植物中雄性育性的遗传减少的制作方法

植物中雄性育性的遗传减少的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种核玉蜀黍基因，所述核玉蜀黍基因突变以导致显性雄性不育。提供了两种影响信号肽加工的突变体。提供了使用所述显性雄性不育突变体来产生用于雄性不育杂交植物的杂交种子的恢复构建体和方法。提供了其他信号肽修改形式。提供了各种物种中的所述野生型基因或突变型基因的直系同源物。
【专利说明】植物中雄性育性的遗传减少

【技术领域】
[0001]本发明整体涉及分子生物学领域，具体地讲涉及植物育性的调节以改善植物胁迫耐性。
[0002]背景信息
[0003]植物在发育生命周期期间在各种植物组织间分配光合产物、矿物质和其他生长组分。在玉蜀黍中，例如，穗和穗丝为共享某些发育过程并且相互竞争所需营养物质的特定雌性和雄性花序结构。例如，穗丝顶端优势可限制玉蜀黍植物中的穗生长和谷粒产量潜力。杂交玉蜀黍中的遗传雄性不育可减小穗丝优势并且将更多资源转向穗生长、籽粒数量和/或尺寸，最终得到增加的谷粒产量。资源分配中这种变化的优点在环境胁迫条件下可能是特别有利的。


【发明内容】

[0004]氮利用效率(NUE)基因影响产量并对改善氮在作物(特别是玉蜀黍)中的利用具有实用性。氮使用效率增加可由增加的对氮肥的吸收和同化和/或对积聚的氮储备的后续再动员和再利用，以及植物对诸如低氮环境之类的胁迫情况的耐受性增加得到。基因可用于改变植物的遗传组成，从而使得它们在当前的肥料施用标准下更高产或在肥料显著减少或氮可用量显著减少的情况下保持它们的产出率。在氮肥获得受限的发展中国家和在氮使用水平保持较高的发达国家，改善玉米中的NUE都将会增加每单位投入氮肥的玉米可收获产量。氮利用改善还使得能降低在农场上的投入成本，降低对氮肥生产所需的非可再生能源的使用和依赖，以及减少氮肥生产和农业利用的环境影响。
[0005]提供用于改善植物产量，尤其是植物谷粒产量的方法和组合物。在一些实施例中，植物产量在胁迫，特别是非生物胁迫，例如氮限制条件下得以改善。改善植物产量的方法包括抑制植物的育性。植物的雄性育性可用本领域已知的任何方法来抑制,这些方法包括但不限于破坏穗丝发育基因，或者例如通过利用共抑制、反义或RNA沉默或干扰来降低基因的表达。育性的抑制可为部分减少或完全抑制。雄性不育植物也可通过利用遗传雄性不育突变体来实现。
[0006]抑制植物中的雄性育性可改善植物的氮胁迫耐受性，并且这种植物可在显著较低的氮肥投入的情况下保持它们的产出率和/或可表现出增加的氮肥吸收和同化和/或对积聚的氮储备的再动员和再利用。除了产量的总体增加外，通过减少雄性育性改善氮胁迫耐受性还可导致根质量和/或长度增加，穗、叶、种子和/或胚乳尺寸增加，和/或抗倒伏性改善。因此，在一些实施例中，所述方法还包括在氮限制条件下栽培所述植物，并任选选择表现出对低氮水平有较大耐受性的那些植物。
[0007]另外，提供了改善非生物胁迫下的产量的方法和组合物，该方法包括:评价耕作区的环境条件的非生物应激源(stressor)(例如，土壤中的低氮水平)，并在胁迫环境下栽培具有减少的雄性育性的种子或植物。
[0008]本文还提供了构建体和表达盒，所述构建体和表达盒包含可有效减少雄性育性的核苷酸序列。
[0009]另外的方法包括但不限于:
[0010]一种通过增加植物中的一种或多种产量组分来增加产量的方法，包括通过影响植物中核编码组分的表达或活性来减少雄性育性，以及在植物生长条件下种植植物，其中该组分表现出显性表型。在一个实施例中，核编码组分为具有显性表型的雄性育性基因或雄性不育基因。任选地，雄性育性基因或雄性不育基因为转基因。
[0011]在一个实施例中，雄性育性基因编码SEQ ID N0:10的蛋白质。在一个实施例中，雄性育性基因包括SEQ ID NO: 13的核苷酸序列。在一个实施例中，雄性育性基因编码SEQID NO:14的多肽。
[0012]在一个实施例中，雄性育性的减少或使植物雄性不育通过单个核苷酸置换来实现，得到在第37位氨基酸处的氨基酸改变，在预测的蛋白质中从丙氨酸变为苏氨酸(SEQ IDNO:153)。在一个实施例中，雄性育性的减少或使植物雄性不育通过在第37位氨基酸处的氨基酸改变来实现，在预测的蛋白质中从丙氨酸变为缬氨酸。在一个实施例中，显性雄性育性基因可操作地连接到选自如下的启动子:诱导型启动子、组织优选的启动子、时间调节型启动子或它们的元件。例如，启动子优先地驱动雄性生殖组织中的表达。
[0013]在一个实施例中，雄性育性在育种对的雌性植物(例如，雌性自交系)中减少。
[0014]在一个实施例中，一种植物或细胞或种子或它们的子代，其包括减少的编码其基因组中的SEQ ID NO:10的第43-101位氨基酸序列的雄性育性序列，并且其中该雄性育性基因的表达赋予显性雄性不育性状。
[0015]分离的核酸分子包括能够引发植物细胞中的转录的多核苷酸并且包括选自如下的序列:SE Q ID NO:15 ；SEQ ID NO:15的至少100个连续核苷酸，以及与SEQ ID NO:15的全长具有至少70%序列同一性的序列。在一个实施例中，表达盒或载体包括本文公开的可操作地连接到目的多核苷酸的SEQ ID NO:15o
[0016]适用于本文公开的某些实施例的植物包括，例如，玉蜀黍(玉米)、高粱、卡诺拉油菜、小麦、大麦、裸麦、黑小麦、水稻、甘鹿、草坪草、珍珠粟、大?、棉花和向日葵。
[0017]在一个实施例中，具有减少的育性或本文公开的任何其他性状的植物任选地具有赋予以下目的表型或性状的一种或多种多核苷酸:改善的营养物质吸收、氮利用效率、耐旱性、根强度、根耐倒伏性、土壤害虫管理、玉米根虫抗性、除草剂耐性、抗病性、或昆虫抗性、或改变的碳水化合物代谢、蛋白质代谢、脂肪酸代谢或植物激素生物合成。
[0018]一种增加植物中的产量或维持产量稳定性的方法，包括通过如下方式减少雄性生殖组织发育:在雄性生殖组织优选的启动子的控制下表达转基因；以及在雄性和雌性组织同时发育期间增加分配至雌性生殖组织的营养物质。
[0019]在一个实施例中，雄性生殖组织为穗丝。在一个实施例中，雄性生殖组织发育通过表达可操作地连接到启动子的基因而减少，所述启动子包括选自列表SEQ ID NO:64-106的序列的至少100个连续核苷酸。本文公开的启动子序列的子集，例如，SEQ ID NO =64-70,70-75、75-80、85-90、90-95、100-106同样适用于驱动本文公开的目的多核苷酸的组织优选的表达。
[0020]在一个实施例中，在本文公开的穗丝优选的启动子的控制下转基因地表达目的多核苷酸(例如，具有显性雄性不育突变的Ms44)的植物或植物细胞或种子表现出改善的农学参数，诸如在生殖发育期间增加分配至穗的营养物质。
[0021]某些实施例包括包含多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸引发植物细胞中的转录并且包括选自如下的序列:
[0022]选自SEQ ID NO:64-106 的序列；
[0023]选自SEQ ID NO =64-106的序列的至少100个连续核苷酸，以及
[0024]与选自SEQ ID NO:64_106的序列的全长或与其子启动子区具有至少70%至约95%序列同一性的序列。
[0025]在一个实施例中，在本文公开的穗丝优选的启动子的控制下转基因地表达目的多核苷酸(例如，靶向涉及穗丝发育的多核苷酸的RNAi抑制序列)的植物或植物细胞或种子表现出改善的农学参数，诸如在生殖发育期间改善的分配至穗的营养物质和/或相对于对照增加的谷粒产量。
[0026]一种增加植物中产量或维持产量稳定性的方法，包括减少雄性育性，并且在雄性和雌性组织同时发育期间增加分配至雌性生殖组织的营养物质。在一个实施例中，通过改变遗传雄性育性基因的表达来减少植物中的雄性育性。在一个实施例中，植物在胁迫下生长。在一个实施例中，植物在营养物质限制条件，例如减少的可用氮下生长。
[0027]在一个实施例中，具有减少的雄性育性并且其中营养物质在雄性和雌性组织同时发育期间更多地分配至雌性生殖组织的植物表现出以下农学相关参数中的一者或多者:增大的SPAD值(叶绿素测量)、增加的抽穗丝速率或数目或程度、增加的穗长度、增加的穗宽度、增加的每个穗的种子数、增加的每个穗的种子重量和增加的胚尺寸。
[0028]在一个实施例中，具有减少的雄性育性并且其中营养物质在雄性和雌性组织同时发育期间更多地分配至雌性生殖组织的植物在干旱胁迫下生长。在一个实施例中，通过雄性不育来改善植物的耐旱性。
[0029]—种包含多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸以组织优选的方式引发植物细胞中的转录并且包括选自如下的序列:
[0030]SEQ ID NO:9 或 13 的调控区；
[0031]SEQ ID NO:62 和 64-106 ；
[0032]SEQ ID NO:9或13的调控区的至少100个连续核苷酸；
[0033]SEQ ID NO:62和64-106的至少100个连续核苷酸；
[0034]与SEQ ID NO:9或13的调控区的全长具有至少70%序列同一性的序列；
[0035]与SEQ ID NO:62和64-106的全长具有至少70%序列同一性的序列。
[0036]在一个实施例中，一种在胁迫下增加植物中产量稳定性的方法，包括表达影响可操作地连接到本文公开的穗丝优选的启动子的雄性育性的元件从而减小在植物生殖发育阶段期间对营养物质的竞争，并且其中产量增加。
[0037]—种在氮限制条件和/或正常氮条件下增加植物中产量或维持产量稳定性的方法，包括减少雄性生殖组织发育并且增加在雄性和雌性组织同时发育期间分配至雌性生殖组织的营养物质。
[0038]在一个实施例中，雄性生殖组织为穗丝并且雄性生殖组织发育通过减少NIP3-1或NIP3-1类蛋白质的表达来减少。在一个实施例中，NIP3-1蛋白质具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列。雄性生殖组织发育通过增加SEQ ID NO:63的表达而减少。
[0039]在一个实施例中，雄性生殖组织发育通过影响涉及穗丝形成的基因，例如无穗丝基因的功能而减少。
[0040]在一个实施例中，雄性生殖组织发育在用靶向基因的抑制的表达盒转化的植物中减少，所述基因编码SEQ ID NO:107的氨基酸序列或与SEQ ID NO:107具有至少70%或80 %或85 %或90 %或95 %同一性的序列。本文还公开了在TlsI等位基因中具有天然突变的植物。
[0041]在一个实施例中，组织优选的启动子优先地驱动雄性生殖组织中目的基因的表达。在一个实施例中，启动子为组织特异性启动子、组成型启动子或诱导型启动子。在一个实施例中，组织优选的启动子为穗丝优选的启动子。
[0042]一种包含多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸包括选自如下的序列:SEQID NO:63 ；SEQ ID NO:63的至少100个连续核苷酸，以及与SEQ ID NO:63的全长具有至少70%序列同一性的序列。分离的核酸分子包括编码TLSl蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:107的氨基酸序列或与SEQ ID NO:107具有至少70%或80%或85%或90%或95%同一性的序列。
[0043]一种用于产生雄性不育杂交种子的方法，包括转化对于具有基因构建体的显性雄性不育为杂合的自交系，所述基因构建体包括抑制显性雄性不育表型的第一元件、破坏花粉功能的第二元件，以及任选地可为选择性或筛选性标记的标记，其中在自交系中表达构建体使雄性系可育；该系称之为转基因保持系。在一个实施例中，该方法还包括转基因保持系的自花授粉植物，以产生为纯合的显性雄性不育的子代。
[0044]该方法还包括鉴别具有作为雌性自交系的纯合显性雄性不育基因型的那些种子。雌性自交系任选地通过用转基因保持系对其授粉而增加，得到不含构建体的100%纯合的显性雄性不育种子。
[0045]该方法还包括用雄性亲本对由显性雄性不育种子生长而来的植物授粉，以产生对于显性雄性不育为杂合的杂交体并且显示显性雄性不育表型。
