编码fasciatedear4(fea4)的核苷酸序列及其使用方法

编码fasciated ear4(fea4)的核苷酸序列及其使用方法
【专利摘要】本发明提供了用于调节茎端分生组织尺寸的方法和组合物。提供了用于调节fea4序列在宿主植物或植物细胞中的表达以调节诸如改变的尺寸和器官(包括植物种子)数的农学特性的方法。
【专利说明】编码FASCIATED EAR4(FEA4)的核苷酸序列及其使用方法
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求提交于2012年3月14日的美国临时申请61/610730和提交于2013 年1月31日的美国临时申请61/759342的权益，每个申请全部内容以引用方式并入本文。
[0003] 政府I持
[0004] 本文所述发明受政府整体或部分支持，美国批准号为0604923,由国家科学基金 会（National Science Foundation)以植物基因组研宄项目赠款计划（Plant Genome Research Project Grants Program)资助。美国政府在本发明中享有某些权利。

【技术领域】
[0005] 本发明涉及植物基因操纵领域，尤其是植物中基因活性和发育的操纵。

【背景技术】
[0006] 叶和产生分枝与花的腋生分生组织以规则型式起始于茎端分生组织（SAM)。茎端 分生组织顶端的细胞用作干细胞，其分裂以连续置换子细胞至周围区域，其中它们进入分 化的叶或花原基。分生组织从而能够在发育期间通过平衡细胞增殖与细胞进入新的原基来 调节它们的大小。SAM提供植物体的所有地上部分。干细胞调节的中心概念通过CLAVATA/ WUSCHEL(CLV/WUS)基因的信号途径是已知的。在拟南芥（Arabidopsis)中的CLV1、CLV2、 或CLV3活性损失引起未分化细胞在茎顶端的积聚，指示CLV基因一起促进干细胞及时转 移到分化途径中，或抑制干细胞分裂，或以上两者（Fletcher等人，（1999)Science 283: 1911-1914 ;Taguchi_Shiobare 等人，（2001)Genes and Development 15 :2755-5766;和 Trotochaud 等人，（1999)Plant Cell 11 :393-405 ;Merton 等人，（1954)Am.J.Bot. 41: 726-32，以及 Szymkowiak 等人，（1992)Plant Cell 4 :1089-100 ;Yamamoto 等人，（2000) Biochim.Biophys. Acta. 1491 :333-40)。CLV1/2 的玉米直系同源物是 TDl 和 FEA2,它们已 经被报道了（Taguchi-Shiobara 等人，（2001) Genes Dev. 6515 :2755-66)。期望能够控制苗 和花分生组织的尺寸和外观，从而提供提高的叶、花、和果实的产量。因此，本发明的目的是 为了提供用于调节分生组织发育的新型方法和组合物。


【发明内容】

[0007] 在一个实施例中，本发明提供产生具有下降的内源Fea4表达的转基因植物的方 法，该方法包括以下步骤：（a)将重组构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组构建体 包含可操作地连接至启动子的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列的表达降低内源 Fea4的 表达；(b)在步骤（a)之后，由可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中转基因植物在其 基因组中包含重组DNA构建体；以及（c)选择（b)的转基因植物，其中该转基因植物包含重 组DNA构建体且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出下降的Fea4。
[0008] 在另一个实施例中，本发明提供产生具有下降的内源Fea4表达的转基因植物的 方法，该方法包括以下步骤：（a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组 DNA构建体包含以有义或反义取向可操作地连接至在植物中有功能的启动子的分离的多核 苷酸，其中多核苷酸包含：（i) SEQ ID NO :1或2的核苷酸序列；（ii)基于Clustal W比对 方法，在与SEQ ID NO :1或2进行比较时具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列；（iii) SEQ ID NO :1或2的至少100个连续的核苷酸的核苷酸序列；（iv)能够在严格条件下与（i) 的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或（V)经修饰的植物miRNA前体，其中该前体已经经修饰 以用设计用于产生指向SEQ ID NO :1或2的miRNA的序列替换miRNA编码区；(b)在步骤 (a) 之后，由所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中 包含重组DNA构建体；以及（c)选择（b)的转基因植物，其中该转基因植物包含重组DNA构 建体且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出下降的Fea4表达。
[0009] 本发明的一个实施例是产生具有改变的农学特性的转基因植物的方法，该方法包 括以下步骤：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包 含可操作地连接至至少一个调控序列的分离的多核苷酸，其中多核苷酸编码多肽的片段或 变体，基于Clustal W比对方法，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO :3进行比较时 具有至少80%的序列同一性，其中片段或变体赋予在可再生的植物细胞中的显性负表型； (b) 在步骤（a)之后，由可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基 因组中包含重组DNA构建体；以及（c)选择（b)的转基因植物，其中转基因植物包含重组 DNA构建体且在与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种选自下列 的农学特性的改变：穗分生组织尺寸、籽粒行数、叶数、花序数、在花序内的分枝、花数、果实 数、种子数、植物高度、生物量和产量。
[0010] 本发明的另一个实施例是上述方法，其中部分（a)的多肽在具有fea4突变体基因 型的植物品系中的表达能够部分或全部恢复野生型表型。
[0011] 本发明的一个实施例是鉴定fea4的较弱等位基因的方法，该方法包括以下步骤： (a)对突变体玉米植物的群体进行基因筛选；(b)鉴定表现出比fea4无效植物更弱的fea4 表型的一个或多个突变体玉米植物；以及（c)从具有更弱的fea4表型的突变体玉米植物中 鉴定弱fea4等位基因。
[0012] 本发明的一个实施例是鉴定fea4的较弱等位基因的方法，该方法包括以下步骤： (a)利用SEQ ID N0:1或2进行基因改组；(b)将来自步骤（a)的经改组的序列转化到可再 生的植物细胞的群体中；(c)由步骤（b)的经转化的可再生的植物细胞的群体再生经转化 的植物的群体；（d)针对弱fea4表型，筛选来自步骤（c)的经转化的植物的群体；以及（e) 从表现出弱fea4表型的经转化的植物中鉴定弱fea4等位基因。
[0013] 本发明的一个实施例是其中内源Fea4基因表达相对于对照植物被抑制的植物。 本发明的另一个实施例是制备所述植物的方法，该方法包括以下步骤：(a)向内源Fea4基 因中引入突变；以及（b)检测该突变，其中该突变对于抑制内源Fea4基因的表达是有效的。 在一个实施例中，（a)和（b)的步骤是使用定向诱导基因组局部突变（TILLING)方法来完 成的。在另一个实施例中，该突变是位点特异性突变。
[0014] 本发明的一个实施例是表现出相对于野生型植物更弱的fea4表型的植物。另一 个实施例是制备所述植物的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)将转座子引入到包含内 源Fea4基因的种质中；(b)获取步骤（a)的种质的子代；（c)以及鉴定步骤（b)的子代植 物，其中转座子已经插入到内源Fea4基因，并且观察到Fea4表达的下降。步骤（a)还可包 括通过转化来将转座子引入到种质的可再生植物细胞以及由可再生的植物细胞再生出转 基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含转座子。
[0015] 在一个实施例中，提供了上述方法，其中所述方法还包括以下步骤：（a)将重组构 建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组构建体包含通过上述方法鉴定的弱fea4等位 基因；(b)在步骤（a)之后，由可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在 其基因组中包含重组DNA构建体；以及（c)选择（b)的转基因植物，其中该转基因植物包含 重组DNA构建体且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出弱fea4表 型。
[0016] 另一个实施例是产生具有改变的农学特性的转基因植物的方法，该方法包括（a) 将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含以有义或反义取 向可操作地连接至在植物中有功能的启动子的分离的多核苷酸，其中多核苷酸包含：（i) SEQ ID NO :1或2的核苷酸序列；（ii)基于Clustal W比对方法，在与SEQ ID NO :1或2进 行比较时具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列；（iii) SEQ ID NO :1或2的至少100个 连续的核苷酸的核苷酸序列；（iv)能够在严格条件下与（i)的核苷酸序列杂交的核苷酸序 列；或（V)经修饰的植物miRNA前体，其中该前体已经经修饰以用设计用于产生指向SEQ ID NO :1或2的miRNA的序列替换miRNA编码区；(b)在步骤（a)之后，由可再生的植物细胞再 生出转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及（c)选择（b)的 转基因植物，其中转基因植物包含重组DNA构建体且在与不包含重组DNA构建体的对照植 物进行比较时表现出至少一种选自下列的农学特性的改变：增大的穗分生组织、籽粒行数、 种子数、植物高度、生物量和产量。另一个实施例是通过这种方法产生的植物。
