专利名称：：一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
：植物雄性不育基因是利用植物杂种优势的有效工具，具有重要的生产利用价值。20世纪70年代，由于天然野败雄性不育水稻的发现和利用，拉开了水稻杂种优势利用的序幕。中国杂交水稻作为第二次"绿色革命"的象征，一直处于世界领先地位并获得了巨大的经济效益和社会效益。因此，水稻育性问题长期以来受到人们的普遍关注。水稻雄性不育突变体是研究花粉发育的优良材料，目前已克隆的几个水稻花粉育基因大部分来自于对雄性不育突变体的研究，这些突变体大部分表现为完全不育，驱动蛋白是真核细胞中以微管为轨道拖动负载做持续运动的分子马达，能够依赖于微管水解ATP，将化学能转化成机械能，从而产生沿微管的定向运动，与此同时结合细胞器、囊泡或其它大分子(如质膜、染色体、RNA、蛋白质复合物、其它骨架纤维等)并将这些"货物"运送到细胞内特定部位。驱动蛋白参与了众多的细胞内生物学过程，包括细胞形态建成、细胞内各种有膜细胞器的运输、有丝分裂和减数分裂的进行、染色体的分离、mRNA的定位以及信号转导等过程。通过生物信息学分析，发现在水稻品种日本晴基因组中有多达45个驱动蛋白，而9311中则有46个，但到目前为止只有极个别驱动蛋白的基因得到分离并对其生物学功能进行了研究。
发明内容本发明的目的是提供一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的植物雄性育性相关蛋白(OsKinesinl)，来源于日本晴水稻(OryzasativaLjaponica.cv)，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质。序列表中的序列1由477个氨基酸残基组成，自氨基末端第1至338位为驱动蛋白马达结构域。为了使(a)中的OsKinesinl便于纯化，可在由序列表中序列l所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表l标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)中的OsKinesinl可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsKinesinl的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表l所示的标签的编码序列得到。编码上述植物雄性育性相关蛋白的基因(OsKinesinl)也属于本发明的保护范围。所述基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)序列表中序列3所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子；4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子。序列表中的序列2由1434个核苷酸组成。序列表中的序列3由10354个核苷酸组成。所述严格条件可为在O.IXSSPE(或O.IXSSC)，O.1%SDS的溶液中，在65。C下杂交并洗膜。含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体可为在pGD625载体的重组位点attBl和attB2之间插入所述基因(OsKinesinl)得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为pGD625-0sKinesinl;所述pGD625-0sKinesinl是将pENTR207-0sKinesinl中的所述基因(OsKinesinl)通过LR重组克隆入pGD625载体的重组位点attBl和attB2之间得到的；所述pENTR207-0sKinesinl是将所述基因(OsKinesinl)通过BP重组克隆入pDONR-207载体的重组位点attLl和attL2之间得到的。含有以上任一所述基因(OsKinesinl)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。扩增所述基因(OsKinesinl)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种培育雄性可育转基因植物的方法。本发明提供的培育雄性可育转基因植物的方法，是将所述基因导入雄性不育植物中，得到雄性可育的转基因植物；所述雄性不育植物为花粉育性低于50%的植物；所述雄性可育的转基因植物为花粉育性高于90%的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入雄性不育植物中；所述雄性不育植物可为w207-2。所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。本发明的植物雄性育性相关蛋白影响植物的减数分裂过程。抑制该蛋白编码基因的表达可导致植物雄性育性(花粉育性和小穗育性)降低，并影响其结实率，从而可以培育雄性减数分裂变异的转基因植物和植物雄性不育系转基因植物。将所述蛋白的编码基因导入雄性不育植物中，可以培育雄性可育转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。图1为突变基因在第8染色体上的精细定位。图2为野生型日本晴和突变体w207-2的花粉育性比较。图3为野生型日本晴和突变体w207-2的小穗育性比较。图4为野生型日本晴和突变体w207-2成熟花粉的扫描电镜和透射电镜分析。图5为野生型日本晴和突变体w207-2花药开裂性的比较。图6为野生型日本晴和突变体w207-2开花两小时后的柱头花粉数目比较。图7为野生型日本晴和突变体w207-2雄性减数分裂染色体压片比较。图8为转基因植株进行PCR分子检测结果。图9为转pGD625-0sKinesinl的T。代植株的花粉育性。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。双元Gateway载体pGD625:中国农业科学院作物科学研究所；Antonio等，ASYMMETRICLEAVES2-LIKE1gene，amemberoftheAS2/L0Bfamily，controlsproximal—distalpatterninginArabidopsispetals;PlantMolecularBiology(2005)57:559-575)。