[0046]在一个实施例中，显性雄性不育表型由多核苷酸序列赋予，所述多核苷酸序列包括SEQ ID NO:15的至少100个连续核苷酸，并且还编码苏氨酸来替代SEQ ID NO:14的第37位的丙氨酸(由SEQ ID NO:15编码的氨基酸序列)。
[0047]在一个实施例中，抑制元件包括对于SEQ ID NO:9或SEQ ID N0:13，或对于可操作地连接至SEQ ID N0:15或SEQ ID NO:152的启动子是特异性的启动子反向重复(pIR)序列。在一个实施例中，反向重复序列包括SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13的至少100个连续核苷酸的片段。在一个实施例中，抑制元件为设计用于抑制显性Ms44基因在雄性不育雌性自交系中的表达的RNAi构建体，并且可靶向SEQ ID N0:15或SEQ ID N0:152。在一个实施例中，抑制元件为以显性方式起作用以抑制植物中Ms44突变的显性不育表型的遗传抑制因子。任选地，如果内源的正常ms44也受到抑制元件抑制,则构建体可包括恢复ms44基因，例如在其自身启动子或异源启动子控制下的ms44基因的正常功能的元件。
[0048]在一个实施例中，公开了从本文所公开的方法得到的植物或植物细胞或种子或植物的子代。
[0049]在一个实施例中，用于产生杂交种子的方法包括在自交系中表达可操作地连接到异源启动子的适于反向重复失活的显性雄性不育基因；以及用来自雄性可育植物的花粉对该雄性不育植物授粉，所述雄性可育植物包含对于异源启动子是特异性的反向重复。在一个实施例中，花粉包含对具有反向重复失活特异性的异源启动子是特异性的反向重复。在一个实施例中，显性雄性不育基因连接至水稻5126启动子。
[0050]在一个实施例中，在杂交种子生产的上下文中使用的显性雄性不育基因为以显性方式起作用以实现雄性不育并且任选地适于抑制以维持雄性不育雌性自交系的任何基因。在一个实施例中，显性雄性不育基因选自:芽孢杆菌RNA酶、DAM甲基化酶、链霉抗生物素蛋白、MS41 和 MS42。

【专利附图】

【附图说明】
[0051]图1 一产生雄性不育杂交植物的遗传显性雄性不育体系的图。已发现可利用显性核雄性不育基因、穗丝特异性或穗丝优选的启动子和穗丝特异性或穗丝优选的基因中的一种或多种的植物中的雄性育性的遗传减少可增加穗组织发育、改善正在生长的植物中的营养物质利用率、增加胁迫耐性和/或增加种子度量值，最终得到改善的产量。
[0052]图2-MS44相关序列的比对(图2A_C)。相同的残基以粗体示出并且所有相似的残基以下划线和斜体示出。
[0053]图3-利用隐性雄性不育基因产生雄性不育杂交植物的方法的图。雌性亲本和雄性亲本均具有赋予不育性的纯合隐性等位基因。然而，雄性亲本使恢复等位基因在构建体内，其防止恢复等位基因通过花粉传递。所得的杂交种子产生雄性不育的杂交植物。
[0054]图4-用于利用下述显性雄性不育基因产生雄性不育杂交植物的方法的图:
[0055]4A-对于显性雄性不育(DMS)为杂合的自交系用基因构建体转化(SAM ;抑制、消融、标记)，所述基因构建体包括抑制显性雄性不育的元件、破坏花粉功能的第二元件，以及任选地选择性标记。该构建体在自交系中的表达使植物雄性可育。
[0056]迎-植物自花授粉以产生种子。
[0057]4C和4D-对种子或子代棺物讲行基因分型和/或表型分型以鉴别对于显件雄件不育为纯合的那些，并且还将种子或子代植物表征为携带或不含SAM构建体。
[0058]4E-雄性不育自交系可通过用转基因保持系对其授粉而增加，得到全部为纯合的显性雄性不育并且不含SAM构建体的种子。
[0059]4F-显性雄性不育自交系植物由第二自交系授粉以产生对于显性雄性不育为杂合并且表现出显性雄性不育表型的杂交体。雄性不育杂交种子为在种植时将产生为雄性不育的杂交植物的种子。
[0060]图5-图5A示出了响应于氮肥力的MS44杂交体产量-试验I。图5B示出了响应于氮肥力的MS44杂交体产量-试验2。
[0061]图6示出了与野生型相比较的MS44杂交体穗干重(Rl阶段)。
[0062]图7-图7A示出了响应于植物群体的MS44杂交体产量-试验I。图7B示出了响应于植物群体的MS44杂交体产量-试验2。
[0063]图8示出了 tlsl突变表型。A)来自野生型植物的穗丝。B)具有小的穗丝表型的纯合tlsl植物。C)不具有穗丝的纯合tlsl植物。D)具有最严重表型的植物往往具有带长壳并且不抽穗丝的多个穗(箭头)。E)穗表型的范围。F)叶表型的范围。WT=纯合野生型植物；ST =具有小的穗丝的纯合tlsl植物；NT =不具有穗丝的纯合tlsl植物。
[0064]图9示出了 tlsl的基于图谱的克隆。
[0065]图10示出了 tlsl候选基因验证。ZmNIP3.1的敲除得到tlsl表型。图1OA-具有完整ZmNIP3.1的野生型植物。图1OB-在ZmNIP3.1中具有Mu-插入的植物表现出tlsl表型。
[0066]图11示出突变型、野生型和喷以硼的突变型中的穗丝分枝数。
[0067]图12示出突变型、野生型和喷以硼的突变型中的穗丝分枝长度。
[0068]图13示出突变型、野生型和喷以硼的突变型中的穗长度。
[0069]图14示出tlsl植物较不易受50ppm硼的硼毒性条件影响。图14A-并列放置纯合tlsl植物和野生型植物，其中突变型植物看起来更高和更大。图14B-在野生型植物中，第二嫩的完全张开的叶的节在最嫩的完全张开的叶的节的上方延伸，然而突变型植物看起来是正常的。图14C-突变型的最嫩的完全张开的叶比野生型更宽。
[0070]图15示出了 ZmNIP3.1类似于硼通道蛋白。图15A-系谱树示出ZmNIP3.1与已被表征为硼通道蛋白的0sNIP3.1和AtNIP5.1(突出显示的)密切相关。图15B-在15A中突出显示的蛋白质序列的比对，其中ZmNIP3.1与0sNIP3.1和AtNIP5.1的百分比同一性分别为 84.4 和 67.3。
[0071]图16-来自所选物种的Ms44序列。在该比对中，Ms44显性多肽序列的氨基酸突变在第42位以粗体和下划线示出，如MS44dom等位基因中的T (SEQ ID NO: 14)或Ms44_2629等位基因中的V(SEQ ID NO:153)，其中所有其他序列在该位置具有A。

【具体实施方式】
[0072]正在发育的雌性生殖结构与雄性生殖结构在这些生殖结构发育期间竞争氮、碳和其他营养物质。这在当植物以增加的氮肥水平种植时定量正在发育的玉蜀黍穗和穗丝的氮平衡中进行说明。当玉蜀黍在较低氮肥水平下生长时，穗的氮平衡为负，或在发育期间当氮受限时，穗丢失氮至植物的其他部分。穗的氮平衡在提供给植物的氮肥的量增加时改善，直到穗维持氮的正向增加直至抽穗丝。相比之下，无论种植植物的育性水平如何，穗丝都维持正向氮平衡。穗丝和穗在生殖发育期间竞争氮，并且正在发育的穗丝对正在发育的穗占优势。穗和穗丝可能在发育期间竞争多个营养物质，并且竞争在胁迫条件下变得更激烈。穗在开花之前在生殖发育期间与穗丝竞争减少了正在发育的穗在胁迫下积聚营养物质的能力，得到具有较少籽粒的较小、发育较差的穗。更严重的、延长的胁迫可导致穗无法抽穗丝(exert silk)和产生谷粒。雄性育性的遗传减少将减少穗丝发育所需的营养物质，导致开花时穗发育改善。
[0073]遗传雄性不育和雄性可育近亲在不同氮肥水平下生长并且在约50%花粉散出时取样。在两种氮肥水平下雄性不育植物比其雄性不育近亲产生更大的穗。抽穗丝的雄性不育植物的比例也大于可育近亲植物。虽然生物量(总地上植物干重减去穗干重)在较高氮肥下生长的植物中较大，但是雄性不育对生物量无影响。这表明雄性不育具体地对植物产生更重、更完全发育的穗的能力的正面影响，而不影响总体营养生长。
[0074]之前尚未对遗传雄性不育衍生的杂交体进行产量实验，因为直到最近还没有利用该雄性不育源产生杂交种子的适当方法。由于大多数遗传雄性不育为隐性的，因此产生雄性不育杂交体将需要雄性不育源回交到杂交体的两个亲本中。对于杂交体雌性亲本将必须为纯合隐性(雄性不育)的并且雄性亲本必须为杂合(雄性可育)的以对雄性不育1:1分离。
[0075]相比之下，显性遗传雄性不育MS44仅需要回交到雌性亲本中以产生对雄性不育
I: I分离的杂交种子。显性雄性不育在多倍体植物诸如小麦中特别有用，其中纯合隐性不育的维持更为复杂。
[0076]已发现表达植物中显性遗传雄性不育基因的过程，所述植物任选地结合穗丝组织特异性/穗丝组织优选的启动子和穗丝特异性或穗丝优选的基因，以增加穗组织发育、改善正在生长的植物中的营养物质利用率并且增加种子度量值，最终得到改善的产量。(图1)
[0077]与细胞质雄性不育(CMS)相比，遗传雄性不育极可能产生产量响应，因为花粉发育在遗传雄性不育突变体中比在CMS衍生的不育中停滞得更早。大多数遗传雄性不育突变体在花粉四分体释放后很快就失效(Albertsen and Phillips, (1981)Can.J.Genet.Cytol.23:195-208 (Albertson和Phillips, 1981年，《加拿大遗传学与细胞学杂志》，第23卷，第195-208页)，其出现在雌性(穗)发育的非常早的阶段。直到开花前10天才能确定CMS衍生的雄性不育，如通过与CMS稳定性相关联的环境相互作用所判断的(Weider，et al.，(2009) Crop Sc1.49:77-84 (Weider 等人，2009 年，《作物科学》，第 49 卷，第 77-84页))。穗的主体发育将发生在开花前10天之前，从而CMS衍生的不育将在穗发育期间提供极少减轻的穗丝竞争。相比之下， 遗传雄性不育中雄性生殖组织发育的早期停滞减少了当穗处于发育早期阶段时正在发育的穗与正在发育的穗丝之间对营养物质的竞争。与通过改善穗发育引导的雄性不育杂交体相关联的产量改善与穗发育和穗丝发育竞争的减少一致。
[0078]在恢复的(雄性可育)和未恢复的(雄性不育)细胞质雄性不育(CMS)杂交体中测试对氮肥力的产量响应。一个杂交体在开花期间由于环境条件变为雄性可育，而另一个杂交体由于雄性不育未表现出显著的产量效应。这些结果将是可以预期的，因为通过细胞质基因确定的雄性不育直到穗丝和穗发育的极晚期才会确定，如通过与CMS稳定性相关联的环境相互作用所判断的。穗的主体发育已在不可否认地确定CMS雄性不育之前(开花前10天)发生，从而在穗发育期间提供极少减轻的穗丝竞争。大多数遗传雄性不育突变体在花粉四分体释放后很快就失效(Albertsen和Phillips, 1981年)，其出现在雌性(穗)发育的非常早的阶段。因此，遗传雄性不育中的穗丝发育将在整个穗发育时间段期间减少，从而与穗发育竞争较少。遗传雄性不育突变体极少受环境条件的影响。
[0079]减轻正在发育的穗丝和穗之间的竞争还可通过化学诱导雄性不育来实现。化学物质和遗传操纵的组合也可诱导雄性不育。通过雄性生殖组织中具有较低功效的启动子或通过使用杀配子剂前体(pro-gametocide)调节的除草剂耐性(Dotson, et al., (1996) ThePlant Journal 10:383-392 (Dotson 等人，1996 年，《植物杂志》，第 10 卷，第 383-392 页)和(Mayer and Jefferson, (2004)Molecular Methods for Hybrid Rice Product1n.Areport for the Rural Industries Research and Development Corporat1n)(Mayer 和Jefferson, 2004年，用于杂交水稻生产的分子方法，农村产业研究与开发公司的报告))以组织特异性方式释放雄性抑制剂也将是实践本发明的有效方法。
[0080]在多种情况下，特定的植物性状通过维持纯合隐性条件来表达。当恢复基因必须用于维持时，维持纯合条件出现困难。例如，玉蜀黍中的MS45基因(美国专利N0.5，478，369)已表现出对于雄性育性至关重要。由于MS45育性性状的孢子体性质，因此显性MS45等位基因的杂合或半合植物是完全可育的。MS45基因中指定为ms45的天然突变在该突变型等位基因处于纯合状态时赋予植物雄性不育表型。当通过普通杂交或转基因互补方法将非突变形式的基因引入植物中时，此不育性可逆转(即，育性被恢复)。然而，通过杂交对育性的恢复移除了所需的纯合隐性条件，并且两种方法都恢复了全部雄性育性并且阻止了对纯的雄性不育母系的维持。