[0017] -个实施例是在植物中表达异源多核苷酸的方法，该方法包括（a)用重组DNA构 建体转化可再生的植物细胞，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至第二多核苷酸的异 源多核苷酸，其中第二多核苷酸是Fea4启动子；(b)在步骤（a)之后，由可再生的植物细 胞再生出转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及（c)选择 (b)的转基因植物，其中转基因植物包含重组DNA构建体，并且进一步地，其中异源多核苷 酸在转基因植物中表达。另一个实施例是在其基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述 重组DNA构建体包含可操作地连接至第二多核苷酸的异源多核苷酸，，其中第二多核苷酸 是Fea4启动子，并且其中异源多核苷酸在植物中表达。
[0018] 另一个实施例是鉴定具有至少一种农学特性的改变的第一玉米植物或第一玉米 种质的方法，该方法包括在第一玉米植物或第一玉米种质中检测至少一种与所述表型相关 联的标记基因座的多态性，其中标记基因座编码多肽，所述多肽包含选自下列的氨基酸序 列：a)与SEQ ID NO :3具有至少90%且小于100%的序列同一性的氨基酸序列，其中在与对 照植物进行比较时，所述多肽在植物或其植物部分中的表达引起至少一种选自下列的农学 特性的改变：穗分生组织尺寸、籽粒行数、花序数、在花序内的分枝、花数、果实数和种子数， 其中对照植物包含SEQ ID NO :3。
[0019] 本发明包括包含本发明的分离的多核苷酸的重组DNA构建体，该分离的多核苷酸 以有义或反义取向可操作地连接至茎端分生组织特异性的或茎端分生组织优选的启动子。
[0020] 本发明包括载体，细胞、植物或种子，其包含本发明所述的任何重组DNA构建体 中。
[0021 ] 本发明涵盖通过本文所述方法产生的植物。
[0022] 本发明也包括包含上文所描述的重组DNA构建体的再生的、成熟的和能繁殖的转 基因植物、从其产生的转基因种子、Tl和后续的世代。所述转基因的植物细胞、组织、植物 和种子可以包含至少一种所关注的重组DNA构建体。
[0023] 在一个实施例中，植物选自：拟南芥、番前、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小 麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘鹿和柳枝稷。
[0024] 在一个实施例中，包含本发明所描述的重组构建体的植物是单子叶植物。在另一 个实施例中，包含本发明所描述的重组构建体的植物是玉米植物。

【专利附图】

【附图说明】 [0025] 和序列表
[0026] 根据以下的详细描述和附图以及序列表，可以更全面地理解本发明，以下的详 细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。此序列表中以单个字母表示核苷酸，以 三个字母表不氨基酸，如 Nucleic Acids Researchl3 :3021-3030(1985)和 Biochemical Journal 219(No. 2) :345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB标准中所规定，它们以引用方 式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C. F. R. § 1. 822所示 的规定。
[0027] 图IA示出fea4在染色体6上的位点。图IB示出fea4中的位点特异性突变和Mu 转座子插入位点。图IC示出FEA4蛋白质内的域。
[0028] 图2A示出fea4突变的营养表型。图2B比较野生型（左侧）与fea4突变体（右 侦D的雄穗。图2C比较野生型（左侧）与fea4突变体（右侧）的穗。图2D和图2C分别 示出fea4和野生型的不成熟穗的SEM图片。
[0029] 图3A不出fea4、ramosa2和fea4/ramosa2双突变体的糖和雄糖表型。图3B不 出fea4、ramosal和fea4/ramosal双突变体的糖和雄糖表型。图30不出fea4、ramosa3和 fea4/ramosa3双突变体的穗和雄穗表型。
[0030] 图4A示出在fea4和CLAVATA2直系同源物fea2之间的双突变体的穗表型。图4B 示出fea4/fea2双突变体的营养表型。
[0031] 图5示出fea4途径的拟建模型。
[0032] 图6A示出fea4突变体在A619背景下的雄蕊。图6B给出在fea4突变系中的雄 蕊数频率。图6C示出野生型（WT)A619的雄蕊。图6D给出在WT系中的雄蕊数频率。
[0033] 图7比较无 FEA4转基因（左侧）的fea4/fea4纯合系与已经用FEA4编码序列与 黄色荧光蛋白质（YFP)的翻译融合在天然启动子控制下转化过的fea4/fea4纯合系。
[0034] 图8A-8D示出分别来自野生型、fea2、fea4和fea4/fea2突变系的F2植物的分生 组织。图8E示出每个系以毫米表示的分生组织尺寸。
[0035] 序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R. § 1.821-1. 825所列出的关于专利申 请中核苷酸和/或氨基酸序列公开的规定。此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三字 母表示氨基酸，如 Nucleic Acids Res. 13 :3021-3030 (1985)和 Biochemical J. 219 (2): 345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB标准中所规定，它们以引用方式全文并入本文。用于 核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C. F. R. § 1. 822所示的规定。
[0036] SEQ ID NO :1是基因组野生型Fea4基因的核苷酸序列。
[0037] SEQ ID NO :2是野生型Fea4的编码区的核苷酸序列。
[0038] SEQ ID NO :3是野生型FEA4蛋白质的氨基酸序列。
[0039] SEQ ID NO :4是基因组突变体fea4-0等位基因的核苷酸序列。
[0040] SEQ ID NO :5是突变体fea4-0等位基因的编码区的核苷酸序列。
[0041] SEQ ID NO :6是由突变体fea4-0等位基因编码的氨基酸序列。
[0042] SEQ ID NO :7是基因组突变体fea4-rel*09-5171等位基因的核苷酸序列。
[0043] SEQ ID NO :8是突变体fea4-rel*09-5171等位基因的编码区的核苷酸序列。
[0044] SEQ ID NO :9是由突变体fea4-rel*09-5171等位基因编码的氨基酸序列。
[0045] SEQ ID NO :10是拟南芥PERIANTHIA(PAN)基因的基因组AT1G68640基因座的核 苷酸序列。
[0046] SEQ ID NO :11是AT1G68640基因座的cDNA的核苷酸序列。
[0047] SEQ ID NO :12是由AT1G68640基因座编码的蛋白质的氨基酸序列。
[0048] SEQIDN0:13是编码Sbl0g009592·l(-种来自高粱的FEA4同源物）的核苷酸 序列。
[0049] SEQ ID NO :14是Sbl0g009592. 1 ( -种来自高粱的FEA4同源物）的氨基酸序列。
[0050] SEQ ID NO :15是编码L0C_0s06gl5480. 1 ( -种来自稻的FEA4同源物）的核苷酸 序列。
[0051] SEQ ID NO :16是L0C_0s06gl5480. 1(-种来自稻的FEA4同源物）的氨基酸序列。
[0052] SEQ ID NO : 17是FEA4启动子的核苷酸序列。
[0053] SEQ ID NO :18是编码YFP-FEA4融合蛋白质的核苷酸序列。
[0054] SEQ ID NO :19是编码RFP-FEA4融合蛋白质的核苷酸序列。
[0055] SEQ ID NO :20 是 FEA43' -UTR 的核苷酸序列。
[0056] 序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R. § 1.821-1. 825所列出的关于专利申 请中核苷酸和/或氨基酸序列公开的规定。
[0057] 此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如Nucleic Acids Res. 13 :3021-3030(1985)和 Biochemical J. 219(No. 2) :345-373(1984)所描述的 IUPAC-IUBMB标准中所规定，它们以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据 的符号和格式遵循如37C. F. R. § 1. 822所示的规定。

【具体实施方式】
[0058] 本文中所列出的每篇参考文献的公开内容均全文以引用方式并入本文。
[0059] 除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用的单数形式"一 个"、"一种"以及"所述"包括复数涵义。因此，例如，"一株植物（a plant)"的涵义包括多 株此类植物，"一个细胞（acell) "的涵义包括一个或多个细胞以及它们为本领域技术人员 所知的等同物，诸如此类。
[0060] 如本文所用：
[0061] 术语"单子叶植物"和"单子叶的植物"本文互换使用。本发明的单子叶植物包括 禾本科植物。
[0062] 术语"双子叶植物"和"双子叶的植物"本文互换使用。本发明的双子叶植物包括 以下家族：十字花科植物、豆科植物、和茄科植物。
[0063] 术语"全长互补序列"和"全长的互补序列"本文互换使用，指给定核苷酸序列的 互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100%互补的。
[0064] "转基因"指其基因组因异源核酸（诸如重组DNA构建体）的存在而发生改变的任 何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初 的转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些。如本文所用的术语"转基因"不涵盖 通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重 组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组（染色体基因组或染色体外基因组） 改变。
[0065] "基因组"在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括 存在于细胞的亚细胞组分（例如线粒体、质粒）中的细胞器DNA。
[0066] "植物"包括整个植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植物的子 代。植物细胞无限制地包括来自种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子 体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。
[0067] "子代"包括植物的任何后续世代。
