pAd-XJ3-HA和pAd-Negtive各4 ii g分别用Lipofectamine?2000脂质体转染试剂进行转染，具体操作见说明书。转染后6h换液，继续培养7d-10d，观察细胞形态。当细胞大部分出现细胞病变后，反复冻融3次，离心收集上清作为第I代种毒。将第I代种毒以1:100的比例继续接种AD293细胞，重复上述步骤以提高重组病毒滴度。
[0032]5、重组腺病毒的鉴定
[0033]重组腺病毒的PCR鉴定:提取第4代种毒的基因组DNA，用HA基因的特异性引物进行PCR鉴定，结果可见扩增出1.7kb的HA基因片段，表明HA基因重组腺病毒构建成功，命名为rAd-XJ3-HA，阴性对照命名为rAd-Negtive。
[0034]重组腺病毒的电镜观察:将第4代重组腺病毒rAd-XJ3_HA接种AD293细胞，待50%细胞出现病变后收获上清。按照下述方法进行处理:3000r/min离心30min后，取上清10000r/min离心30min，弃去上清，沉淀用IOOyL PBS重悬，经负染后进行电镜观察。结果
可见重组病毒呈腺病毒典型形态
[0035]重组腺病毒复制滴度的测定:将第4、10和15代rAd-XJ3_HA进行10倍倍比稀释，将IO2-1Oki倍稀释的病毒液分别接种培养于96孔细胞培养板中的AD293细胞，每个稀释度设8个重复，100 u L每孔，接毒后5d弃去上清，进行细胞免疫组化实验，显微镜下观察，有细胞染色则判为阳性，用Reed-Muench方法计算重组腺病毒的TCID5(I。结果显示重组腺病毒的 TCID5tl 分别为 1.58 X 108/mL> 1.83 X 108/mL 1.49 X 108/mLo
[0036]重组腺病毒rAd-XJ3_HA遗传稳定性检测:分别提取第5、10和15代重组腺病毒rAd-XJ3-HA的DNA，并以其为模板用HA基因特异性引物XJ3-HAF和XJ3-HAR进行PCR扩增，然后将PCR产物纯化后进行测序。用DNAStar程序中的Seqman软件进行序列拼接，并与H3N8亚型EIV HA基因进行序列比对。结果表明各代次重组病毒中插入的HA基因核苷酸序列与H3N8亚型EIV HA基因序列相同，没有发生变异。[0037]实施例2本发明重组腺病毒rAd-XJ3_HA的免疫学鉴定
[0038]1、重组腺病毒表达蛋白的细胞免疫组化检测
[0039]将第4代rAd-XJ3_HA和rAd-Negtive分别接种培养于6孔组织培养板中的AD293细胞，3d后弃去上清，用预冷的PBS洗涤细胞3次，然后用4%的福尔马林固定lOmin，加入小鼠抗H3N8亚型EIV特异性血清(1:100倍稀释)作为一抗，37°C作用lh，用预冷的PBST洗3遍，每次5min，然后加入HRP标记的羊抗鼠IgG (1:2000倍稀释)作为二抗，37°C作用Ih,用预冷的PBST洗3遍,每次5min,然后经DAB显色试剂显色IOmin,显微镜下观察,并拍照记录结果。同时设未感染病毒的AD-293细胞作为阴性对照。结果可见rAd-XJ3-HA接种细胞获得染色，而rAd-Negtive接种细胞及正常细胞对照未见染色。
[0040]2、重组腺病毒表达HA蛋白的Western blot检测
[0041]将第4代rAd-XJ3-HA和rAd-Negtive分别接种AD293细胞，3d后收集细胞，用PBS洗涤除去血清，加入SDS上样缓冲液常规处理后，进行SDS-PAGE，随后进行蛋白转印，用小鼠抗H3N8亚型EIV特异性血清(1:100倍稀释)作为一抗，以IRDye?700DX荧光标记的山羊抗小鼠IgG (1:1000倍稀释)作为二抗进行Western blot检测，同时以未感染病毒的AD293细胞细作为阴性对照。结果只有rAd-XJ3-HA接种细胞在70ku处出现特异性蛋白条带染色，与预期结果一致。
[0042]实施例3本发明重组腺病毒rAd-XJ3_HA疫苗对小鼠的免疫保护实验