[0081]维持所需的纯合隐性条件的方法在美国专利N0.7，696，405和7，893，317中有所描述，其中保持系用于杂交到纯合隐性雄性不育姊妹体上。保持系在雄性不育所需的纯合隐性条件下，而且还包含由显性雄性育性基因组成的半合转基因构建体以补充雄性不育条件；花粉消融基因，其导致对花粉的形成、功能或传播的破坏从而阻止通过转基因构建体的花粉转移至雄性不育姊妹体，但允许隐性雄性不育等位基因通过非转基因花粉粒的转移；以及种子标记基因，其允许对转基因保持系种子或植物和转基因无效雄性不育种子或植物进行分选。
[0082]制种技术(SPT)提供了维持植物中雄性不育基因的纯合隐性条件的方法。参见(例如)美国专利N0.7，696，405。SPT将为花粉源的保持系用于其纯合隐性雄性不育姊妹体的受精。保持系在雄性不育所需的纯合隐性条件下，而且还包含半合转基因构建体(“SPT构建体”)。在某些实施例中，SPT构建体包含以下三种元件:(I)显性雄性育性基因，以补充雄性不育隐性条件；(2)编码干扰雄性配子的形成、功能或传播的产物的基因和(3)标记基因，其允许从那些不含该转基因的种子/植物中分选该转基因保持系种子/植物。对花粉的形成、功能或传播的干扰阻止了通过转基因构建体的花粉转移；功能性花粉不含该转基因。所得的种子产生为雄性不育的植物。然后将这些雄性不育自交系植物用于通过用雄性亲本授粉的杂交体生产，所述雄性亲本对于雄性育性基因的显性等位基因可为不相关的自交系纯合体。所得的杂交种子产生为雄性可育的植物。
[0083]要产生杂交雄性不育子代，雄性亲本将用作保持系以杂交到雄性不育雌性自交系上(利用单独的保持系增加)以得到完全雄性不育的杂交植物。参见(例如)图3。
[0084]使用显性方法是实现雄性不育的另一种方法。在很多方面，显性雄性不育方法优于隐性雄性不育的使用，因为完全不育仅需要显性基因的单拷贝。然而，如果方法不可用于产生纯合显性雄性不育系，那么所得的子代将对雄性不育50%分离。实际上，该情况可通过转基因地将筛选性或选择性标记连接到显性雄性不育基因并且筛选或选择携带标记的子代种子或植物来减轻。对于显性雄性不育等位基因，连接的遗传标记或连接的表型可用于分选子代。描述可逆显性雄性不育体系的方法在将化学物质施加于显性雄性不育植物的美国专利N0.5，962，769中有所描述，所述可逆显性雄性不育体系逆转表型并且得到雄性育性，从而允许自花授粉使得可获得纯合显性雄性不育植物。可预想用于产生纯合显性雄性不育植物的其他方法，所述方法使用控制抑制或干扰显性雄性不育基因功能的基因的诱导型启动子。植物为组成型不育的，仅当启动子被诱导时变为可育的，从而允许破坏显性雄性不育基因功能的阻遏子的表达。阻遏子可为靶向显性雄性不育基因自身或其启动子，或能够结合显性雄性不育基因产物或使其失活的基因产物的反义基因、RNA1、反向重复序列。
[0085]另一个在显性雄性不育的子代中产生100%雄性不育的方法将使用自动剪接蛋白质序列。自动剪接蛋白质序列为能够自行切除并且以肽键重新结合剩余的一个或多个部分的蛋白质片段。自动剪接蛋白质序列可自剪接并且以页式和反式两种状态再连接剩余部分。显性雄性不育基因可进行修饰使得对N和C蛋白质区域编码的区域被分成不同的转基因构建体，与对自动剪接蛋白质序列编码的序列结合。由于蛋白质为截短和无功能的，所以包含单个构建体的植物将为雄性可育的，其允许自体受精以产生纯合植物。然后可将对于N-DMS-N-自动剪接蛋白质序列为纯合的植物与对于C-自动剪接蛋白质序列-C-DMS蛋白质为纯合的植物杂交。所有来自此杂交的子代通过切除每个自动剪接蛋白质序列以及N和C序列的再连接将为雄性不育的，以产生功能性的显性雄性不育蛋白质。
[0086]一系列田间实验用于定量在各种环境变量下遗传雄性不育的产量响应。使用两个变量:施氮量和植物密度，以使植物经受各种程度的胁迫。胁迫处理的连续性由于对遗传雄性不育植物的穗的更大程度的同化物分配，允许对植物性能的清晰分离。这些方法用于定量和说明田地中代表性的作物冠层环境中的正向产量效应。这些数据验证了在温室研究中测量的早期单个植株响应。
[0087]雄性不育表现为在特定植物组织的发育中的变化。玉蜀黍穗和穗丝为共享共同的发育过程并且受共同的一组基因控制的两种花序结构。组织彼此竞争所需的营养物质。然而穗丝具有优于穗的顶端优势的优点，其不利于玉蜀黍植物中的穗生长和产量潜力。减小穗丝顶端优势可用于将更多资源转向穗生长、籽粒数量或尺寸，并且最终可得到增加的谷粒产量。
[0088]有多种方法减少穗丝的竞争，诸如雄性不育、穗丝尺寸减少或穗丝消除(无穗丝玉蜀黍植物)。当基因的遗传突变(突变体)诸如雄性不育基因可用于减少穗丝与穗的竞争时，转基因操作提供用于此目的的替代方案或使能工具。由于涉及穗丝发育的基因通常涉及穗发育，所以通过中断这些基因减少穗丝发育也可影响穗发育。无穗丝基因(Tsll)突变为其中无穗丝植物也是无穗的例子。要使穗丝生长减少而不干扰穗发育，则需要穗丝特异性启动子靶向仅在穗丝组织中的基因破坏。
[0089]提到的所有参考文献均以引用方式并入本文。
[0090]除非另外明确定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另外提出，否则本文所采用或所考虑的技术是本领域普通技术人员所熟知的标准方法。材料、方法和实例仅为示例性的而不是限制性的。以下内容以举例说明的方式给出，而非意在限制本发明的范围。
[0091] 借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，这些公开内容所属领域的技术人员将会想到本文所述公开内容的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，这些公开内容不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在本文末尾所附权利要求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但所述术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。
[0092]除非另外指明，否则本发明的实施将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些技术处于本领域技能范围内。
[0093]单位、前缀和符号可以它们SI接受的形式表示。除非另外指明，核酸以5’到3’的方向从左向右书写；而氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左向右书写。数值范围包括限定该范围的数字。氨基酸在本文中可通过它们通常知道的三字母符号表示或通过IUPAC-1UB生化命名委员会(IUPAC-1UB B1chemical Nomenclature Commiss1n)推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码表示。下面定义的术语通过参考本说明书整体进行更完整的定义。
[0094]在描述本发明时，将采用下面的术语，并采用下文所示的定义。
[0095]所谓“微生物”意指任何微生物(包括真核微生物和原核微生物)，诸如真菌、酵母、细菌、放线菌、藻类和原生动物以及其他单细胞结构。
[0096]所谓“扩增”意指构建核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝，该构建是利用所述核酸序列中的至少一者作为模板进行。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链式反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(安大略省米西索加市加拿大基因公司(Cangene, Mississauga, Ontar1))、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA) ο 参见例如 Diagnostic Molecular Microb1logy !Principles andApplicat1ns，Persing，et al.,eds.,American Society for Microb1logy,Washington,DC(1993)(《诊断分子微生物学:原理和应用》，Persing等人编辑，美国微生物学会，华盛顿特区，1993年)。扩增的产物称为扩增子。
[0097]术语“保守修饰的变体”同时适用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序列而言，保守修饰的变体指编码氨基酸序列的相同的或保守修饰的变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码丙氨酸这种氨基酸。因而，在每个由密码子规定丙氨酸的位置，可将该密码子变更为所描述的相应密码子的任一种而不会改变所编码的多肽。这种核酸变异为“沉默变异”，代表保守修饰变异的一种。编码多肽的本文每种核酸序列还描述了该核酸的每种可能的沉默变异。普通技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了 AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子；一个例外是微球菌Micrococcus rubens,对于它来说GTG是甲硫氨酸密码子(Ishizuka, et al., (1993) J.Gen.Microb1l.139:425-32 (Ishizuka 等人，1993 年，《普通微生物学杂志》，第139卷，第425-432页))可进行修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码本发明多肽的核酸的每种隐匿的变异均隐含在每种所描述的多肽序列中并以引用的方式并入本文。
[0098]至于氨基酸序列，技术人员会认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列的各个单独置换、缺失或添加(其使被编码的序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸变更、添加或缺失)在该变更导致氨基酸被化学上相似的氨基酸置换时，为“保守修饰变体”。因而，还可变更选自I至15的整数的任何数目的氨基酸残基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10个变更。保守修饰的变体通常提供与它们所源自的未经修饰的多肽序列类似的生物活性。例如，对于其天然底物而言，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常为天然蛋白质的至少30%、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %，优选60-90 %。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域所熟知的。
[0099]下面的六个组各含有对彼此而言是保守置换的氨基酸:
[0100]I)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
[0101]2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
[0102]3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
[0103]4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
[0104]5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);和