[0068] "转基因植物"包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。举例来说，异源多核 苷酸被稳定地整合到基因组内，以使得该多核苷酸传给连续几代。异源多核苷酸可以单独 地或作为重组DNA构建体的一部分整合到基因组中。
[0069] "性状"指植物或特定植物材料或细胞的生理学、形态学、生物化学、或物理学特 征。在某些情况下，这种特征是人眼可见的，例如种子或植物大小，或能够通过生物化学技 术测量，例如检测种子或叶片的蛋白质、淀粉、或油含量，或通过观察代谢或生理过程，如通 过测量缺水耐受性或特定盐或糖浓度的耐受性，或通过观察一个或多个基因的表达水平， 或通过农学观察如渗透胁迫耐受性或产量。
[0070] "农学特性"是可测量的参数，包括但不限于低温胁迫下的穗分生组织尺寸、雄穗 尺寸、绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总 植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、营养组织 游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋 白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒 伏、植物高度、穗高、穗长耐盐性、早期幼苗活力和出苗。
[0071 ] 针对序列而言的"异源"意指来自外来物种的序列，或如果来自相同物种，则指通 过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
[0072] "多核苷酸"、"核酸序列"、"核苷酸序列"或"核酸片段"可互换使用，并且指作为 单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸 (通常以它们的5'-单磷酸形式存在）通过它们的单字母命名指代如下："A"是指腺苷酸 或脱氧腺苷酸（分别用于RNA或DNA)，"C"是指胞苷酸或脱氧胞苷酸，"G"是指乌苷酸或脱 氧乌苷酸，"U"是指尿苷酸，"T"是指脱氧胸苷酸，"R"是指嘌呤（A或G)，"Y"是指嘧啶（C 或T)，"K"是指G或T，"H"是指或C或T，" I "是指肌苷，"N"是指任何核苷酸。
[0073] "多肽"、"肽"、"氨基酸序列"和"蛋白质"在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚 合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类 似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语"多肽"、"肽"、"氨基酸 序列"和"蛋白质"还可包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的 γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
[0074] "信使RNA(mRNA) "指无内含子并且可由细胞翻译成蛋白质的RNA。
[0075] "cDNA"指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以 是单链的或可以用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。
[0076] "编码区"是指当转录、加工、和/或翻译时导致多肽序列产生的多核苷酸序列。
[0077] "表达序列标签"（"EST"）是得自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已经被转录 的序列。EST通常通过cDNA插入序列单程测序获取。将完整的cDNA插入序列称为"全长插 入序列"（"FIS"）。"重叠群"序列是由选自，但不限于EST、FIS和PCR序列的两个或更多 个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白质的序列称为"完全基因序列"（"CGS"）， 该序列能得自FIS或重叠群。
[0078] "成熟"蛋白质指经翻译后加工的多肽；S卩，已经去除了存在于初级翻译产物中的 任何前肽或原肽的多肽。
[0079] "前体"蛋白质指mRNA的翻译初级产物；S卩，具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和 原肽可以是并且不限于细胞内定位信号。
[0080] "分离的"指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中 通常伴随该物质或与其反应的组分，或说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可 从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分 离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
[0081] "重组体"是指例如通过化学合成或通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来 实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。"重组体"也包括指已经通过引入异源核酸而 进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件 (如自发突变、自然转化/转导/转座）对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发 生的那些。
[0082] "重组DNA构建体"指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重 组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通 常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
[0083] 术语"入门克隆"和"入门载体"本文可互换使用。
[0084] "调控序列"或"调控元件"可互换使用，并且指位于编码序列的上游（5'非编码 序列）、中间或下游C非编码序列），并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或 翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化 识别序列。术语"调控序列"和"调控元件"在本文中可互换使用。
[0085] "启动子"指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。
[0086] "在植物中有功能的启动子"指能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否 来源于植物细胞。
[0087] "组织特异性启动子"和"组织优选启动子"可以互换使用，并且指主要但非必须专 一地在一种组织或器官中表达，但是也可以在一种特定细胞中表达的启动子。
[0088] "发育调控启动子"指其活性由发育事件决定的启动子。
[0089] 术语"可操作地连接"指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能 受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调控核酸片段的转录时，该启动子与该核 酸片段进行了可操作地连接。
[0090] "表达"指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可以指核酸片段的转录（如生 成mRNA或功能RNA的转录）和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
[0091] "过表达"是指基因产物在转基因生物中超过在来自相同实验的沉默分离（或非转 基因）生物中的水平的生产。
[0092] "表型"是指细胞或生物体的可检测的特征。
[0093] 有关将核酸片段（例如重组DNA构建体）插入细胞内的"引入"意指"转染"或"转 化"或"转导"，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整 合进细胞的基因组（如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主的复制子或瞬时表 达（如转染的mRNA)。
[0094] "经转化的细胞"是将核酸片段（如重组DNA构建体）引入其中的任何细胞。
[0095] 在此所用的"转化"指稳定转化和瞬时转化两者。
[0096] "稳定转化"指将核酸片段引入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦 稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。
[0097] "瞬时转化"指将核酸片段引入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基 因表达而无基因稳定遗传。
[0098] 术语"杂交的"或"杂交"指经由授粉产生子代的配子融合（例如细胞、种子或植 物）。该术语包括有性杂交（一株植物被另一株植物授粉）和自交（自花授粉，例如当花粉 和胚珠来自相同植物时）。术语"杂交"指经由授粉产生子代的配子融合行为。
[0099] "有利等位基因"为位于特定基因座、赋予或有助于所期望的表型的等位基因，所 述表型例如提高的细胞壁消化性，或作为另外一种选择，为允许具有降低的细胞壁消化性 的植物的鉴定的等位基因，其中所述植物可从育种计划或种植中被筛除（"反选择"）。标 记的有利等位基因是与有利表型共分离的标记等位基因，或作为另外一种选择，与不利植 物表型共分离，从而提供鉴定植物的有益效果。
[0100] 术语"引入"指将核酸（例如表达构建体）或蛋白质提供至细胞中的手段。引入 包括指将核酸整合到真核或原核细胞中，在该细胞中核酸可整合到细胞的基因组内，并且 包括指将核酸或蛋白质暂时提供给细胞。引入包括指稳定的或瞬时的转化方法以及有性杂 交。因此，将核酸片段（例如重组DNA构建体/表达构建体）插入细胞内的情况下的"引 入"意指"转染"或"转化"或"转导"，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在 该细胞中核酸片段可以整合进细胞的基因组（如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内、转变 成自主的复制子或瞬时表达（例如转染的mRNA)。
[0101] "抑制DNA构建体"是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因 "沉默"的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可以是内源的或是转基因的。如本文针 对靶基因所使用的，"沉默"通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制， 和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。本文中可交换使用的术语"抑制"、"抑制 性"以及"沉默"包括减小、降低、减退、下降、抑制、消除或防止。"沉默"或"基因沉默"不确 定机理并且包括但不限于反义、共抑制、病毒-抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方 法以及基于小RNAi的方法。沉默靶向编码区或非编码区，例如内含子、5'-UTR和3'-UTR、 或以上二者。