w207_2水稻中国农业科学院作物科学研究所；Li，W.等，Finemappingofpssl，apollensemi_sterilegeneinrice，TheoreticalandAppliedGenetics;2007，114:939-946。实施例1、植物雄性育性相关蛋白及其编码基因的发现—、水稻半不育突变体w207-2的育性分析及其遗传分析在粳稻品种日本晴(购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库)的大田中发现的一株结实率较低(40%左右)的水稻植株，其自交后代出现了可育与半不育两种类型的分离，通过半不育株的连续自交，从中筛选出了半不育性稳定遗传的株系w207-2(w207-2水稻)。与日本晴比较，w207-2的主要特征是营养生长和花器官发育基本正常，自交结实率稳定在30%-40%之间(见图3)，花粉育性稳定在50%左右(见图2)。用日本晴的花粉给w207-2进行了人工辅助授粉，w207-2小穗的育性能够显著提高，达到85%以上，显著地高于自交株40%左右的结实率，表明w207-2的雌配子是基本正常的，其半不育性主要是由雄配子引起的。扫描和透射电镜观察见图4。图4中，A为成熟日本晴花粉的扫描电镜图像；B为图A中单个花粉粒的放大；C为日本晴花粉粒超薄切片的透射电镜观察；D为图C中花粉壁的高倍放大；E为成熟w207-2花粉的扫描电镜图像；F为图E中单个正常形状花粉粒的放大；G为w207-2正常形状花粉粒的超薄切片的透射电镜观察；H为图G中花粉壁的高倍放大；1为图E中单个异常形状花粉粒的放大；J为w207-2异常形状花粉粒的超薄切片的透射电镜观察；K为图J中花粉壁的高倍放大。图4的结果表明，突变体w207-2中不育的花粉瘦瘪，极度变形，花粉内含物空缺，无淀粉粒积累，花粉内壁缺失，外壁结构异常，覆盖层和基足层肥厚，基粒棒趋于解体。另外，观察到w207-2的花药开裂性差(见图5)，造成花粉散出量减少，使散落在柱头上的花粉粒总数减少(见图6)，继而导致小穗育性降低。因此除了花粉半不育外，裂药性差也是造成结实率低的原因之一。6花粉母细胞的减数分裂过程分析见图7。图7中，A、B、C、D、E、F、G、H为日本晴，1、J、K、L、M、N、0、P、Q、R、S、T为w207-2;A、I为偶线期；B、J为粗线期；C、K为双线期;D、L为终变期；E为日本晴中期I正面观，可见12对染色体整齐的排列在赤道板上；F为日本晴中期I极面观，可见12对染色体，完全配对；G为后期I，染色体分向两极；H为日本晴四分体正常形成；M为w207-2中期I正面观，可见11对染色体整齐的排列在赤道板上，但有2条未配对染色单体游离在外，箭头示染色单体；N为w207-2中期I极面观，可见11对染色体，和2条未配对的染色单体，箭头示染色单体；0为w207-2后期I，可见落后的染色体，箭头所示；P为w207-2后期I，可见染色体桥，箭头所示；Q为w207-2末期I;R为w207-2中期II;S为w207-2后期II，可见落后的染色体，箭头所示；T为w207-2四分体时期形成微核，箭头所示。结果表明w207-2的花药壁发育正常，绒毡层和中层能够正常解体；对w207-2的雄性减数分裂过程的观察则发现其减数分裂中存在大量的异常现象，主要表现为减数分裂中期I形成单价体，后期I有落后染色体和染色体桥的形成，后期II也能观察到落后染色体，四分体时期形成微核。用突变体w207-2与其野生型日本晴杂交，得到w207-2/日本晴的&群体进行遗传分析，对^群体中291个单株的遗传分析表明，w207-2的半不育性受1对隐性核基因控制。二、突变基因定位1、突变基因初步定位用突变体w207-2与广亲和品种Dular(购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库)杂交，在w207-2/Dular的F2分离群体中随机选取花粉半不育单株20株及可育单株20株，分别将各株的叶片等量混合后提取DNA，构成1个半不育混合基因组池和1个可育混合基因组池。用覆盖水稻全基因组的565对SSR引物对半不育池和可育池及w207-2和Dular进行多态性分析，将花粉半不育基因pssl(pollensemi-sterility1)定位在第8染色体上标记RS41和RM6356之间。上述SSR标记分析的方法如下所述(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于E卯endorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的E卯endorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品lmin。②加入660ii1提取液(含100mMTris-Hcl(PH8.0)，20mMEDTA(PH8.0)，1.4MNaCl，0.2g/mlCTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。③加入40iU20%SDS，65t:温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。④加入100ill5MNaCl，温和混匀。⑤加入100ii110XCTAB，65。C温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。加入900ii1氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。⑦转移上清液至1.5mLE卯endorf管中，加入600yl异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。@弃上清液，沉淀用70%(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。⑨加入100ii1lXTE(121克Tris溶于l升水中，用盐酸调ra值至8.O得到的溶液)溶解DNA。取2ill电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(BechmanlnstrumentInc.U.S.A)。