[0105]6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
[0106]还可参见Creighton, Proteins, W.H.Freeman and C0.(1984) (Creighton,《蛋白质》，ff.H.Freeman 公司，1984 年)。
[0107]如本文所用，“基本上由...组成”意指在如下情况下目标多核苷酸或多肽可包括额外的序列:额外的序列不会严重影响受权利要求保护的多核苷酸或多肽序列的基本功倉泛。
[0108]术语“构建体”用来主要指多核苷酸序列的人工组合，即在自然界中不会发生的、通常包含一个或多个调节元件和一个或多个编码序列的组合。该术语可包括指表达盒和/或载体序列，视上下文而定。
[0109]“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供度量其中已针对目的基因实现了遗传变更(诸如转化)的受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。受试植物或植物细胞可从作了如此变更的植物或细胞遗传而来，且会包含该变更。
[0110]对照植物或植物细胞可例如包括:(a)野生型植物或细胞，即具有与用于进行遗传变更的起始材料相同的基因型的植物或细胞，该遗传变更会得到受试植物或细胞；(b)具有与起始材料相同的基因型但已用无效构建体(即，用对目的性状不具有已知效果的构建体，诸如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)为受试植物或植物细胞的子代中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与受试植物或植物细胞相同但不暴露于会引起目的基因的表达的条件或刺激因素的植物或植物细胞；或者(e)处于目的基因不被表达的条件下的受试植物或植物细胞本身。对照植物还可以是用另选的构建体转化的植物。
[0111]就指定的核酸而言，所谓“编码”意指包含翻译成指定蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸可以包含在该核酸的翻译区内的非翻译序列(例如内含子)或可以缺少这种居间的非翻译序列(例如，如在CDNA中)。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遗传密码来编码。然而，可使用诸如在某些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体(Mycoplasma capricolum) (Yamao, et al., (1985)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:2306-9 (Yamao等人，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第2306-2309页))，或纤毛虫大核(ciliate Macronucleus)中存在的通用密码的变体，当用这些生物体表达该核酸时。
[0112]当通过合成法制备或改变核酸时，可利用将在其中表达核酸的预期宿主的已知密码子偏好性。例如，尽管本发明的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以解决单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被证实不同(Murray, et al., (1989)Nucleic Acids Res.17:477-98 (Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)，将其以引用的方式并入本文)。因而，具体氨基酸的玉蜀黍优选密码子可由来自玉蜀黍的已知基因序列得出。关于来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍密码子使用在Murray等人(出处同上)的表4中列出。
[0113]如本文所用，术语“内源”在参考基因使用时意指通常存在于指定生物体的细胞的基因组中并且以其常态存在于细胞中(即，以其通常存在于自然中的状态存在于基因组中)的基因。
[0114]术语“外源”在本文中是指被引入细胞的任何材料。术语“外源核酸分子”或“转基因”是指通常不存在于细胞基因组中或被引入细胞中的任何核酸分子。此类外源核酸分子通常为使用如本文所公开的重组DNA方法或者本领域中已知的其他方式生成的重组核酸分子。在各种实施例中，如本文所公开的转基因非人类生物体可包含，例如，第一转基因和第二转基因。此类第一和第二转基因可引入到细胞中，例如，转基因生物体的祖细胞，作为单独核酸分子或作为单个单元(例如，分别包含在不同载体或包含在单个载体中)。在任一种情况下，可确定待从中得到转基因生物体的细胞包含使用常规和已知方法诸如标记基因的表达或核酸杂交或PCR分析的两种转基因。作为另外一种选择或除此之外，转基因存在的确定可较晚进行，例如，在植物由推定的转化细胞再生后进行。
[0115]如本文所用，针对核酸的“异源”为起源于外来物种的核酸，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因组基因座方面进行了实质性修饰的核酸。例如，可操作地连接至异源结构基因的启动子是来自不同于衍生该结构基因的物种的物种，或者如果是来自相同的物种，则对一者或二者由其初始形式进行了实质性的修饰。异源蛋白质可起源于外来物种，或者，如果起源于相同物种，则通过蓄意的人为干预对其天然形式进行了实质修饰。
[0116]所谓“宿主细胞”意指包含本发明的异源核酸序列、含有载体并能支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞诸如大肠杆菌(E.coli),或真核细胞诸如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞，包括但不限于玉蜀黍、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、卡诺拉油菜、大麦、小米和番茄。特别优选的单子叶宿主细胞是玉蜀黍宿主细胞。
[0117]术语“杂交复合体”包括指由两条相互选择性杂交的单链核酸序列形成的双链核酸结构。
[0118]在将核酸插入细胞的语境中，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，包括指将核酸并入真核或原核细胞中，其中该核酸可并入细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
[0119]术语“分离的”指诸如核酸或蛋白质之类的物质，该物质实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的通常与其相伴随或与其相互作用的组分。术语“非天然存在的”、“突变的”、“重组的”、“重组表达的”、“异源的”或“异源表达的”为不存在于其天然存在环境中的代表性生物材料。
[0120]结合植物，“系”是遗传上相同的植物的集合并且涵盖产生此类植物的种子。自交系通常在大多数或所有基因座为纯合的。
[0121] 术语“NUE核酸”意指包含编码完全长度或部分长度多肽的多核苷酸(“NUE多核苷酸”)的核酸。
[0122]如本文所用，“核酸”包括指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物:其以与天然存在的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式杂交至单链核酸。
[0123]所谓“核酸文库”意指分离的DNA或RNA分子的集合，其包含且实质上代表指定生物体的基因组的整个被转录的部分。示例性核酸文库诸如基因组文库和cDNA文库的构建，在诸如以下的标准分子生物学参考文献中有教导:Berger and Kimmel，(1987) Guide ToMolecular Cloning Techniques, from the series Methods in Enzymology, vol.152,Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger 和 Kimmel, 1987 年，《分子克隆技术指南》，来自《酶学方法》系列第152卷,学术出版社,加州圣地亚哥)；Sambrook, et al., (1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed., vols.1-3 (Sambrook等人，1989年，《分子克隆实验指南》，第 2 版,第 1-3 卷)；以及 Current Protocols in Molecular B1logy,Ausubel,et al.,eds,Current Protocols,a joint venture between Greene PublishingAssociates, Inc.and John Wiley & Sons, Inc.(1994Supplement)(《最新分子生物学实验方法汇编》，Ausubel等人编辑，选自《实验室指南》，格林出版联合公司与约翰威立父子出版公司的合资公司(1994年增刊))。
[0124]本文所用的“可操作地连接”包括指第一序列(诸如启动子)和第二序列之间的功能连接，其中该启动子序列引发和介导对应于该第二序列的DNA的转录。一般来讲，可操作地连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白质编码区的话，是连续的且在相同的阅读框内。
[0125]如本文所用，术语“植物”包括指整个植株、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子和植物细胞和它们的子代。如本文所用，植物细胞包括但不限于存在于植物组织中或与植物组织分离的细胞，包括种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本发明方法的植物种类通常与适用于转化技术的高等植物种类一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物，包括以下属的种:南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜猜属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豆工豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属( Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠爺属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番爺属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、爺属(爺属)、碧冬爺属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、马珠草属(Majorana)、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senec1)、蛾蝶花属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、布洛华丽属(Browaalia)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、葱属(Allium)和小麦属(Triticum)。特别优选的植物是玉米(Zea mays)。