[0102] 抑制DNA构建体可以包含源自所关注的靶基因的区域并且可以包含所关注的靶 基因的有义链（或反义链）的核酸序列的全部或部分。取决于所要利用的方法，该区域可与 所关注基因的有义链（或反义链）的全部或部分100%相同或具有小于100%同一性的同 一性（如具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、 62 %,63 %,64 %,65 %,66 %,67 %,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %,73 %,74 %,75 %,76 %, 77 %,78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %, 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的同一性）。
[0103] 抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建，并 且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒-抑制构建体、发夹抑制构建体、茎-环抑 制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更通常的是，RNAi (RNA干扰）构建体和小RNA构建 体，例如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA (微RNA)构建体。
[0104] "反义抑制"指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的反义RM转录物。"反义RNA" 指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片段表达的RNA转录物 (美国专利号：5, 107, 065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即Y非编码序列、 3'非编码序列、内含子或编码序列互补。
[0105] "共抑制"指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的有义RNA转录物。"有义" RNA 指包括mRNA并且可在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。此前，已通过着眼于以 有义取向过表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列（其导致与过表达的序列具有同源性 的所有RNA降低）设计出了植物中的共抑制构建体（参见Vaucheret等人，Plant J. 16 : 651-659(1998);和Gura，Nature 404:804-808(2000))。共抑制构建体可包含来自编码区 或非编码区的序列，例如内含子、5' -UTR和3' -UTR、或以上二者。
[0106] 另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制（于 1998年8月20日公开的PCT专利公开WO 98/36083)。
[0107] RNA干扰是指由短干扰性RNA(SiRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默 的过程（Fire等人，Nature 391 :806(1998))。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉 默（PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用（quelling)。据信转录后基因沉默过 程是用于防止外来基因表达的进化保守的细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所 共享（Fire 等人，Trends Genet. 15 :358(1999)) 〇
[0108] 小RNA在控制基因表达中起重要作用。很多发育过程（包括开花）的调节是由小 RNA控制的。现在有可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来以工程手段改变 植物基因的基因表达。
[0109] 小RNA似乎是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与RNA结 合时，小RNA或引发靶序列的RNA裂解或引发翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，据信小RNA 可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么，这些事件的后果是基因表达受到抑制。
[0110] 微RNA(miRNA)是长度为约19至约24个核苷酸（nt)的已经在动物和植物中鉴 定出的非编码 RNA(Lagos-Quintana 等人，Science 294:853-858(2001)，Lagos-Quintana 等人，Curr. Biol. 12 :735-739(2002) ;Lau 等人，Science 294 :858-862(2001) ;Lee 和 Ambros，Science 294:862-864(2001) ;Llave 等人，Plant Cell 14:1605-1619(2002); Mourelatos 等人，Genes. Dev. 16 :720-728 (2002) ;Park 等人，Curr. Biol. 12 : 1484-1495(2002) ;Reinhart 等人，Genes. Dev. 16:1616-1626(2002))。它们是由大小为大 约70至200nt的较长的前体转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定的发夹 结构。
[0111] 微RNA(miRNA)看起来通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合来 调节靶基因。看起来有可能miRNA可进入至少两条靶基因调控途径：（1)翻译抑制；（2) RNA 裂解。进入RNA裂解途径的微RNA与在动物中RNA干扰（RNAi)期间以及在植物中转录后 基因沉默（PTGS)期间产生的21-25nt短干扰RNA(SiRNA)类似，并且可能整合进与在RNAi 情况中观察到的复合物类似或相同的RNA-诱导的沉默复合物（RISC)内。
[0112] 术语"基因座"一般是指携带一个基因或可能两个或更多个基因的基因限定的染 色体区域，所述两个或更多个基因的连接如此紧密，以至于它们遗传上表现为引起某种表 型的单个基因座。当本文用于Fea4时，"Fea4基因座"应是指携带Fea4基因（包括它的相 关联调控序列）的染色体的限定区域。
[0113] "基因"应是指基因座内的特定基因编码区，包括它的相关联调控序列。本领域的 普通技术人员应当理解，相关联的调控序列将在距Fea4编码序列约4kb的距离内，具有启 动子定位的上游。
[0114] "种质"指个体（例如一个植物）、一组个体（例如一个植物品系、品种或家族）、或 来源于一个品系、品种、物种、或培养物的克隆的或从其中得到的遗传物质。种质可为生物 或细胞的部分，或可从生物或细胞中分离得到。种质通常提供遗传物质与特异性分子构成， 该分子构成提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传性状的物理基础。如本文所用，种质 包括可从中生长出新植物的细胞、种子或组织，或植物部分如叶、茎、花粉、或细胞，它们能 够被培养成整个植物。
[0115] 序列比对和百分比同一性可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这 些方法包括但不限于LASERGENE?生物信息计算包（DNASTAR? Inc.，Madis〇n，Wl) 的Megalign:R程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal W比对方法。
[0116] Clustal W 比对方法（描述于 Higgins 和 Sharp，CABI0S. 5 :151-153(1989); Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8 :189-191(1992))可见于 L.ASERGIZN1E、i! 生物信息学计算软件包（DNASTAR? Inc.，Madison，Wis.)的 MegAlign?V6· 1 程序。 用于多重比对的默认参数对应于GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 0. 2, Delay Divergent Sequences = 30%,DNA Transition Weight = 0. 5,Protein Weight Matrix = Gonnet系列，DNA Weight Matrix = IUB。用于成对比对的默认参数是比对方式=缓慢-准 确（SloW-Accurate)，Gap Penalty = 10. 0, Gap Length = 0· 10, Protein Weight Matrix =Gonnet 250 和 DNA Weight Matrix = IUB。
[0117] 用Clustal W程序比对序列后，可以通过查看同一程序中的"序列距离"表来获得 "百分比同一性"和"趋异"值；除非另外说明，本文提供的和申明的百分比同一性和趋异度 是以该方式计算的。
[0118] 本发明包括如下分离的多核苷酸和多肽：
[0119] 分离的多核苷酸，其包含：⑴编码多肽的核酸序列，基于Clustal W比对方法，所 述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO :3、6、9、12、14或16进行比较时具有至少50%、 51 %,52 %,53 %,54 %,55 %,56 %,57 %,58 %,59 %,60 %,61 %,62 %,63 %,64 %,65 %, 66 %,67 %,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %,73 %,74 %,75 %,76 %,77 %,78 %,79 %,80 %, 81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %, 96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或（^)(1)的核酸序列的全长互补序列，其 中所述全长互补序列和（i)的核酸序列由相同数目的核苷酸组成，并且是100%互补的。任 一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体（包括抑制DNA构建体）。所 述多肽优选地为FEA4多肽。所述多肽优选地具有FEA4活性。