(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/y1，作为模板进行PCR扩增；PCR反应体系(10ii1):DNA(20ng/ul)lul，上游引物(2pmol/ul)lul，下游引物(2pmol/ul)lul，10xBuffer(MgCl2free)lul，dNTP(10mM)0.2ul，MgCl2(25mM)0.6ul，rTaq(5u/ul)0.lul，ddH205.lul，共10ul。PCR反应程序94.(TC变性5min;94.(TC变性30s、55。C退火30s、72。C延伸lmin，共循环35次；72t:延伸7min;1(TC保存。PCR反应在MJResearchPTC-225热循环仪中进行。(3)SSR标记的PCR产物检测扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNALadder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。2、突变基因精细定位根据初步定位的结果，在突变基因所在区域附近寻找公共图谱上的分子标记，并自行开发SSR标记。用F2群体中的半不育单株验证，在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位突变体基因。从w207-2/Dular衍生的9600株F2分离群体中挑出确认为半不育的单株2100株(F2群体中的突变株表型的水稻植株)用于突变基因精细定位。利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的SSR、CAPS、dCAPS分子标记对突变基因进行了精细定位，并根据定位结果初步确定突变基因，具体方法如下(l)SSR标记开发将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRHunter(李强等，遗传，2005，27(5):808-810)或SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列(重复次数^6);将这些SSR及其邻近400500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用PrimerPremier5.0软件设计SSR引物，并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在w207-2和Dular之间的多态性，表现多态者用作精细定位pssl基因的分子标记。用于精细定位的分子标记见表2。表2用于精细定位的分子标记8(2)CAPS、dCAPS标记开发CAPS(dCAPS)引物设计对Dular在pssl基因所在位置附近的部分区段进行测序，并与日本晴相对应的序列进行比对，发现两者之间存在的SNPs，以这些SNPs为基础用SNP2CAPS软件设计CAPS标记，如没有合适的酶切位点则通过"dCAPSFinder2.0"软件设9<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>计错配的PCR引物创造酶切位点，同时运用PrimerPremier5.0软件设计对应的另一条引物。CAPS/dCAPS标记分析的PCR反应体系DNA(20ng/ul)2ul，Primer1(lOpmol/ul)2ul，Primer2(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl2free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl2(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH2010ul，总体积20ul。扩增反应在PTC-200(MJResearchInc.)PCR仪上进行94。C3min;94。C30sec，55°C(引物不同，有所调整)45sec，72"C2.5min，35个循环;72。C5min。PCR产物纯化回收，按试剂盒(北京Tiangen公司)步骤进行。PCR产物酶切消化过夜后，用l-4X的琼脂糖凝胶中电泳分离，经EB染色后于紫外灯下观察拍照。dCAPS用8%的非变性PAGE胶分离，银染。根据F2群体中抽穗期单株的分子数据和表型数据，按照Zhang等报道的"隐性极端个体基因作图"方法计算基因位点与标记位点之间的重组率c，即c=(N,N乂2)/N，其中N表示被调查半不育个体总数，K表示出现显性基因携带亲本纯合带型的单株个体数，^表示出现两亲本杂合带型的单株个体数。最终把pssl基因精细定位在标记L2和L3之间，pssl基因距标记L2和L3的遗传距离均为O.02cM;这两个标记位于同一PAC克隆P0470F10上，物理距离约为28kb(图1)。[OOSS](3)突变基因的获得根据定位的位点设计引物，序列如下所述primerl(下划线所示的序列为attBl重组位点)primer2(下划线所示的序列为attB2重组位点)以primerl和primer2为引物，以日本晴的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。该对引物位于序列2上游5.2kb和下游1.7kb，扩增产物包含了该基因的启动子部分。扩增反应在PTC-200(MJResearchInc.)PCR仪上进行94。C3min;94。C30sec，60°C45sec，72°C10min，35个循环；72°C5min。将PCR产物回收纯化后经过一次BP重组克隆到载体pD0NR-207(购自美国Invitrogen公司)中构建成一个Gateway入门载体，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞(北京Tiangen公司CB101)，挑选阳性克隆后，进行测序。序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有序列表中序列3所示的核苷酸序列，编码477个氨基酸残基组成的蛋白质(见序列表的序列1)。将序列l所示的蛋白命名为OsKinesinl(即为基因定位中所述的pssl基因)，将序列1所示的蛋白的编码基因命名OsKinesinl。