[0126]本文所用的“产量”可包括指收获时每英亩谷类作物的蒲式耳数，该值针对谷粒水分(例如，对于玉蜀黍通常是15%)进行了调整，和/或所产生的生物量的体积(对于草料作物诸如苜蓿而言，以及复种作物的植株根尺寸)。谷粒水分是在收获时的谷粒中测量。谷粒的经调整的测试重量确定为针对收获时的谷粒水分水平进行了调整的重量，单位磅/蒲式耳。生物量测量为所产生的可收获植物材料的重量。
[0127]如本文所用，“多核苷酸”包括指脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或它们的类似物，所述类似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性质:在严格杂交条件下其所杂交的核苷酸序列与天然存在的核苷酸所杂交的核苷酸序列基本上相同，和/或可翻译成与天然存在的核苷酸所翻译的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调控基因的全长序列或其亚序列。除非另外指明，否则该术语可包括指指定的序列及其互补序列。
[0128]术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
[0129]本文所用的“启动子”包括指DNA的在转录起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始转录的区域。“植物启动子”是能够引发在植物细胞中的转录的启动子。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因的细菌(诸如农杆菌属(Agrobacterium)或根瘤菌属(Rhizobium))获得的那些启动子。例子为优先起始在某些组织，例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中的转录的启动子。这种启动子被称为“组织优选的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一个或多个器官中某些细胞类型中的表达，例如根或叶中的维管细胞。“诱导型”或“调控型”启动子是处于环境控制下的启动子。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件的实例包括无氧条件或光的存在。另一类型的启动子是发育调节启动子，例如在花粉发育过程中驱动表达的启动子。组织优选的、细胞类型特异性的、发育调节的和诱导型的启动子是“非组成型”启动子类别的成员。“组成型”启动子为在发育或细胞分化的大多数环境条件和状态下，在植物的基本上所有组织中都有活性的启动子。
[0130]术语“多肽”指一条或多条氨基酸序列。该术语还包括其片段、变体、同源物、等位基因或前体(例如原前蛋白或前蛋白)。“NUE蛋白质”包含多肽。除非另有规定，否则术语“NUE核酸”意指包含编码多肽的多核苷酸(“NUE多核苷酸”)的核酸。
[0131]如本文所用，“重组的”包括指已通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者源于经这样修饰过的细胞的细胞。因而，例如，重组细胞表达不以天然(非重组)形式的细胞内的相同形式存在的基因，或因为有意人为干预而表达原本异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因，或可具有减低的或消除的天然基因表达。本文所用的术语“重组的”不涵盖通过天然发生的事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)进行的细胞或载体的变更，所述事件为例如在没有蓄意人为干预的情况下发生的那些。
[0132]本文所用的“重组表达盒”是具有一系列规定核酸元件的通过重组法或合成法产生的核酸构建体，其允许特定核酸在靶细胞中转录。可将重组表达盒掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了别的序列以外，表达载体的重组表达盒部分还包含待转录的核酸和启动子。
[0133]术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交的程度比其与非靶序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)，并且基本上排除非靶核酸。选择性杂交的序列通常相互具有约至少40 %的序列同一性，优选60-90 %的序列同一'I"生，最优选10%的序列同一'I"生(即互补性)。
[0134]术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的，并且将在不同环境下不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴别与探针可最高达100%互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调节严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。优选地，探针长为大约500个核苷酸，但长度可变化很大，从小于500个核苷酸到等于靶序列的整个长度。
[0135]通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少30°C，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60°C的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂诸如甲酰胺或Denhardt’ s来实现。示例性的低严格性条件包括在37°C下用30至35%甲酰胺、IM NaCl、I % SDS (十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50至55°C下在IX至2X SSC(20X SSC = 3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括37°C下在40至45%甲酰胺、IM NaClU% SDS中杂交，并在55至60°C下在0.5X至IX SSC中洗涤。示例性的高严格条件包括在50%甲酰胺、IM NaCl,1% SDS中于37°C下杂交，并在0.1X SSC中于60-65°C下洗涤。特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可根据 Meinkoth and Wahl, (1984), Anal.B1chem., 138:267-84(Meinkoth 和 Wahl, 1984 年，《分析生物化学》，第138卷，第267-284页):的方程Tm = 81.5°C +16.6 (log Μ) +0.41(%GC) -0.61(% form)-500/L估计；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％ GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。TmS 50%的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和PH下)。每1%的错配，Tm降低约1°C ;因此，可调节Tm、杂交和/或洗涤条件以杂交至所需同一性的序列。例如，如果寻求具有> 90%同一性的序列，则Tm可降低10°C。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5°C。然而，极端严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低1、2、3或4°C的杂交和/或洗涤；适度严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10°C的杂交和/或洗涤；低严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20°C的杂交和/或洗涤；利用该公式，杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致^低于45°C (水溶液)或32 °C (甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高的温度。有关核酸的杂交的详尽指南见于以下文献:Tijssen, Laboratory Techniques in B1chemistryand Molecular B1logy-Hybridizat1n with Nucleic Acid Probes,part I,chapter 2,“Overview of principles of hybridizat1n and the strategy of nucleic acid probeassays, ”Elsevier, New York (1993) (Ti jssen,《生物化学和分子生物学实验室技术_核酸探针杂交》，第I部分，第2章，“核酸探针测定法的杂交原理和策略概览”，Elsevier出版社，纽约，1993 年)；以及 Current Protocols in Molecular B1logy, chapter 2, Ausubel,et al., eds, Greene Publishing and ffiley-1nterscience, New York(1995)(《最新分子生物学实验方法汇编》，第2章，Ausubel等人编辑，格林出版公司与约翰威立出版公司，纽约，1995年)。除非另外指明，否则在本专利申请中，高严格性定义为在65°C下在4X SSC、5X Denhardt’ s (500ml水中的5gFicoll, 5g聚乙烯吡咯烧酮、5g牛血清白蛋白)、0.lmg/ml煮沸鲑精DNA和25mM磷酸钠中杂交，并在65°C下在0.1X SSC、0.1% SDS中洗涤。
[0136]本文所用的“转基因植物”包括指在其基因组中包含异源多核苷酸的植物。一般来讲，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多核苷酸可单独整合进基因组中，或者作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。“转基因”在本文中用来包括任何其基因型已因异源核酸的存在而被变更的细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初如此变更的转基因以及那些通过从最初的转基因进行有性杂交或无性繁殖而产生的转基因在内。本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)的改变。
[0137]如本文所用，“载体”包括指用于转染宿主细胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。载体常常是复制子。表达载体允许插入其中的核酸转录。
[0138]以下术语用于说明两个或更多个核酸或多核苷酸或多肽之间的序列关系:(a) “参考序列”、(b) “比较窗口”、(c) “序列同一性”、(d) “序列同一性百分数”和(e) “基本上全同”。
[0139]如本文所用，“参考序列”是用作序列比较基准的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如全长cDNA或基因序列的片段或完整的cDNA或基因序列。
[0140]如本文所用，“比较窗口”意指包括指多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该多核苷酸序列可与参考序列进行比较，并且其中该比较窗口中的该多核苷酸序列部分相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两个多核苷酸的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中纳入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