[0120] 分离的多肽，基于Clustal W比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO :3、6、9、12、14 或 16 进行比较时具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、 58 %,59 %,60 %,61 %,62 %,63 %,64 %,65 %,66 %,67 %,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %, 73 %,74 %,75 %,76 %,77 %,78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %, 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序列同一 性。所述多肽优选地为FEA4多肽。所述多肽优选地具有FEA4活性。
[0121] 分离的多核苷酸，其包含：⑴基于Clustal W比对方法，在与SEQ ID NO :1、2、4、 5、7、8、10、11、13或15进行比较时具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、 58 %,59 %,60 %,61 %,62 %,63 %,64 %,65 %,66 %,67 %,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %, 73 %,74 %,75 %,76 %,77 %,78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %, 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序列同一 性的核酸序列；或（ii) (i)的核酸序列的全长互补序列。任一上述分离的多核苷酸可用于 本发明的任何重组DNA构建体（包括抑制DNA构建体）。所述多肽优选地为FEA4多肽。所 述多肽优选地具有FEA4活性。
[0122] 分离的多核苷酸包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够在严格条件下与包含 SEQIDN0:1、2、4、5、7、8、10、11、13或15的全长互补序列的DNA分子杂交。所述多肽优选 地为FEA4多肽。所述多肽优选地具有FEA4活性。
[0123] 分离的多核苷酸包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通过选自下列的至少一种 方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ ID N0:l、2、4、5、7、8、10、ll、13或15:缺失、替 换、添加和插入。所述多肽优选地为FEA4多肽。所述多肽优选地具有FEA4活性。
[0124] 分离的多核苷酸包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列对应于SEQ ID NO :1、2、4、 5、7、8、10、11、13或15的等位基因。
[0125] 在一个实施例中，本发明包括重组DNA构建体（包括抑制DNA构建体）。重组DNA 构建体（包括抑制DNA构建体）可包含本发明的多核苷酸，其以有义或反义取向可操作地 连接至至少一个调控序列（例如在植物中有功能的启动子）。多核苷酸可包含SEQ ID NO: 1、2、4、5、7、8、10、11、13或15的100、200、300、400、500、600、700、800、900或 1000个连续的 核苷酸。多核苷酸可编码本发明的多肽。
[0126] 本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献 中有更全面的描述：Sambrook，J·，Fritsch，E.F.和 Maniatis，T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual ;CoId Spring Harbor Laboratory Press ：Cold Spring Harbor， 1989 (下文称为 "Sambrook"）。
[0127] 本领域内的技术人员应当很好地理解，不同的启动子可在不同的组织或细胞类型 中，或在不同的发育阶段，或响应不同的环境条件而引导基因的表达。
[0128] 可用于本发明的启动子包括但不限于茎端分生组织特异性的启动子和茎端分生 组织优选的启动子。玉米knottedl启动子和来自已知在玉米SAM中表达的基因的启动子可 用于表达本发明公开的多核苷酸。此类基因的例子包括但不限于Zm phabulosa、terminal earKrough sheath2、rolled leaf!、zybl4、narrow sheath (Ohtsu, K.等人，（2007)Plant Journal 52,391-404)。来自其它物种的这些基因的直系同源物的启动子也可用于本发明。
[0129] 来自SAM优选表达的基因的拟南芥启动子的例子包括但不限于clv3、 aintegumenta-like (ail5、ail6、 和 ail7)和 terminal ear likel、clavatal、wus、 shootmeristemless、terminal flower I (Yadav 等人，(2009) Proc Natl Acad Sci USA. March 24)〇
[0130] PCT公开WO 2004/071467和美国专利7, 129, 089描述通过以独特组合将单个启动 子、基因和转录终止子连接在一起来合成多个启动子/基因/终止子盒组合。一般来讲，侧 接合适启动子的NotI位点用于克隆期望基因。可使用PCR扩增，用经设计用于在基因5' 和3'端处引入NotI位点的寡核苷酸将NotI位点加到受关注的基因上。然后用NotI消化 所得PCR产物，并将其克隆到合适的启动子/NotI/终止子盒中。虽然将基因克隆进表达盒 常利用NotI限制性酶完成，本领域技术人员可认识到能够利用多种限制性酶获得期望的 盒。另外，本领域技术人员将会知道可利用其它克隆技术，包括但不限于基于PCR的或基于 重组的技术生成合适的表达盒。
[0131] 此外，WO 2004/071467和美国专利7, 129, 089描述了为了获得所需表型表达，还 将单个启动子/基因/转录终止子盒与合适的选择性标记盒以独特组合和取向连接到一 起。虽然这主要使用不同的限制性酶位点来完成，但本领域的技术人员可认识到可利用多 种技术来获得所需的启动子/基因/转录终止子组合或取向。这样做可获得茎端分生组织 特异性的启动子/基因/转录终止子盒的任何组合和取向。本领域的技术人员还可认识到 这些盒可位于单个DNA片段上或在多个片段上，该处基因共表达是多个DNA片段共转化的 结果。
[0132] fasciated ear4 (fea4)以前称为 feal905 (Pautler 等人，摘要来自第 52 届 Annual Maize Genetics Conference ;2010 年 3 月 18-21 日，Trento, Italy)，是一种新的玉米带化 穗突变体。在这种突变体中的主要缺陷是带化的穗和增厚的雄穗，这是由于增大的花序分 生组织导致。附加的生殖表型包括长雄穗分枝数的降低。营养表型如半矮杆和较短的、较 宽的叶片可存在于某些环境条件下，例如短日照。
[0133] 术语"带化"来自拉丁文fascis，意指束（带），描述由增生引起的植物外形的变 化。
[0134] 术语"野生型fea4基因"、"fea4wt基因"、"Fea4基因"和"FEA4基因"本文互换使 用。
[0135] 通过筛选EMS诱变的自交玉米群体以获取具有带化穗的突变体，发现了 fea4。突 变的遗传背景是A619自交系，但是表型在渐渗到多个其它自交系时也是不同的。
[0136] fea4通过基因分型来自F2作图群体的大约500个突变体对染色体6的长臂作图。 给一个候选基因测序，该基因编码432个氨基酸的bZIP类转录因子，揭示了 C至T的碱基 转变，产生提前终止密码子。C至T(G至A)的突变是用EMS进行化学诱变的结果。鉴定了 具有终止密码子的第二等位基因 fea4-rel*09-5171，证实已经分离了正确的基因。
[0137] FEA4是拟南芥基因 PERIANTHIA(PAN)直系同源的，其具有花器官数方面的缺陷。 pan突变体在外轮中具有五个花瓣和五个萼片，而不是四个（Running，MP，Meyerowitz， EM. 1996Development 122 :1261-9 ;Chuang，C.等人，1999Genes and Development 13: 333-344)。当在短日照条件下生长时（大约8小时光照，以及16小时黑暗），pan突变体 展示不确定的花分生组织，导致产生多个异常的花器官（Maier，A.等人，2009Development 136 :1613-1620)〇
[0138] FEA4在未成熟的穗和雄穗原基中根据RNA-seq转录学图谱表达。该表达在穗顶 端（花序分生组织）最高并且在穗的中部和基部降低。此外，表达随着雄穗原基的尺寸增 加（2-7mm)而降低。
[0139] 我们对于fea2/fea4双突变体的分析表明fea4可与CLAVATA2/WUSCHEL途径平行 作用。
[0140] 具有fea4突变的植物，其中该突变导致Fea4功能的丧失或Fea4表达的消除，也 称为" fea4植物"或" fea4无效植物"。" fea4无效植物"表现出" fea4表型"或" fea4无 效表型"。fea4植物在花序和花梗发育期间发育出较大的分生组织，并且穗花序分生组织显 示严重的带化，表明Fea4通常用于限制这些分生组织的生长。
[0141] 具有弱fea4突变的植物，其中该突变导致Fea4功能的部分丧失或Fea4表达的部 分消除，也称为"具有弱fea4表型的fea4植物"。"弱fea4植物"表现出"弱fea4表型"。具 有弱fea4等位基因的fea4植物表现出与fea4无效植物相似、但是程度更低的表型。具有 弱fea4等位基因的fea4植物也可表现出部分fea4无效表型，S卩，可能不表现出全部fea4 无效特性。本文所述的"弱fea4等位基因"是fea4变体或SEQ ID NO :1或2的变体，它们 赋予植物弱fea4表型。
[0142] 具有fea4突变的植物表现出"无效fea4表型"或"弱fea4表型"，本文将该植物 称为具有"突变fea4表型"的植物。
[0143] 如本文所用，术语"显性负突变"是指具有改变的基因产物的突变，该基因产物的 作用拮抗野生型等位基因。这些突变通常导致改变的分子功能（常常是失活的）并且特征 在于"显性负"表型。赋予"显性负表型"的基因变体、突变基因或等位基因将赋予宿主细 胞"无效"或"突变"表型，甚至在野生型等位基因的存在下依然如此。
[0144] 如本文所用，具有"FEA4活性"的多肽（或多核苷酸）是指当在"fea4突变系"中 表达时，表现出"fea4突变体表型"的多肽（或多核苷酸），其能够部分或完全拯救fea4突 变体表型。