OsKinesinl的编码序列如序列表的序列2所示。实施例2、转基因植物的获得和鉴定—、重组表达载体构建以日本晴(购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库；购买途径获得，原始来源不清)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得OsKinesinl基因，PCR引物序列如下primerl(下划线所示的序列为attBl重组位点)primer2(下划线所示的序列为attB2重组位点)上述引物位于OsKinesinl基因的上游5.2kb和下游1.7kb，扩增产物包含了该基因的启动子部分，将PCR产物回收纯化。采用BP重组试剂盒(美国Invitrogen公司)将PCR产物克隆到载体pD0NR-207(购自Invitrogen)中，构建成一个Gateway入门载体。BP重组反应体系(5.0iiU:PCR产物2.7ii"50-100ng)，pD0NR2071.Oii"30-50ng)，5XBPreactionbufferl.OiiL，BPenzymemix0.3iiL。短暂离心后将混合体系25t:水浴4h以上，取2.5iiL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5a感受态细胞(北京Tiangen公司；CBIOI)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L庆大霉素的LB固体培养基上。37t:培养16h后，挑取克隆阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有序列3所示基因的重组表达载体，将含有OsKinesinl的pDONR-207命名为pENTR207-0sKinesinl，OsKinesinl基因插入在重组位点attLl和attL2之间，转录方向为从attU至at让2。采用LR重组试剂盒(美国Invitrogen公司)将pENTR207-0sKinesinl中的OsKinesinl重组到双元Gateway载体pGD625上。LR重组反应体系(2.5yL):pENTR207-0sKinesinl1ii"50-100ng)，pGD6251ii"50-100ng)，LRenzymemixO.5yL。混匀后短暂离心，将混合体系25t:水浴4h以上，取2.5iiL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。37t:培养16h后，挑取阳性克隆，提取质粒用于酶切和测序检测。测序结果表明，得到了含有序列3所示基因的重组表达载体，将含有OsKinesinl的pGD625命名为pGD625-0sKinesinl，OsKinesinl基因插入在重组位点attBl和attB2之间，转录方向为从attBl至attB2。将pENTR207与双元Gateway载体pGD625进行LR重组，得到对照载体。二、重组农杆菌的获得用电击法将pGD625-0sKinesinl转化农杆菌EHA105菌株(购自美国英俊公司)，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pGD625-0sKinesinl。用对照载体转化农杆菌EHA105菌株，方法同上，得到转空载体对照菌株。三、转基因植物的获得分别将EH-pGD625-0sKinesinl和转空载体对照菌株转化水稻花粉半不育突变体w207-2(w207-2水稻)，具体方法为(1)28。C培养EH-pGD625-0sKinesinl(或转空载体对照菌株)16小时，收集菌体，并稀释到含有100iimol/L卡那霉素的N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为0D6。。"0.5，获得菌液；(2)将培养至一个月的w207-2水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24"C共培养3天；(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有100mg/L巴龙霉素(PhytoTechnologyLaboratories公司)的N6固体筛选培养基上第一次筛选(16天)；(4)挑取健康愈伤转入含有100mg/L巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；(5)挑取健康愈伤转入含有50mg/L巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次；(6)挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化。得到分化成苗的T。代阳性植株。四、转基因植株的鉴定分别将T。代转pGD625-0sKinesinl植株、T。代转空载体对照植株、w207_2和日本晴种植在中国农业科学院试验网室内。水稻植株即将开花时，取叶片，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用Primer3禾PPrimer4为引物对进行扩增(Primer4:CTACAAATGCCATCATTGCG和Primer4:TAGAGGAAGGGTCTTGCGAA)。PCR反应体系DNA(20ng/ul)2ul，Primerl(10pmo1/ul)2ul，Primer2(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl2free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl2(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH2010ul，总体积20ul。扩增反应在PTC-200(MJResearchInc.)PCR仪上进行:94°C3min;94。C30sec，55。C45sec，72。Clmin，35个循环;72°C5min。用试剂盒(北京Tiangen公司)纯化回收PCR产物。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测。结果表明获得11株PCR检测阳性的植株。