[0141]将核苷酸和氨基酸序列进行比对以作比较的方法是本领域公知的。局部同源性算法(BESTFIT)(Smith and Waterman,(1981)Adv.Appl.Math2:482 (Smith 和 Waterman,1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页))可以对用于比较的序列进行最佳比对；Needlemanand ffunsch, (1970) J.Mol.B1l.48:443-53 (Needleman 和 ffunsch, 1970 年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的同源性比对算法(GAP);相似性搜索方法(Tfasta和Fasta)(Pearson and Lipman, (1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444 (Pearson 和 Lipman,1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页))；这些算法的计算机化实施包括，但不限于:Intelligenetics (加州山景城(Mountain View, California))的 PC/Gene 程序中的 CLUSTAL、Wisconsin Genetics Software Package 第 8 版(可得自 Genetics Computer
Group ( GCG'(程序(Accelrys 公司(加州圣地亚哥(San Diego,CA)))中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA。CLUSTAL 程序由如下文献详细说明:Higginsh and Sharp, (1988)Gene73:237-44 (Higgins 和 Sharp, 1988 年，《基因》，第 73 卷，第 237-244 页)；Higgins andSharp, (1989)CAB10S5:151-3 (Higgins和Sharp，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第 5 卷,第 151-153 页)；Corpet, et al., (1988) Nucleic Acids Res.16:10881-90 (Corpet等人，1988 年，《核酸研究》，第 16 卷，第 10881-10890 页)；Huang, et al.，(1992) ComputerApplicat1ns in the B1sciences8:155-65 (Huang 等人，1992 年，《计算机在生物科学中的应用》，第 8 卷，第 I55-165 页)以及 Pearson et al.，(1994)Meth.Mol.B1l.,24:307-31 (Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24第307-310页)。用于多个序列的最佳全局比对的优选程序是 PileUp (Feng and Doolittle, (1987) J.Mol.Evol., 25:351-60 (Feng和Doolittle, 1987年，《分子进化学杂志》，第25卷，第351-360页)，其类似于 Higgins and Sharp, (1989) CAB10S5:151-53 (Higgins 和 Sharp, 1989 年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)中描述的方法，将文献以引用的方式并入本文。可用于数据库相似性搜索的BLAST家族程序包括:BLASTN，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；BLASTX，用于核苷酸查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询；BLASTP,用于蛋白质查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询；TBLASTN，用于蛋白质查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；以及TBLASTX，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询。参见Current Protocols in Molecular B1logy,Chapterl9,Ausubelet alGreene Publishing and ffiley-1nterscience, New York(1995)(《现代分子生物学实验技术》，第19章，Ausubel等人(编辑)，威利-英特科学出版公司，纽约，1995年)。
[0142]GAP利用Needleman和Wunsch(出处同上)的算法来寻找两个完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。Wisconsin Genetics软件包第10版中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。空位产生和空位延伸罚分可以以选自0-100的整数来表示。因而，例如，空位产生和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50 或更大。
[0143]GAP给出具有最佳比对的家族中的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因子:品质、比率、同一性和相似性。品质是为了比对序列而最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评定为相似性。威斯康星遗传学软件包版本10中所用的打分矩阵为BL0SUM62(参见Henikoff andHenikoff, (1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89: 10915 (Henikoff Henikoff, 1989 年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页))。
[0144]除非另外指明，否则本文所提供的序列同一性/相似性值指用BLAST2.0程序包，采用默认参数获得的值(Altschul, et al., (1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402 (Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页))。
[0145]如本领域普通技术人员将会理解的,BLAST搜索假定蛋白质可以随机序列建模。然而，许多真实蛋白质包含非随机序列区，该非随机序列可为同聚段、短周期重复或富含一种或多种氨基酸的区域。这种低复杂性区域可在不相关的蛋白质之间比对，尽管该蛋白质的其他区域完全不相似。可采用多种低复杂性过滤程序来减少这种低复杂性比对。例如，可单独使用或联合使用 SEG(Wooten and Federhen, (1993) Comput.Chem.17:149-63 (Wooten 和Federhen, 1993 年，《计算化学》，第 17 卷，第 149-163 页))和 XNU(Claverie and States,(1993)Comput.Chem.17: 191-201 (Claverie 和 States, 1993 年，《计算化学》，第 17 卷，第191-201页))低复杂性过滤程序。
[0146]在两条多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。如果序列差别在于保守置换，则可上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差别在于这种保守置换的序列被说成具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调节的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予I分，非保守置换给予O分,则保守置换给予O至I之间的分数。例如,根据Meyers and Miller, (1988)Computer Applic.B1l.Sc1.4:11-17 (Meyers 和 Miller, 1988 年，《计算机在生物科学中的应用》，第4卷，第11-17页)的算法计算保守置换的分数，例如如在程序PC/GENE (美国加利福尼亚州山景城 Intelligenetics 公司(Intelligenetics, Mountain View, California,USA))中所实现的。
[0147]本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的:确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
[0148]术语多核苷酸序列的“基本上相同”意指包含这样的序列的多核苷酸，该序列与参考序列相比具有50-100%序列同一性，任选地至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列同一性，所述比较是使用所描述的比对程序中的一种并采用标准参数进行的。技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两个核苷酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的实质同一'I"生通常意指55-100%之间的序列同一'丨生,诸如至少55%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、最高至100%的同一性。
[0149]在肽的情形中术语“基本上相同”指肽包含在指定比较窗口上与参考序列具有55-100%之间的序列同一性，诸如与参考序列具有至少55%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、最高至100%的序列同一性的序列。优选地，利用Needleman和Wunsch(出处同上)的同源比对算法进行最佳比对。两条肽序列是基本上相同的指示是，一种肽可与针对第二种肽产生的抗体发生免疫反应。因而，例如，如果某种肽与第二种肽差别仅在于保守置换的话，则这两种肽实质上相同。此外，当某种肽与第二种肽差别在于非保守变化时,如果抗体识别的表位实质上相同，则它们实质上相同。“基本上相似的”肽共有如上所述的序列，例外的是不相同的残基位置差别可在于保守氨基酸变化。
[0150]表 1
[0151]

【权利要求】
1.一种包含多核苷酸序列的分离的核酸，所述多核苷酸序列编码具有无功能的信号肽(SP)的多肽，其中所述无功能的信号肽无法加工并且其中所述核酸在植物中的表达赋予所述植物显性表型。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述具有无功能的信号肽的多肽保留在内质网中。
3.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述无功能的信号肽是由于氨基酸残基在所述信号肽中或所述信号肽附近的一个或多个插入、缺失或置换而成为无功能的。
4.根据权利要求3所述的分离的核酸，其中所述具有所述无功能的信号肽的多肽相对于f目号妝切割位点在第 _10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1> +1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10位处具有一个或多个氨基酸插入、缺失或置换，其中所述信号肽切割位点位于第-1位和第+1位之间。
5.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸包括SEQID N0.:13、15或152的所述无功能的信号肽编码区。
6.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述无功能的信号肽由对应于SEQIDN0.:13的第1222-1332位的多核苷酸序列及其片段编码。
7.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述无功能的信号肽由对应于SEQIDN0.:15的第1-111位的多核苷酸序列及其片段编码。
8.根据权利要求1所 述的分离的核酸，其中所述无功能的信号肽由对应于SEQIDN0.:152的第1-111位的多核苷酸序列及其片段编码。
9.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中核酸包括SEQID N0.:13、15或152的序列。
10.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述多肽包含SEQID NO: 14或153的无功能的信号肽。
11.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述无功能的信号肽包含对应于SEQIDN0.:14的第1-37位的氨基酸序列及其片段。
12.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述无功能的信号肽包含对应于SEQIDN0.:153的第1-37位的氨基酸序列及其片段。
13.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述多肽包括SEQID NO:14或153的序列。
14.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述无功能的信号肽相对于所述信号肽切割位点在第-1位处具有苏氨酸或缬氨酸。
15.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述无功能的信号肽相对于所述信号肽切割位点在第+1位处具有脯氨酸。
16.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述显性表型为减少的雄性育性。
17.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中植物为作物。
18.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中植物为单子叶植物或双子叶植物。
19.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述多肽为无穗丝(tlsl)突变体。
20.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中编码具有无功能的信号肽的多肽的所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
21.根据权利要求20所述的分离的核酸，其中所述启动子为诱导型启动子、组成型启动子、组织优选的启动子、时间调节型启动子或它们的元件。
22.根据权利要求20所述的分离的核酸，其中所述启动子优先地驱动在雄性生殖组织中的表达。
23.根据权利要求20所述的分离的核酸，其中所述启动子为穗丝优选的启动子。
24.根据权利要求20所述的分离的核酸，其中所述启动子选自:
a.SEQ ID NO:9或13的调控区；
b.SEQID NO:62和 64-106 ； c.SEQ ID NO:9或13的调控区的至少100个连续核苷酸； d.SEQ ID NO:62和64-106中任一个的至少100个连续核苷酸； e.与SEQID NO:9或13的调控区的全长具有至少70%序列同一性的序列；以及 f.与SEQID NO:62和64-106中任一个的全长具有至少70%序列同一性的序列。
25.一种具有无功能的信号肽的分离的多肽，其中所述无功能的信号肽无法加工并且其中所述多肽在植物中的表达赋予所述植物显性表型。
26.根据权利要求25所述的多肽，其中所述无功能信号肽是由于氨基酸残基在所述信号肽中或所述信号肽附近的一个或多个插入、缺失或置换而成为无功能的。
27.根据权利要求26所述的多肽，其中所述无功能的信号肽在所述信号肽中相对于信号妝切割位点在第 _10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10位处具有一个或多个氨基酸插入、缺失或置换，其中所述信号肽切割位点位于第-1位和第+1位之间。
28.根据权利要求25所述的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO: 14或153的所述无功能信号肽。
29.根据权利要求25所述的多肽，其中所述无功能的SP包括对应于SEQID N0.:14的第1-37位的氨基酸序列及其片段。
30.根据权利要求25所述的多肽，其中所述无功能的SP包括对应于SEQID N0.:153的第1-37位的氨基酸序列及其片段。
31.根据权利要求25所述的多肽，其中所述多肽包括SEQID NO: 14或153的序列。
32.根据权利要求25所述的多肽，其中所述无功能的信号肽相对于所述信号肽切割位点在第-1位处具有苏氨酸或缬氨酸。
33.根据权利要求25所述的多肽，其中所述无功能的信号肽相对于所述信号肽切割位点在第+1位处具有脯氨酸。
34.根据权利要求25所述的多肽，其中所述显性表型为减少的雄性育性。
35.根据权利要求25所述的多肽，其中植物为作物。
36.根据权利要求25所述的多肽，其中植物为单子叶植物或双子叶植物。
37.一种表达根据权利要求25-33中任一项所述的多肽的细胞。
38.一种表达根据权利要求25-33中任一项所述的多肽的植物，其中所述植物具有相对于对照增加的产量。
39.一种表达根据权利要求25-33中任一项所述的多肽的植物，其中所述植物具有相对于对照减少的雄性育性。
40.一种将减少的雄性育性的显性表型赋予植物的方法，包括在所述植物中表达根据权利要求1-24中任一项所述的核酸，从而将所述减少的雄性育性的显性表型赋予所述植物。
41.一种将减少的雄性育性的显性表型赋予植物的方法，包括在所述植物中表达根据权利要求25-36中任一项所述的多肽，从而将所述减少的雄性育性的显性表型赋予所述植物。
42.一种将多肽保留到植物细胞中的内质网的方法，包括在所述植物细胞中表达根据权利要求1-24中任一项所述的核酸，从而将多肽保留到内质网。
43.一种将显性表型赋予植物的方法，包括在所述植物中表达根据权利要求1-28中任一项所述的核酸，从而将显性表型赋予所述植物。
44.一种将显性表型赋予植物的方法,包括在所述植物中表达根据权利要求25-33中任一项所述的多肽，从而将所述显性表型赋予所述植物。
45.一种包含可操作地连接到无功能的信号肽的蛋白质的融合蛋白，其中所述无功能的信号肽未加工，并且其中所述蛋白质在植物中的表达将显性表型赋予所述植物。
46.根据权利要求45所述的融合蛋白，其中所述无功能的信号肽由根据权利要求1-24所述的核酸中的任一者编码。
47.根据权利要求45所述的融合蛋白，其中所述无功能的信号肽包含根据权利要求25-36所述的多肽中的任一者。
48.—种编码根据权利要求45-47中任一项所述的融合蛋白的核酸。
49.一种表达根据权利要求45-47所述的融合蛋白中的任一者的植物，其中所述植物具有相对于对照减少的雄性育性和/或增加的产量。
50.一种将显性表型赋予植物的方法，包括在所述植物中表达根据权利要求48所述的核酸。
51.—种分离的多核苷酸,所述多核苷酸包含选自以下的核酸: a.与SEQID NO:9、13、15或152的核酸的全长至少90%相同的核酸； b.与SEQID NO:9、13、15或152的核酸的全长至少95%相同的核酸；
c.编码与SEQ ID NO:10、14、153、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、.119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129 或 130 的多肽的全长至少 90%相同的多肽的核酸；
d.编码与SEQ ID NO:10、14、153、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、.119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129 或 130 的多肽的全长至少 95%相同的多肽的核酸；
e.SEQ ID NO:9、13、15 或 152 的核酸； f.与SEQID NO:9、13、15或152的核酸的全长至少90%相同的核酸，并且当与SEQ IDNO:10比对时，所述核酸在对应于SEQ ID NO:10的第37位氨基酸的位置处编码丙氨酸或甘氨酸之外的氨基酸 ； g.与SEQID NO:9、13、15或152的核酸的全长至少90%相同，并且当将所述核酸与SEQ ID NO:10比对时，在对应于SEQ ID NO: 10的第37位氨基酸的位置处编码苏氨酸或缬氨酸的氨基酸的核酸；以及h.a、b、C、d、e、f或g的任一个核酸的互补核酸。
52.一种表达盒，所述表达盒包含可操作地连接至启动子的根据权利要求51所述的多核苷酸。
53.根据权利要求52所述的表达盒，其中所述启动子为组成型启动子、组织优选的启动子或诱导型启动子。
54.根据权利要求53所述的表达盒，其中所述组织优选的启动子优先地驱动在雄性生殖组织中的表达。
55.根据权利要求51所述的表达盒，其中所述启动子为从玉蜀黍、小麦或水稻分离的MS45启动子或5126启动子或MS44启动子。
56.—种植物，其包含根据权利要求52-55中任一项所述的表达盒。
57.一种植物细胞，其包含根据权利要求52-55中任一项所述的表达盒。
58.根据权利要求56所述的植物的种子，其中所述种子包含所述表达盒。
59.根据权利要求56所述的植物，其中所述植物是玉蜀黍。
60.一种分离的多肽，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列:
a.包含SEQ ID NO:10、14、153、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或 130 的氨基酸序列；
b.与SEQ ID NO:10、14、153、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130的多肽的全长至少90%相同的氨基酸序列；
c.与SEQ ID NO:10、14、153、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120 、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130的多肽的全长至少95%相同的氨基酸序列；
d.包含由SEQ ID NO:10、14、153、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129 或 130 编码的成熟蛋白质的氨基酸序列；
e.与由SEQ ID NO:10、14、153、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129 或 130 编码的所述成熟蛋白质的全长至少90%相同的氨基酸序列；以及
f.一种与由 SEQ ID NO:10、14、153、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129 或 130 编码的所述成熟蛋白质的全长至少95%相同的氨基酸序列。