[0145] 术语"基因改组"和"定向进化"本文互换使用。"基因改组"方法包括反复进行DNA 改组，然后通过适当的筛选和/或选择以生成具有改变的生物活性的Fea4核酸变体或其部 分（Castle 等人，（2004) Science 304(5674) :1151-4 ;美国专利 5,811,238 和 6, 395, 547)。
[0146] "TILLING"或"定向诱导基因组局部突变（Targeting Induced Local Lesions IN Genomics) "是指一种诱变技术，其用于产生和/或鉴定、并且最终分离具有调控表达和/ 或活性的特定核酸的诱变变体（McCallum等人，（2000)，Plant Physiology 123 :439-442 ; McCallum等人，（2000)Nature Biotechnology 18 :455-457 ;和 Colbert 等人，（2001)Plant Physiology 126 :480-484)〇
[0147] TILLING组合高密度点突变，快速灵敏地检测突变。通常使用甲磺酸乙酯（EMS)诱 变植物种子。EMS烷基化乌嘌呤，这通常导致错配。例如，将种子浸泡在约10-20mM的EMS 溶液中约10至20小时；洗涤种子并随后播种。将这一代植物称为Ml。Ml植物随后自体繁 殖。存在于形成生殖组织的细胞中的突变被下一代继承（M2)。通常筛选M2植物以获得期 望基因和/或特定表型的突变。
[0148] TILLING也允许选择携带突变体的植物。这些突变体可表现出在强度或位置 或时间上改变的表达（如果突变影响例如启动子）。这些突变体甚至可表现出比天然 形式的基因表现出的FEA4活性更低的活性。TILLING组合高密度诱变与高通量筛选方 法。TILLING 中的步骤通常为：（a) EMS 诱变（Redei G P和Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua N H，Schell J 编辑，Singapore，World Scientific Publishing Co,第 16-82 页；Feldmann 等人，（1994) In Meyerowitz E M，Somerville C R 编辑，Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 第 137-172 页；Lightner J 和 Caspar T (1998) In J Martinez-Zapater，J Salinas 编辑， Methods on Molecular Biology，第 82 卷，Humana Press，Totowa，N.J.，第 91-104 页）； (b)DNA制备和个体集合；（c)受关注区域的PCR扩增；(d)变性和退火以允许形成异源双 链核酸分子；（e)DHPLC，其中在集合中存在的异源双链核酸分子在色谱中检测为额外的峰； ⑴鉴定单个突变体；以及（g)对突变PCR产物测序。TILLING方法是本领域为人们所熟知 的（美国专利US8, 071，840)。
[0149] 也可使用其它突变方法以将突变引入Fea4基因。用于将基因突变引入植物基因 并选择具有期望性状的植物的方法是熟知的。例如，种子或其它植物材料可根据标准技术 用突变化学物质处理。此类化学物质包括但不限于以下物质：硫酸二乙酯、乙烯亚胺、和 N-亚硝基-N-乙基脲。作为另外一种选择，可利用电离辐射，其来自辐射源如X-射线或γ 射线。
[0150] 可使用用于检测Fea4基因中的突变的其它检测方法，例如毛细管电泳（例 如恒定变性毛细管电泳和单链构象多态性）。又如，可利用错配修复酶学检测异源双 链核酸分子（例如来自芹菜的CELI内切核酸酶）。CELI识别错配并精确地切开错 配的3'侧。错配的精确碱基位点可通过用错配修复酶切割，随后进行例如变性凝 胶电泳来确定。参见例如 Oleykowski 等人，（1998) "Mutation detection using a novel plant endonuclease"Nucleic Acid Res。26:4597-4602;以及Colbert 等人， (2001) "High-Throughput Screening for Induced Point MurationsT3Iant Physiology 126 :480-484。
[0151] 包含突变fea4基因的植物可与其它植物杂交以将突变引入另一个植物。这可使 用标准育种技术完成。
[0152] 同源重组允许将选择的核酸在限定的选择位点引入基因组。同源重组已经在 植物中展不。参见例如 Puchta 等人，（1994)，Experientia 50 :277-284 ;SWoboda 等 人，（1994)，EMBO J. 13 :484-489 ;0ffringa 等人，（1993)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 : 7346-7350 ;Kempin 等人，（1997)Nature 389 :802-803 ;以及 Terada 等人，（2002)Nature Biotechnology，20(10) :1030-1034)〇
[0153] 用于在植物中进行同源重组的方法已经不仅对模型植物进行了描述（Offringa 等人，（1990)EMB0 J. October ;9 (10) :3077-84)，而且对作物植物例如稻进行了描述 (Terada R，Urawa H，Inagaki Y，Tsugane K，Iida S. Nat Biotechnol. 2002 ;Iida 和 Terada :Curr Opin Biotechnol. 2004 年 4 月；15 (2) :1328)。靶向核酸（其可为如前文所 定义的FEA4核酸或其变体）不需要分别靶向FEA4基因的基因座，但是可被引入例如高表 达区。靶向核酸可为弱fea4等位基因或显性负等位基因，它们用于替换内源基因或此外可 被引入内源基因。
[0154] 转座元件可基于它们的转座模式归类为两大类。这些称为I类和II类；它们均 具有作为诱变剂和递送载体的用途。I类转座元件通过RNA中间体转座并利用反转录酶， 即，它们是逆转录因子。存在至少三种类型的I类转座元件，例如反转录转座子、反座子、 SINE样元件。反转录转座子通常含有LTR、和编码病毒外壳蛋白质（gag)与逆转录酶的基 因、RnaseH、整合酶和聚合酶（pol)基因。已经描述了植物物种中的多个反转录转座子。此 类反转录转座子经由RNA中间体在由转座子编码的逆转录酶和RNA酶H催化的反应中移动 和易位。例子分成Tyl-copia和Ty3_gypsy组以及分成SINE样和LINE样类别（Kumar和 Bennetzen(1999)Annual Review of Genetics 33:479)。此外，DNA 转座元件如 Ac、Taml 和En/Spm也存在于广泛多种植物种类中，并且可在本发明中利用。转座子（和IS元件） 是用于将突变引入植物细胞的常见工具。
[0155] 植物构造由分生活性的精确控制而决定。正或负维持信号的不平衡可导致带化分 生组织表型。fea4是具有由于极度增大的花序分生组织导致的带化穗的和雄穗的半矮杆 突变体。营养分生组织的尺寸也增大，导致突变体的高度减小以及其它营养阶段缺陷。我 们将fea4对包含大约30个基因的染色体6的2. 7Mbp区域作图。在这个区间中的bZIP转 录因子包含在参考等位基因中EMS诱导的提前终止密码子。初始鉴定为ram〇sa2修饰基因 的第二等位基因也包含提前终止密码子，证实了该基因的同一性。随后，我们从EMS和转座 子诱变库中分离了附加的等位基因。系统发育分析表明Fea4与拟南芥基因 PERIANTHIA直 系同源，该基因具有类似的，但是严重程度较低的功能丧失表型。我们进行原位杂交以确定 Fea4在发育的不同阶段的表达模式。在营养阶段，Fea4在SAM的周边区域以及不成熟叶片 的脉管系统中特异性表达。Fea4明显地不存在于SAM顶端的干细胞巢中，不存在于初生叶 原基（PO)中，并且在PO下的域中大量富集。这种周边区域表达模式存在于检查的各个胚 期中，并且持续直至SAM发生花转换。在转换至繁殖期后，Fea4在雄穗和穗的整个花序分 生组织中表达，并且也在小穗对、小穗、和花分生组织中表达。类似于在SAM中观察到的模 式，Fea4在生殖分生组织中的初始后来器官形成位点处下调。YFP-FEA4翻译融合蛋白质在 天然Fea4启动子控制下的表达重演了原位杂交观察到的表达模式。在被检查分生组织从 胚到花序的所有阶段观察到、并且还在围绕SAM的幼叶中检测到强的核表达。我们已经通 过RNA-seq转录学图谱描绘出在突变体的Imm穗中相对于野生型的转录变化，并且正在开 始探宄潜在的目标。遗传分析表明Fea4功能平行于fea2_tdl (CLAVATA)途径，说明它定义 一种在分生组织尺寸调节中的新途径。
[0156] 实施例:
[0157] 在一个实施例中，可用于本发明方法的fea4变体是一种或多种以下FEA4核酸变 体：⑴Fea4核酸序列（SEQ ID NO :1或2)的部分；（ii)能够与Fea4核酸序列（SEQ ID NO : 1或2)杂交的核酸序列；（iii)Fea4核酸序列（SEQ ID NO :1或2)的拼接变体；（iv)Fea4 核酸序列（SEQ ID NO :1或2)的天然存在的等位基因变体；（V)通过基因改组获取的fea4 核酸序列；（vi)通过定点诱变获取的fea4核酸序列；（vii)通过TILLING方法获取并鉴定 的fea4变体。
[0158] 在一个实施例中，内源Fea4的表达水平可在植物细胞中通过反义构建体、有义构 建体、RNA沉默构建体、RNA干涉作用、人工小RNA和基因组缺失而降低。基因组缺失的例子 包括但不限于转座子、tilling、同源重组诱导的缺失。
[0159] 在一个实施例中，可使用经修饰的植物miRNA前体，其中该前体已经经修饰以用 设计用于产生指向Fea4的miRNA的序列替换miRNA编码区；前体也在主链序列中进行修饰 以响应miRNA编码区中的改变。
[0160] 在一个实施例中，在本发明方法中使用的Fea4核酸变体是通过基因改组获取的 核酸变体。
[0161] 在一个实施例中，也可利用TILLING(定向诱导基因组局部突变）将基因修饰引入 玉米Fea4基因的基因座。
[0162] 在一个实施例中，可利用定点诱变生成Fea4核酸的变体。可利用多种方法实现定 点诱变；最常用的方法是基于PCR的方法（美国专利7956240)。
[0163] 在一个实施例中，也可利用同源重组失活或降低内源Fea4基因在植物中的表达。
[0164] 同源重组可通过特定靶向体内的Fea4基因用于诱导定向基因修饰。体外制备在 fea4基因序列（例如本文提供的那些）的选择部分（包括5'上游、3'下游、和基因间区） 中的突变并且利用标准技术将它们引入期望的植物。在引入的突变fea4基因和目标内源 FEA4基因之间的同源重组将导致转基因植物中野生型基因的定向取代，导致Fea4表达或 活性的抑制。