见图8，图8中泳道1为未转入0sKinesinl的突变体，泳道2-12为转化获得的11株转pGD625-0sKinesinl植株。水稻植株即将开花时，每个单株取主茎穗上3朵部位一致的颖花，置于乙醇冰乙酸(体积比为3:1)的溶液中，4t:冰箱保存。镜检时用1%I厂KI染色，10X10倍显微镜观察，根据花粉染色及形态判断其育性，深染和不完全染色(形状为圆形但染色不完全)的为可育，浅染和形状不规则的为不育。每个颖花观察3个视野，观察花粉粒不少于300个，取其平均值代表该单株的花粉育性。在成熟期，每个单株取3个穗子，调查整穗的结实率，取其平均值代表该单株的小穗育性。日本晴的花粉育性为98%，小穗育性为95%。11株转pGD625-0sKinesinl植株中，7株的花粉育性达到90%以上(图9)，对应的小穗育性达到85%以上，与日本晴的结实率相当。w207-2的花粉育性为52X，小穗育性为40X，表现为半不育。转空载体对照的花粉育性为50%，小穗育性为40%，仍然表现为半不育。验证了转基因前的雄性半不育性状是由0sKinesinl基因控制的，即该0sKinesinl基因为雄性育性相关基因。序列表〈110〉中国农业科学院作物科学研究所〈120〉一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应用〈130〉CGGNARY92629〈160>3〈210>1〈211>477〈212>PRT0134]〈213〉日本晴水稻(0ryzasativaL.j即onica.cv)0135]〈400>10136]MetSerAsnValThrValCysValArgPheArgProLeuSerHisLys0137]1510150138]GluArgLysThrAsnGlyAspLysValCysPheLysArgLeuAspSer0139]2025300140]GluSerPheValPheLysAspGluArgGluGluAspValliePheSer0141]3540450142]PheAspArgValPheTyrGluAspAlaGluGinSerAspValTyrAsn0143]5055600144]PheLeuAlaValProlieValAlaAspAlalieSerGlylieAsnGly0145]657075800146]ThrlielieThrTyrGlyGinThrGlyAlaGlyLysThrTyrSerMet0147]8590950148]GluGlyProSerlieLeuHisCysAsnLysGinLysThrGlyLeuVal0149]1001051100150]GinArgValValAspGluLeuPheGinSerLeuGinSerSerGluSer0151]1151201250152]MetAlaMetTrpSerValLysLeuSerMetValGlulieTyrLeuGlu0153]1301351400154]LysValArgAspLeuLeuAspLeuSerLysAspAsnLeuGinlieLys0155]1451501551600156]GluSerLysThrGinGlylieTyrlieSerGlyAlaThrGluValSer0157]1651701750158]lieGinAsnSerSerAspAlaLeuGluCysLeuSerGluGlylieAla0159]1801851900160]AsnArgAlaValGlyGluThrGinMetAsnLeuAlaSerSerArgSer0161]1952002050162]HisCysLeuTyrliePheSerValGinGinGlySerThrSerAspGlu0163]2102152200164]ArgValArgGlyGlyLyslielieLeuValAspLeuAlaGlySerGlu0165]2252302352400166]LysValGluLysThrGlyAlaGluGlyArgValLeuAspGluAlaLys0167]2452502550168]ThrlieAsnLysSerLeuSerValLeuGlyAsnValValAsnAlaLeu0169]2602652700170]ThrThrGlyLysProAsnHisValProTyrArgAspSerLysLeuThr0171]2752802850172]ArglieLeuGinAspAlaLeuGly13GlyAsnSerArgAlaAlaLeuLeu290295300CysCysCysSerProSerAlaSerAsnAlaProGluSerLeuSerThr305310315320ValArgPheGlyThrArgThrLysLeulieLysThrThrProLysSer325330335lieSerProGluValAspSerlieLysLysProlieProAspSerHis340345350GlyGinAsnAspLeuArgAspArglieLeuAsnLysLeuArgLeuSer355360365LeuLysGluGluAspValAspLeuLeuGluGluLeuPheValGinGlu370375380GlylieliePheAspProAsnTyrSerValAlaAsplieAspSerAla385390395400CysGinAspAlaAlaSerGinGluValSerLeuLeuThrGinAlaVal405410415GluGluLeuLysGluThrValGluGluLeuThrAspGluAsnGluArg420425430LeuArgGlyGluLeuGluLeuAlaGinGluAlaAlaAlaAlaAlaAla435440445AlaAlaArgAlaAspGlyAlaLeuLeuGlyPheValProAlaValAla450455460lieSerSerLeuLeuArgProPheGlyPheValProAsp465470475〈210>2〈211>1434〈212>DNA〈213〉日本晴水稻(0ryzasativaL.j即onica.cv)〈400>2atgtccaacgtgactgtetgtgtgcgattc3g3CC3Ctg3gCC3C3朋g3gagg朋gact60朋tggtg3C3aggtctgcttcaagagattggattcagaatcttttgttttc朋ggatgag120ElgggEl卿Elgatgtcatettcagctttgacagggtgttttatgaagatgc3g朋cagtct180gatgtcteteacttccttgcagtgccaattgtcgcagatgccatcagtggaateaatggg240cttetggtcagactggagcaggaaagacatacagcatggaggggccgagc300atcttgcattgc朋teagcag朋朋ctggactegtccagagagttgtegatgagcttttt360caatctctec朋tC3tC3g3朋gcatggctatgtggagtgtgaaattgtcg3tggtgg3g420atetetttgg3朋朋gteagggatcttcttgacttgtccaaggacaacct■g3gagte朋3ctcaagggatctecatttctggagc朋cag朋gtetccatccag朋tegt540tcagatgccttgg3gtgCCtttctg朋gg33ttgCC朋C3g3gCtgttgg3g朋3C3C朋600atg朋cctggctegtegteg朋gtcactgcttetecattttttcagttcaacaaggatca66013/17页acttctgatg卿gggtgElgattettcttgttgatttegctggttc卿g720朋ggttg卿a朋ctggtgctg皿ggacgagttcttgatg3ggC皿3g3C780tctctctcagttctcgggaatgttgtcaatgctcteacaactggteaaccg朋tcatgtg840ccttetcgtgactcteagcttecgcgcattcttcaagatgcactgggtggc朋ctc朋ga■gcggcattectgtgctgttgttcccccagtgcttcaaatgC3CC3g皿3gtttgtctect960gttcgtttcgg朋c朋ggac皿3gctcate皿g3CC3C3Cctctcccgaa1020gtgg3tegc3tc朋g朋gcccatccctgattctcatggccgcgtgaccgg1080attctgaacaagtteaggttgagcctg皿gtggaccttctgg郷雄tg1140ttcgtgcagg朋ggC3tC3tcttcgaccccaactectccgcgactcagcc1200tgcc朋gacgccgcgagccactgctcacac皿gctgtggagg朋ctga朋1260ga朋ccgtcg朋g3gctcaccgatgag皿cg卿ggttgaggggtg雄tcgagctcgcg1320caggaggctgccgccgccgccgctgctgctcgggctgacggcgcgctgcttggtttcgtg1380ccggcggtcgccatcagctccctcctccgcccctttgggttcgttccagactga1434〈210>3〈211>10354〈212>DNA〈213〉日本晴水稻(0ryzasativaLj即onica.cv)〈400>3tgcttccctggtcactecccgaatcactcggagateagccctggctcctegcttgcatgg60ttctegcagcagccaggcgcatctcgatttcagatettgttctetccaaagctctgcagc120gc朋gtegteteagc朋3ccttctgactgcateagcttca180gacattecat3C3tg3tg3Cttcccgagtttgtgacacttggttcattecagcccccgga240ttetccgaattcacctggcaaaatccgaccgteccgcatc300cagc朋tteaatggatec皿catgate^tteccttggttcggcaatcgg360gaagctcagg朋ccgccc朋tetctgcaaa3CC皿CC3g3atcaccattc420ccagcctcaa朋CCg3Cg3gcattgtctcgattcgtgtggcg郷卿agagattgccte■g3C3gC3CCgaagcgggtgcgggagratgg3gC皿g3gg3gagragcggatttggggagc540ggacagcg朋ccaacctettgacgacgcag3CgCCg3gg33g皿gC3ggCggtgc卿gc600gcggccaccagccgcgtgggcacccgcgccagcggcgcctgcttgtgcggcctcgccgcg660gccgccggcgcgaacatcgccggccgccgcctcctcctcctcctctcggattcgtcgttc720g朋tgElgtgCgagategctetctctctctgtgccttggcttgcttgctgc朋cgcactgg780ctgcctggctctctcactgctccgtggactcggtccatet3gCCC3CC3Cctgctgcttc840attttttttcttttttgcccgttttgcaaagtecaattccattgtcctetCtg3朋tg3t■ttcaccggtttttctccatggttttcgcattcggg皿teacatgtggctcgatttttcag960ate朋gtettcaatgctetggttettgcttttctegtectac皿gtettegateateteg1020gcgcacgtetggtcatgccggtccgtteag朋cg朋tc朋1080atgctteaatatetgaacttcagtgaccttttcaatetgttttttteaagacacatgctt1140attetgatetcgtgttcttegtettteaaaaaagacattcggaaccgtga1200c朋ttgg朋cateacagtetctecagcgtg皿tetea皿tc皿ttttecggc皿皿g皿c126015<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>ccttttteggaagtcteatgggccttgaaagcacctccagtgtacteaaacctctegact3660ccatcgatcggccacggaataagttcacttgacgtccctcaatggteateacattteate3720aatgtgtetccctteactetateaaaccggtcctgaga皿gtetegatgt3780ttcgctaacatgtcctcctegtcgcaaaacate皿g皿皿a皿gtggtgtteacaatcct3840aggccttgtttegttcctea皿c朋a皿cttttcattcatcacatcgaatgttttgacac3900皿gC3tgC3gtetteaatgtggatg皿朋a3cc皿ttecacagtttetgtate朋ttetg3960tttaagcateattgcgccatg3tttgac皿tetggtggtec皿te皿rat4020cggatteattagtctteateaattcgtctcgataaattcgtctcgcagct4080tcctgcgcgattetttegttattegactetgctteatacttcaaatetgt4140attcgtatettcgatgtgacaactaaacccaaaagttttccctaactaacgctgtgttte4200gttccgaaatatttcttcaaacttctaacttttccatcatatctaaacttttctecacac4260ataaactttcaactttttcatcacatcgttccaatttcaaccaaaccttcaattttggcg43203C3gCC朋C3agcccctggttegteatcttcttctctcgtttttcccttt4380gccgcagagcg卿gcggragcgggragcggcgcgcggccgg郷c郷cggagcggcgg4440cgtcggcaggttgcgccgcgagcgcggcggccacttccccattccttcccgtttcgccga4500cgagacgctcaccggcgcacactcgccgcctcccgccgccgctcatcggtccggtectcc4560tcagtcgtcg3t皿tggCggctgcatttcgcttccccctegctgtttcca4620tcctgaattcctgacgcctttctetctcccccgatcgatcgctcacttggaaccctctca4680tgatggagctaatccgagctgaggg皿3tcg郷tttgggteggagc3C3tggcggcgga4740g郷ggg卿ggtgat卿tagcgttgtccccccccccccccccccccccccgggtcgct■0gg皿tcagtttgcaggattttetctctttcctctteccgatggcgacgaccttggtcagt4860caccgtcgaagtcgccttcggccatggttgcctcaactcaatgategatt4920ttgccaacttagtttggttgc皿gtcagcgatagttttegtccttttccc皿gtteac3c4980皿gttggtgacagagttttegcctatttgc皿gttegcatcaggtgtgcttgcatttctg5040tgatetetttgateg皿ttetgteatttgtgttttetttggttggccttg5100gccctetgcagttaacgttttctcccatgcgaatttgccacgtatttggttggctggcag5160gatgtccaacgtgactgtetgtgtgcgattcagaccactg3gCC3C朋3g3g3gg皿g3C5220t朋tggtgacaaggtctgcttc皿gagatttcttttgttttcaaggtttg5280gatectctttttcttctgccattettgtttc3C3g3teaggcaggtetec5340tgccttttctgtg卿tgtgcaatttggttcteg皿teggactcttectc5400皿gattectggatttgttteatgttctcatatccatgagccatteaccttcttgagcatg5460tcacatagctggccctgtgtg咖ggatgg皿tggategtteate皿gagaggagcattc5520ttatgtttetttegttetegatgcattctccatgctaaatccctgtgatettgttggcaa5580gccttttgtgtttgctcatgttttgttgtttctgcaaateattttgagtt5640gg皿g朋gatgtcatettcagctttgacagggtgttttet5700tgtcteteacttccttgcagtgccaattgtcgcaggtttctttctgcctettcatcaaga5760tegtc朋ggcatctgcttettgcaategtctctegttttgtcttgactgaattctcttat5820tgccatgctttgteccaactgtcteaattgcttggacgcagatgecatea5880tgggacteteattecttetggtc郷tetgtettgctgca皿gtgca朋c594017gccttgttcccteactegacagttgtecactgcacagcttgcateagtea6000cttgcttettttgttgctectecatteccatcctcaaccc6060caccatttgcagtgcaccteatecgctgttactetgtctgacatgagctecccatgtcaa6120cactgacattttettteacttttcctetgtg朋gactggagC3gg3朋g3catecagcat6180gg郷t腿gtgtacattgctgggatt朋tatgactgactgcatcacttc6240agctttgacttgtgtttttgttteatttggatgttggcac郷ggccgagcatcttgcat6300tgc皿teagcag朋皿ctggactegtccag卿gttgtegatgagctttttcaatctcte6360caatcatcag皿3gC3tggCtetgtgg賜tgtga皿ttgtcgatggte皿aattccagcc6420tcatgttctgaatttgaacccacatcacteaatctttectcacattgateteccacttct6480c郷tgg卿tetatttgga皿皿gteaggtcagtgttgtttcttetgct6540tccgctgtecagattcatetgttgga皿tegagtetc^actttettttgtcatacctca6600gggatcttcttgacttgtcc皿ggac皿cctacaaatc3g3gagte皿3CtC皿ggg36660tctecatttctggagc朋cag皿gteagagag皿gtgcttaaattgtgtccttecgtttt6720gtttttcatttgatettctgataattccattttatttttccttgatggct6780tgtgacatttcatcatctctgteggtetccatccag^tegttcagatgccttggagtgc6840ctttctgteagttccttgtgtttttcttggaatgcctctctgtgattegateccaattag6900tttttgtttgtttctttaaattecagg朋gcagagctgttgg3g皿3C3C6960gtatcctctetttactettttectgcttct3g皿C3gCtgcactatgcat7020tttetcgtcctteatgtacacctggctegtagteg皿gtcactgcttete7080cattttttcagatcaacttctgatg卿ggtetgcttaat7140catcagcaatcagtegttcagtgcaacattgcttcccgtetgtggateggtgttccttat7200tccctttttcatettggttgteteteacctteaatttggtgatgcccatt7260cctttgtgctategactgatttegtgatttgatetcc^atgctggatttcttttggctc7320aatctggtteattgcagttecctgtetttt7380ccatcctgaate朋tgatgctegtctgagctctttttctc7440tttcagggtg卿gg郷gaagattettcttgttgatttegctggttcag7500g朋皿ctggtgctg皿ggacgagttcttgatg3ggC皿3gaatctctctc7560agttctcgggaatgttgtcaatgctcteac皿ctggtetegacttttctgg3gag朋t朋7620aaggtcaccctcacgatttetgccttgctetetttecttgtcttatcttt7680tcatcttcaggte皿ccg皿tcatgtgccttetcgtgactcteagcttecgcgcattctt7740c朋gatgcactggttggtgaaaagattttctcaggagtttctgaatcgtcgggtttgtct7800aaatgccactggtttttgcagggtggc雄tc皿gagcggcattectgtgctgttgttcc7860cccagtgcttcaaatgcaccaga朋gtttgtctectgttcgtttcggaac朋ggcatetc7920tcttgaacaatgcatgctggagtettecatttctecctctgcatettgtcctgattctat7980ggcagcatctgtCC3gg3C3皿gctcatea3g3CC3C3CCtctcccgaag8040tggategcatc皿g皿gcccatccctgattctcatggccacgtgaccgga8100ttctgaacaaggtttgtategcaacteaccagagatggccaattcaggtccaatttttga8160tcacttgatecctcactgaagatcaatcatttttcctcagtt朋ggttgagcctgaagga8220gga卿tgtggaccttctggagg朋ctgttcgtgcagg皿ggcatcatcttcgaccccaa8280<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>权利要求一种蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质。2.编码权利要求l所述蛋白的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)序列表中序列3所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子；4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90X以上同源性且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是在pGD625载体的重组位点attBl和attB2之间插入权利要求2或3所述基因得到的重组质粒。6.扩增权利要求2或3所述基因的全长及其任意片段的引物对。7.权利要求1所述蛋白，权利要求2或3所述基因，权利要求4或5所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用。8.—种培育雄性可育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入雄性不育植物中，得到雄性可育的转基因植物；所述雄性不育植物为花粉育性低于50%的植物；所述雄性可育的转基因植物为花粉育性高于90%的转基因植物。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述雄性不育植物中；所述雄性不育植物为w207-2水稻。10.—种培育雄性不育系转基因植物的方法，是抑制目的植物中权利要求2或3所述基因的表达，得到雄性不育系转基因植物；所述目的植物为携带权利要求2或3所述基因的植全文摘要本发明公开了一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的植物雄性育性相关蛋白影响植物的减数分裂过程。抑制该蛋白编码基因的表达可导致植物雄性育性(花粉育性和小穗育性)降低，并影响其结实率，从而可以培育雄性减数分裂变异的转基因植物和植物雄性不育系转基因植物。将所述蛋白的编码基因导入雄性不育植物中，可以培育雄性可育转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。文档编号C12N5/10GK101704881SQ20091023696公开日2010年5月12日申请日期2009年10月29日优先权日2009年10月29日发明者万建民,周时荣,张欣,王久林,程志军,苏宁,郭秀萍,雷财林申请人:中国农业科学院作物科学研究所