61.根据权利要求60所述的分离的多肽，其中所述对应于SEQID NO:10的第37位的氨基酸为苏氨酸或缬氨酸。
62.根据权利要求60所述的分离的多肽，其中所述对应于SEQID NO:10的第37位的氨基酸不是丙氨酸或甘氨酸。
63.一种用于繁殖对于赋予显性雄性不育的核基因或构建体为纯合的植物的转基因保持系，其中所述转基因保持系对于赋予显性雄性不育的所述核基因或构建体为纯合的，并且其中所述转基因保持系对于SAM构建体为纯合的，其中所述SAM构建体包括抑制所述显性雄性不育基因或构建体的元件、破坏花粉功能的第二元件以及任选地为标记的第三元件，其中由所述转基因保持系产生的功能性花粉不含所述SAM构建体。
64.一种用于形成转基因保持系以用于繁殖对于赋予显性雄性不育的核基因或构建体为纯合的植物的方法，所述方法包括: a.用SAM构建体转化对于所述核基因或构建体为杂合的植物，其中所述SAM构建体包括: .1.抑制所述显性雄性不育基因或构建体的元件， ?.破坏花粉功能的第二元件， ii1.以及任选地为标记的第三元件； b.对所述转化的植物自花授粉以产生种子； c.选择对于所述显性雄性不育基因为纯合的并且包含所述SAM构建体的那些种子；以及 d.种植所述选择的种子以产生转基因保持系。
65.一种用于形成对于赋予显性雄性不育的核基因或构建体为纯合的植物的雄性不育系的方法，所述方法包括: a.对根据权利要求63所述的转基因保持系自花授粉；以及 b.对部分a中产生的所述种子、或由其生长而来的植物基因分型，以选择对于赋予显性雄性不育的所述基因或构建体为纯合的并且不含根据权利要求63所述的SAM构建体的那些种子或植物； 其中所述选择的种子或植物包括所述雄性不育系。
66.一种用于增加对于赋予显性雄性不育的核基因为纯合的植物的雄性不育系的方法，所述方法包括: a.栽培根据权利要求65所述的选择的种子或植物，以产生雄性不育植物； b.用根据权利要求63所述的转基因保持系对所述雄性不育植物授粉；以及 c.从所述雄性不育植物收获种子 其中所述收获的种子对于赋予显性雄性不育的所述核基因或构建体为纯合的。
67.一种用于形成对于赋予显性雄性不育的核基因或构建体为杂合的杂交植物的方法，所述方法包括: a.种植根据权利要求66所述的收获的种子以栽培雄性不育植物，其中所述植物为雄性不育自交系； b.用为雄性可育的第二自交系对所述雄性不育自交系植物授粉； c.从所述雄性不育自交系植物收获杂交种子； d.种植所述收获的种子以产生对于赋予显性雄性不育的所述基因或构建体为杂合的杂交植物。
68.通过根据权利要求67所述的方法的步骤a至c产生的杂交种子。
69.—种用于产生雄性不育杂交种子的方法,所述方法包括 a.用基因构建体转化对于显性雄性不育为杂合的雄性不育系，所述基因构建体包括: . 1.抑制所述显性雄性不育的元件； ?.破坏花粉功能的第二元件； ii1.任选的为标记的第三元件；并且在所述自交系中表达所述元件以使得所述植物雄性可育； b.对所述雄性可育植物自花授粉； C.产生显性雄性不育的纯合子代； d.鉴别具有所述纯合显性雄性不育基因型并且包含所述构建体作为所述保持系的那些种子； e.鉴别具有所述纯合显性雄性不育基因型并且不含所述构建体作为所述显性雄性不育自交系的那些种子； f.用所述保持系的花粉对所述雄性不育自交系授粉以增加所述显性雄性不育自交系; g.用第二自交系的花粉对所述雄性不育自交系授粉，以产生对于显性雄性不育为杂合的雄性不育杂交种子。
70.根据权利要求64或权利要求69所述的方法，其中抑制所述显性雄性不育的所述元件选自涉及赋予显性雄性不育的所述核基因或构建体的反义分子、RNAi分子和发夹分子。
71.根据权利要求63所述的转基因保持系，其中抑制所述显性雄性不育的所述元件选自涉及赋予雄性不育的所述核基因或构建体的反义分子、RNAi分子和发夹分子。
72.根据权利要求71所述的转基因保持系，其中所述抑制元件为靶向驱动赋予雄性不育的所述核基因的所述启动子的启动子反向重复。
73.根据权利要求72所述的转基因保持系，其中所述抑制元件为靶向所述MS44启动子的启动子反向重复。
74.根据权利要求63和71-73中任一项所述的转基因保持系，其中破坏花粉功能的所述元件编码干扰淀粉在花粉中的正常积聚或影响花粉内的渗透平衡的蛋白质。
75.根据权利要求74所述的转基因保持系，其中破坏花粉功能的所述元件编码α-淀粉酶、淀粉酶或脱支酶。
76.根据权利要求63和71-73中任一项所述的转基因保持系，其中破坏花粉功能的所述元件选自表达对雄性配子具有细胞毒性的产物或以其他方式抑制雄性配子发育的基因。
77.根据权利要求76所述的转基因保持系，其中破坏花粉功能的所述元件为DAM-甲基化酶、芽孢杆菌RNA酶或链霉抗生物素蛋白。
78.根据权利要求63和71-77中任一项所述的转基因保持系，其中所述SAM构建体包括在种子组织中表达的标记。
79.根据权利要求63和71-78中任一项所述的转基因保持系，其中所述标记在胚乳、糊粉或果皮组织中表达。
80.根据权利要求63和71-79中任一项所述的转基因保持系，其中所述标记为荧光蛋白。
81.根据权利要求63和71-80中任一项所述的转基因保持系，其中所述标记为红色荧光蛋白。
82.—种在雄性不育杂交植物上产生谷粒的方法，所述方法包括 a.由通过根据权利要求68或69所述的方法产生的所述种子栽培雄性不育杂交植物； b.提供传粉媒介植物以使所述雄性不育杂交植物受精； c.允许来自所述雄性可育植物的花粉对所述雄性不育杂交植物授粉；以及d.从所述雄性不育杂交植物收获谷粒。
83.根据权利要求82所述的方法，还包括: a.使将要生长成传粉媒介植物的种子与根据权利要求68或69所述的方法产生的所述杂交种子混合； b.种植所述种子混合物； c.允许来自所述雄性可育植物的花粉对所述雄性不育杂交植物授粉；以及 d.从所述雄性不育植物收获谷粒。
84.根据权利要求64、65、66、67、69、82或83中任一项所述的方法，其中所述植物为玉蜀黍植物。
85.根据权利要求82所述的方法，其中所述方法在环境胁迫条件下实施。
86.根据权利要求63和71-81中任一项所述的转基因保持系，其中赋予显性雄性不育的所述核基因或构建体选自: a.包含多核苷酸序列的分离的核酸，所述多核苷酸序列编码包含无功能的信号肽的多肽，其中所述核酸在植物中的表达赋予所述植物显性雄性不育表型； b.SEQ ID NO:13U5或152的分离的核酸； c.芽孢杆菌RNA酶、链霉抗生物素蛋白、DAM、MS41或MS42。
87.育种的植物对，包括:第一植物和第二植物，其中所述第一植物表达包含多核苷酸序列的外源核酸分子，所述多核苷酸序列编码具有无功能信号肽序列的多肽，其中所述外源核酸分子的表达将雄性不育的显性表型赋予所述第一植物，使得所述第一植物为雄性不育的，以及(b)第二植物，其中所述第二植物包括包含多核苷酸的可表达外源核酸分子，所述多核苷酸在表达时抑制所述第一植物的编码具有无功能信号肽序列的多肽的多核苷酸序列的表达或可操作地连接到编码具有无功能信号肽的多肽的多核苷酸序列的启动子的表达。
88.根据权利要求87所述的植物对，其中在所述第一植物中，编码具有无功能信号肽序列的多肽的多核苷酸序列可操作地连接至启动子。
89.根据权利要求88所述的植物对，其中所述启动子为诱导型启动子、组成型启动子、组织优选的启动子、时间调节型启动子或它们的元件。
90.根据权利要求89所述的植物对，其中所述启动子优先地驱动在雄性生殖组织中的表达。
91.根据权利要求90所述的植物对，其中所述雄性生殖组织优选的启动子为所述MS45启动子、MS26启动子、MS22启动子或5126启动子。
92.根据权利要求88所述的植物对，其中所述启动子选自:
g.SEQ ID NO:62 和 64-106，以及 SEQ ID NO:9 和 13 的调控区； h.SEQ ID NO:9、13、62和64-106的至少100个连续核苷酸；以及 1.与SEQID NO:9、13、62和64-106的全长具有至少70%序列同一性的序列。
93.根据权利要求87所述的植物对，其中所述第二植物中的外源核酸分子抑制所述第一植物中的MS44突变基因的多核苷酸序列的表达。
94.根据权利要求93所述的植物对，其中所述第一植物中的所述MS44突变基因选自SEQ ID NO:13,15 和 152。
95.根据权利要求87所述的植物对，其中所述第二植物中的所述外源核酸分子为靶向驱动MS44多核苷酸的表达的启动子的发夹抑制元件，所述MS44多核苷酸编码具有所述第一植物中的无功能SP的多肽。
96.育种的植物对，包括:第一植物和第二植物，其中所述第一植物表达包含多核苷酸序列的外源核酸分子，所述多核苷酸序列编码融合到无功能SP的多肽，其中所述外源核酸分子的表达将雄性不育的显性表型赋予所述第一植物，使得所述第一植物为雄性不育的，以及(b)第二植物，其中所述第二植物包括包含多核苷酸的可表达外源核酸分子，所述多核苷酸在表达时抑制包括编码融合到无功能SP的多肽的多核苷酸序列的核酸分子的表达或抑制可操作地连接到包括编码融合到所述第一植物的无功能SP的多肽的多核苷酸序列的核酸分子的启动子的表达。
97.根据权利要求96所述的植物对，其中在所述第一植物中，编码融合到所述无功能的信号肽的多肽的多核苷酸可操作地连接到诱导型启动子、组成型启动子、组织优选的启动子、时间调节型启动子或它们的元件。
98.根据权利要求97所述的植物对，其中所述组织优选的启动子为MS45、MS26、MS22或 5126。
99.根据权利要求96所述的植物对，其中所述第二植物中的所述外源核酸分子抑制所述第一植物中的MS44突变基因的多核苷酸序列的表达。
100.根据权利要求99所述的植物对，其中所述第一植物中的所述MS44突变基因选自SEQ ID NO:13,15 和 152。
101.一种减少由谷粒生产田地中的作物物种产生的花粉的方法，所述方法包括在所述田地中种植雄性育性表型的共混物，其中所述植物的大多数为雄性不育的，其中用于所述田地的总花粉流少于用于其中所述植物的大多数为雄性可育的田地的总花粉流。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述雄性不育植物为杂交体。
103.根据权利要求101或102所述的方法，其中所述雄性不育由显性基因或构建体赋予。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述显性雄性不育基因为MS44的等位基因。
105.根据权利要求101-104中任一项所述的方法，其中所述作物物种为玉蜀黍或高
ο
106.根据权利要求101-105中任一项所述的方法，其中相对于其中所述植物的大多数为雄性可育的田地，与杂草型物种的远交减少。
107.一种用于降低作物物种的产物中转基因的偶然存在的风险的方法，其中所述方法包括使所述转基因保持在所述作物的雄性不育系中。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述转基因存在于所述作物物种的雄性不育杂交体中。
109.根据权利要求107或108所述的方法，其中所述产物为谷粒。
110.根据权利要求107-109中任一项所述的方法，其中所述作物物种为玉蜀黍或高粱或向日葵。
111.根据权利要求107-109中任一项所述的方法，其中所述转基因连接到赋予显性雄性不育的基因或构建体。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述赋予显性雄性不育的基因为MS44的等位基因。
113.根据权利要求111或112所述的方法，其中所述转基因编码改善纤维素的消化性的酶 。
【文档编号】C12N15/82GK104169296SQ201380014363
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年3月12日 优先权日:2012年3月13日
【发明者】M.C.阿尔伯森, T.W.福克斯, A.L.伦纳德, 李柏林, B.R.罗夫兰, M.特林内尔 申请人:先锋国际良种公司, 纳幕尔杜邦公司