[0165] 在一个实施例中，催化RNA分子或核糖酶也可用于抑制FEA4基因的表达。设计特 定地与事实上的任何目标RNA配对并在特定位置裂解磷酸双酯骨架，从而功能上失活目标 RNA的核糖酶是可能的。在进行这种裂解时，核糖酶不发生自体改变，并且因此能够循环利 用并裂解其它分子。在反义RNA中包括核糖酶序列赋予它们RNA裂解活性，从而提高构建体 的活性。已经鉴定了多类核糖酶。例如，一类核糖酶来源于多个小的环形RNA，它们能够自 体裂解并在植物中复制。该RNA能够单独复制（类病毒RNA)或用辅助病毒（卫星RNA)复 制。RNA的例子包括来自鳄梨日斑病类病毒的RNA和来自烟草环斑病毒、紫花苜蓿暂时性线 条病毒、绒毛烟斑驳病毒、茛菪斑驳病毒和地三叶草斑驳病毒的卫星RNA。已经描述了目标 RNA特异性核糖酶的设计和使用。参见例如Haseloff等人，（1988) Nature，334 :585-591。
[0166] 用于失活Fea4基因的另一种方法是通过抑制表达的有义抑制。引入其中相对 于启动子以有义取向配置的核酸的表达盒已经显示为一种用于阻止期望靶基因转录的 有效方法（Napoli 等人，（1990)，The Plant Cell2 :279-289;和美国专利US5034323、 US5231020、和 US5283184)。
[0167] 在一个实施例中，Fea4基因也可通过例如基于转座子的基因失活而被失活。
[0168] 在一个实施例中，失活步骤包括在Fea4基因序列中制造一个或多个突变，其中在 Fea4基因序列中的一个或多个突变包括一个或多个转座子插入，从而与相应的对照植物相 比失活Fea4基因。例如，该突变可包括在Fea4基因中的纯合缺失，或一个或多个突变包括 在Fea4基因中的杂合缺失。
[0169] 将这些可移动的遗传因子例如通过有性杂交递送至细胞，选择转座并且筛选所得 插入突变体，例如用于获得所关注的表型。包含缺失Fea4基因的植物可与野生型植物杂 交。取决于将进行杂交的物种，可使用多种标准育种技术中的任何一种。在分离或重组植 物的基因组中的TN(转座子）位置可通过已知方法来确定，例如如本文所述的侧接区域测 序。例如，植物的PCR反应可用于扩增序列，其随后可进行诊断测序以确认它的起源。任选 地，筛选插入突变体以获得期望的表型，例如抑制Fea4的表达或活性，或改变农学特性。 [0170]
[0171] 本发明将在下面的实例中进一步说明，其中份数和百分比是以重量计并且度数是 摄氏度，除非另外说明。应该理解，尽管这些实例说明了本发明的实施例，但仅是以例证的 方式给出的。根据上面的论述和这些实例，本领域的技术人员能够确定本发明的基本特征， 并且在不脱离其实质和范围的情况下，能够对本发明做出各种变化和修改以使其适用于各 种用法和条件。此外，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种 修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在涵盖于所附权利 要求书的范围内。
[0172] 实例 1
[0173] 克降玉米fea4基因
[0174] fea4-0等位基因在EMS诱变的A619自交群体的M2筛选中被发现。
[0175] 两个F2作图群体通过杂交fea4_0(A619)与B73和W23自交系而形成。突变定位 至2. 7Mbp的区域（图1A)，其包含大约30个注释基因。在这个区域中的候选基于它在发育 的穗原基中的表达进行选择。对候选bZIP转录因子的测序揭示EMS诱导的（C至T)的转 变，产生提前终止密码子（图1B)。第二等位基因 fea4-rel*09-5171也包含提前终止密码 子，证实了该基因的同一性。随后，获取在FEA4中的11个TUSC插入突变体，它们当前是显 型的。两个终止密码子位于bZIP域之后，但是在两个富含谷氨酰胺的区域之前（图1C)。 这些C-末端基序已经显示对于通过谷氧还蛋白调节TGA-类bZIP蛋白质来说是重要的。
[0176] 实例 2
[0177] 玉米突夺体fea4表塑
[0178] fea4是半矮杆隐性突变体，具有显著带化的穗和雄穗。营养表型包括较短的、较 宽的叶片和减小的植物高度（图2A)。这关联茎端分生组织（SAM)?33%的尺寸增加。在 繁殖转换后，fea4突变体生成厚的雄穗与提高的小穗密度以及增加的花序轴直径（图2B)。 突变体产生难以置信的带化穗，其比野生型更短并且更无组织（图2C)。未成熟穗的SEM分 析揭示主要缺陷是极度增大的花序分生组织（图2D)，而较高次序的繁殖分生组织看起来 不受影响。图2E示出具有紧凑锥形的花序分生组织的野生型穗（比例尺=Imm)。
[0179] 实例 3
[0180] 在分牛组织尺寸和分牛组织确宙件之间的相互作用
[0181] fea4的两个等位基因来自ramosa2 (ra2)修饰基因筛选。分离F2群体（图3A)显 示ra2抑制fea4的带化表型并导致穗花序分生组织的重复分枝或分枝。
[0182] 图3B不出fea4和ramosal的双突变体。Ramosal看起来抑制fea4,表明fea4作 用于这个小穗对分生组织确定性的决定者的上游。
[0183] fea4和ramosa3的双突变体看起来是完全叠加的，指示这些因子可以独立的途径 作用（图3C)。
[0184] 实例 4
[0185] ffea2/fea4双突夺体分析
[0186] fea4和CLAVATA2直系同源物的双突变体展示在繁殖（图4A)和营养发育（图4B) 中的协同缺陷。这可解释为意指fea4功能平行于干细胞巢控制途径，可能位于中心区域之 外。
[0187] 实例 5
[0188] fea4基因的表达分析
[0189] 我们进行原位杂交以确定Fea4在发育的不同阶段的表达模式。在营养阶段，Fea4 在SAM的周边区域以及不成熟叶片的脉管系统中特异性表达。Fea4明显地不存在于SAM 顶端的干细胞巢中，不存在于初生叶原基（PO)中，并且在PO下的域中大量富集。这种周边 区域表达模式存在于检查的各个胚期中，并且持续直至SAM发生花转换。在转换至繁殖期 后，Fea4在雄穗和穗的整个花序分生组织中表达，并且也在小穗对、小穗、和花分生组织中 表达。类似于在SAM中观察到的模式，Fea4在生殖分生组织中的初始后来器官形成位点处 下调。
[0190] 实例 6
[0191] 从FEA4启动子表汰昔色荧光融合蛋白质
[0192] 制备重组DNA构建体以允许体内定位FEA4,其已经用黄色荧光蛋白质（YFP)进行 了标记。构建体以5'至3'的取向包含以下元件：1)FEA4启动子；2)YFP-FEA4融合蛋白质 编码区；和3)FEA43'UTR。产生包含这种重组DNA构建体的转基因玉米植物。YFP-FEA4翻 译融合蛋白质在天然启动子控制下的表达重演了原位杂交观察到的表达模式。在被检查分 生组织从胚到花序的所有阶段观察到、并且还在围绕SAM的幼叶中检测到强的核表达。
[0193] 实例 7
[0194] 在fea4棺物中降低的雄蕊数
[0195] 分析花器官在A619背景下的fea4突变体植物。计算在fea4突变体的50个小花 中和在野生型A619亲缘种的50个小花中的花器官数（雄蕊）。在野生型样本中100%的 小花包含3个雄蕊，而23%的突变体小花仅包含2个雄蕊（图6A-图6D)。
[0196] 实例 8
[0197] YFP-FEA4融合构律体榇救fea4突夺体
[0198] 为了检查FEA4蛋白质产物的亚细胞和组织水平上的定位，构建翻译融合物，其包 含在天然启动子控制下融合到FEA4编码序列上的黄色荧光蛋白质（YFP)。构建体以5'至 3'的取向包含以下元件：1)FEA4启动子；2)YFP-FEA4融合蛋白质编码区；和3)FEA43'UTR。 将这个构建体转化到HiII自交玉米背景中，并且回交到fea4突变体中两次以评估互补。这 个转基因的存在足以拯救在两个独立事件中的突变体表型，指示融合蛋白质在植物中的功 能（η =在分离家族中的40个植物）。这个实验提供了对引起突变体表型的基因同一性的 独立确认。它也确认Ikb启动子和下游的UTR序列驱动在所需域中的表达。另外，这个实 验显示YFP标记不干扰FEA4蛋白质的功能。
[0199] 实例 9
[0200] fea4和fea2协同相互作用以棹制分牛组织尺寸
[0201] 分离 fea4 和 fasicated ear2 (fea2)形成 F2 群体；fea2 是 CLAVATA2 的玉米直系 同源物。双突变体展示在营养和繁殖结构中广泛的协同表型。
[0202] 为了定量基因相互作用，我们基因分型来自分离家族的植物，并且测量茎端分生 组织（SAM)在种植后14天时的尺寸。SAM尺寸在fea2和fea4单突变体中相对于野生型增 加大约30%，并且在fea2/fea4双突变体中增加122%。结果示于表1中。
[0203] 表 1
[0204]
[0205] 实例 10

【权利要求】
1. 一种产生具有下降的内源Fea4表达的转基因植物的方法，所述方法包括： a. 将重组构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组构建体包含可操作地连接至启 动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列的表达降低内源Fea4的表达； b. 在步骤（a)之后，由所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及 c. 选择（b)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组构建体且在与不包含所 述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出下降的Fea4表达。
2. -种产生具有下降的内源Fea4表达的转基因植物的方法，所述方法包括： a. 将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含以有义或 反义取向可操作地连接至在植物中有功能的启动子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸 包含： i. SEQ ID NO :1或2的核苷酸序列； ii基于Clustal W比对方法，在与SEQ ID NO :1或2进行比较时具有至少90 %的序列 同一性的核苷酸序列； iii. SEQ ID NO :1或2的至少100个连续的核苷酸的核苷酸序列； iv. 能够在严格条件下与（i)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或 V.经修饰的植物miRNA前体，其中所述前体已经经修饰以用设计用于产生指向SEQ ID NO :1或2的miRNA的序列替换所述miRNA编码区； b. 在步骤（a)之后，使转基因植物细胞再生，其中所述转基因植物在其基因组中包含 所述重组DNA构建体；以及 c. 选择（b)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体且在与不包 含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出下降的Fea4表达。
3. -种产生具有改变的农学特性的转基因植物的方法，所述方法包括： a. 将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地 连接至至少一个调控序列的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽的片段或变体， 基于Clustal W比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO :3进行比较时具有 至少80%的序列同一性，其中所述片段或所述变体赋予在所述可再生的植物细胞中的显性 负表型； b. 在步骤（a)之后，由所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及 c. 选择（b)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体且在与不包 含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种选自下列的农学特性的改 变：穗分生组织尺寸、籽粒行数、叶数、花序数、在所述花序内的分枝、花数、果实数、种子数、 植物高度、生物量和产量。