[0043]将24只6w雌性Balb/c小鼠随机分成3组，每组8只。第一组后肢肌肉接种4父107_°1'(:105(^(1^3-通，第二组后肢肌肉接种4\107°1'(:105(^(1-他8衍代作为对照，第三组后肢肌肉接种0.2ml PBS作为对照。一免后4w以相同方式和剂量加强免疫，并于二免后2w第一组和第二组用XJ3亲本强毒株以IO7 tlEID5tl的剂量通过呼吸道进行攻毒，第三组不攻毒作为对照。攻毒后每天观`察临床症状，并定时测量体重，连续监测14d。免疫前Id、一免后2w和4w、二免后2w以及攻毒后2w分别采血,分离血清,测定中和抗体效价(如图2所示)。
[0044]首免2w rAd-XJ3_HA组小鼠即可检测到中和抗体。免疫后用亲本强毒株XJ3进行攻毒，rAd-XJ3-HA免疫组小鼠体重没有发生显著变化，与未攻毒组相似，而rAd-Negtive对照组小鼠体重下降明显。
[0045]重复上述实验，小鼠攻毒后每隔Id每组各剖杀2只小鼠，检测病毒在脏器中的复制。结果表明rAd-XJ3_HA组小鼠没有检测到病毒在体内复制,而rAd-Negtive对照组小鼠攻毒后第2d，4d和6d在肺脏中均能够检测到病毒。
[0046]实施例4本发明重组腺病毒rAd-XJ3_HA疫苗对马的免疫原性
[0047]将rAd-XJ3_HA以每匹马4X 108_tlTCID5tl的剂量颈部肌肉接种4匹马，另外设非免疫对照2匹马，每匹马接种ImL PBS0 一免后4w加强免疫，剂量和方法同一免。二免2w后用XJ3亲本强毒株以IO8EID5tl的剂量通过呼吸道进行攻毒。免疫前Id、免疫后每周以及攻毒后lw、2w和3w分别采血，分离血清，测定中和抗体效价(如图3所示)。疫苗免疫后能够诱导所有马产生中和抗体。
[0048]实验结论:本发明构建的H3N8亚型EI HA基因重组腺病毒活载体疫苗rAd-XJ3_HA在小鼠模型上具有良好的免疫保护效果，在马体实验中能够诱导所有马产生中和抗体，具有良好的免疫原性，可作为预防或治疗EI的候选疫苗。
【权利要求】
1.一种重组复制缺陷型腺病毒载体马流感病毒基因工程疫苗，其特征在于，所述疫苗是以El和E3联合缺失的复制缺陷型人腺病毒为载体，在El区携带有H3N8亚型马流感病毒囊膜糖蛋白HA基因具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列，或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列，或者它们的片段。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的人腺病毒为5型人腺病毒(ATCCVR5)。
3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的H3N8亚型马流感病毒囊膜糖蛋白HA 基因来自于 A/Equine/Xinjiang/3/07 (H3N8)病毒。
4.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的调控马流感病毒囊膜糖蛋白HA基因进行表达的元件包括CMV启动子和SV40多聚腺苷酸加尾信号。
5.权利要求1所述的重组复制缺陷型腺病毒载体马流感基因工程疫苗在制备预防和治疗马流感的活载体疫苗中的应用。
6.一种疫苗组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的疫苗，以及药物学上可接受的载体、佐剂或赋形剂等。
【文档编号】A61K48/00GK103757054SQ201410010283
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】刘明, 刘春国, 相文华 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所