4. 一种鉴定fea4的弱等位基因的方法，所述方法包括以下步骤： a. 对突变体玉米植物的群体进行基因筛选； b. 鉴定表现出比fea4无效植物更弱的fea4表型的一个或多个突变体玉米植物；以及 c. 从所述具有更弱的fea4表型的突变体玉米植物中鉴定所述弱fea4等位基因。
5. -种鉴定fea4的弱等位基因的方法，所述方法包括以下步骤： a. 使用编码SEQ ID NO :3、或与SEQ ID NO :3至少70%相同的蛋白质、或其片段的一 种或多种核苷酸序列进行基因改组； b. 将来自步骤（a)的经改组的序列转化到可再生的植物细胞的群体中； c. 由步骤（b)的经转化的可再生的植物细胞的群体再生出经转化的植物的群体； d. 针对弱fea4表型，筛选来自步骤（c)的经转化的植物的群体；以及 e. 从所述表现出弱fea4表型的经转化的植物中鉴定所述弱fea4等位基因。
6. -种植物，其中所述内源Fea4基因的表达相对于对照植物是降低的。
7. -种植物，所述植物相对于野生型植物表现出弱fea4表型。
8. -种制备权利要求6所述的植物的方法，所述方法包括以下步骤： a. 向所述内源Fea4基因中引入突变；以及 b. 检测所述突变。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中步骤（a)和（b)是使用定向诱导基因组局部突变 (TILLING)方法来完成的，并且其中所述突变对于降低所述内源Fea4基因的表达或其活性 是有效的。
10. 根据权利要求8或9所述的方法，其中所述突变是位点特异性突变。
11. 一种制备权利要求6所述的植物的方法，其中所述方法包括以下步骤： a. 将转座子引入到包含内源Fea4基因的种质中； b. 获取步骤（a)的种质的子代；以及 c. 鉴定步骤（b)的子代植物，其中所述转座子已经插入到所述内源Fea4基因，并且观 察到Fea4表达的降低。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中步骤（a)还包括通过转化来将所述转座子引入 到所述种质的可再生的植物细胞中以及由所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中 所述转基因植物在其基因组中包含所述转座子。
13. 根据权利要求4或5所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤： i.将重组构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组构建体包含通过权利要求4或 5所述的方法鉴定的弱fea4等位基因； ii在步骤（i)之后，由所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及 iii.选择（ii)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体且在与不 包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出弱fea4表型。
14. 根据权利要求2或3所述的方法，其中部分（a)的多肽在具有所述fea4突变体基 因型的植物品系中的表达能够部分或全部恢复所述野生型表型。
15. -种产生具有改变的农学特性的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤： a.将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含以有义或 反义取向可操作地连接至在植物中有功能的启动子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸 包含： i. SEQ ID NO :1或2的核苷酸序列； ii基于Clustal W比对方法，在与SEQ ID NO :1或2进行比较时具有至少90%的序列 同一性的核苷酸序列； iii. SEQ ID NO :1或2的至少100个连续的核苷酸的核苷酸序列； iv. 能够在严格条件下与（i)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或 V.经修饰的植物miRNA前体，其中所述前体已经经修饰以用设计用于产生指向SEQ ID NO :1或2的miRNA的序列替换所述miRNA编码区； b. 在步骤（a)之后，由所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及 c. 选择（b)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体且在与不包 含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种选自下列的农学特性的改 变：增大的穗分生组织、籽粒行数、种子数、植物高度、生物量和产量。
16. 根据权利要求1-5或8-15中任一项所述的方法，其中所述植物选自：拟南芥、番 茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘鹿和柳枝稷。
17. -种植物，所述植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含 以有义或反义取向或以上两种取向可操作地连接至在植物中有功能的启动子的分离的多 核苷酸，其中所述多核苷酸包含： a. SEQ ID NO :1或2的核苷酸序列； b. 基于Clustal W比对方法，在与SEQ ID NO :1或2进行比较时具有至少90%的序列 同一性的核苷酸序列； c. 能够在严格条件下与（a)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或 d. 经修饰的植物miRNA前体，其中所述前体已经经修饰以用设计用于产生指向SEQ ID NO :1或2的miRNA的序列替换所述miRNA编码区；并且 其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一 种选自下列的农学特性的改变：增大的穗分生组织、籽粒行数、种子数、植物高度、生物量和 产量。
18. 根据权利要求17所述的植物，其中所述植物选自：拟南芥、番茄、玉米、大豆、向日 葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
19. 权利要求17或权利要求18所述的植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重 组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含以有义或反义取向可操作地连接至在植物中有功 能的启动子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含： a. SEQ ID NO :1或2的核苷酸序列； b. 基于Clustal W比对方法，在与SEQ ID NO :1或2进行比较时具有至少90%的序列 同一性的核苷酸序列； c. SEQ ID NO :1或2的至少100个连续的核苷酸的核苷酸序列；或 d. 经修饰的植物miRNA前体，其中所述前体已经经修饰以用设计用于产生指向SEQ ID NO :1或2的miRNA的序列替换所述miRNA编码区；并且 其中由所述种子产生的植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时 表现出至少一种选自下列的农学特性的改变：增大的穗分生组织、籽粒行数、种子数、植物 高度、生物量和产量。
20. -种在植物中表达异源多核苷酸的方法，所述方法包括： a.用重组DNA构建体转化可再生的植物细胞，所述重组DNA构建体包含可操作地连接 至第二多核苷酸的异源多核苷酸，其中所述第二多核苷酸是Fea4启动子； b. 在步骤（a)之后，由所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及 c. 选择（b)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体，并且进一步 地，其中所述异源多核苷酸在所述转基因植物中表达。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述植物选自：拟南芥、番茄、玉米、大豆、向日 葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
22. -种植物，所述植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含 可操作地连接至第二多核苷酸的异源多核苷酸，其中所述第二多核苷酸是Fea4启动子，并 且其中所述异源多核苷酸在所述植物中表达。
23. 根据权利要求22所述的植物，其中所述植物选自：拟南芥、番茄、玉米、大豆、向日 葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
24. 权利要求22或权利要求23所述的植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重 组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至第二多核苷酸的异源多核苷酸，其 中所述第二多核苷酸是Fea4启动子序列，并且其中所述异源多核苷酸在由所述种子产生 的植物中表达。
25. -种鉴定具有至少一种农学特性的改变的第一玉米植物或第一玉米种质的方法， 所述方法包括在所述第一玉米植物或所述第一玉米种质中检测至少一种与所述至少一种 农学特性相关联的标记基因座的多态性，其中所述标记基因座编码多肽，所述多肽包含选 自下列的氨基酸序列：a)与SEQ ID NO :3具有至少90%且小于100%的序列同一性的氨基 酸序列，其中在与对照植物进行比较时，所述多肽在植物或其植物部分中的表达引起至少 一种选自下列的农学特性的改变：穗分生组织尺寸、籽粒行数、花序数、在所述花序内的分 枝、花数、果实数和种子数，其中所述对照植物包含SEQ ID NO :3。
【文档编号】C12N15/82GK104519735SQ201380014054
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年3月14日 优先权日:2012年3月14日
【发明者】M. 艾伦 S., P. 贾克森 D., 科马特苏 M., 保尔特勒 M., 沙凯 H., 沃尔布雷奇特 E., 维克斯 R. 申请人:纳幕尔杜邦公司, 冷泉港实验室, 衣阿华州立大学研究基金公司