调节atxn3表达的组合物和方法

调节atxn3表达的组合物和方法
【专利摘要】公开的是寡核苷酸，其靶向及杂交于编码ATXN3的核酸分子，导致减少的ATXN3的表达。异常ATXN3的表达的减小有益于治疗特定医疗病症，诸如脊髓小脑共济失调3。在特定实施方式中，调节异常ATXN3等位基因或转录物的表达，例如，恢复例如，Purkinje细胞或脊髓神经元的正常功能。本发明的寡核苷酸和使用该寡核苷酸调节异常或伸展的ATXN3的表达的方法提供改善存活和关联于，或甚至治愈，异常ATXN3等位基因或转录物的表达的病态诸如，例如，3型脊髓小脑共济失调(SCA3)的手段。
【专利说明】调节ATXN3表达的组合物和方法
[0001]【相关申请】
[0002] 本申请要求2012年3月12日提交的美国临时申请No. 61/609, 774的优先权及权 益。以上申请的整个教导通过引用并入本文。 【【技术领域】】
[0003] 本申请涉及靶向及杂交于核酸编码蛋白共济蛋白_3(ATXN3)的寡核苷酸及相关 的药物组合物及使用寡核苷酸调节ATXN3的表达以治疗一系列医疗病症，诸如3型脊髓小 脑共济失调（SCA3)的方法。 【【背景技术】】
[0004] 3型脊髓小脑共济失调（SCA3)，其也被称为Machado-Jos印h病，是具有初现和严 重性的变化的年龄的常染色体显性，进行性神经退行性病症。SCA3原本描述于葡萄牙人后 裔，及尤其是来自SCA3最普遍的亚速尔群岛（例如，Flores小岛中SCA3的发生率是1/140) (Sudarsky L.，等人，Clin. Neurosci. 1995 ;3:17-22)。SCA3 随后在几个其他国家被鉴定， 及现在被认为是最常见的显性地遗传的遗传性共济失调。
[0005] 临床上，患SCA3的患者呈现进行性步态和肢共济失调，构音困难和其他症状包括 锥体束征，张力失调,眼球运动病症，面舌虚弱，神经病变，进行性感觉损失和帕金森特征的 可变的组合。以其更严重的形式，SCA3特征在于锥体（例如，运动，躯体感觉）和锥体外 束（例如，肌张力）神经功能的缺陷。在受影响的家族之内，此形式的共济失调也展示预 期效应，其特征在于早先疾病初现和具有各新影响的代的更严重的症状。
[0006] 全部形式的SCA3归因于编码病原性聚-谷氨酰胺区的在染色体14q32. 1上ATXN3 的编码区中的（CAG)n段或翻译的ATXN3蛋白中的段的不稳定和迭代遗传伸展（Kawaguchi Υ·，等人，Nature Genet. 1994 ;8 :221 ?228)。ATXN3 的编码区中（046)"段（及由此编码 的病原性聚-谷氨酰胺段）的不稳定和迭代伸展造成蛋白错折叠的增加，其导致核和细胞 质包裹体聚集和形成（Paulson HL,等人，1997, Neuron 19, 333?344)。错折叠的蛋白聚 集物不仅是SCA3和Machado-Jos印h病的特征，而且也是许多其他神经退行性疾病，包括阿 尔茨海默病和帕金森病的常见的特征。
[0007] 对于治疗SCA3目前可利用的治疗方法被限制于症状性治疗，或主要基于锻炼 及饮食改良的治疗方法。开发对于治疗SCA3适合的治疗剂的尝试中所做的努力靶向了 ATXN3的编码区中的伸展的。但是，在许多实例中，该治疗无法有效抑制编码病 原性聚-谷氨酰胺段的突变的或异常等位基因（相对于功能野生型等位基因）的表达。例 如，国际申请W02008/018795A1和W0/2009/099326A1描述了通过设计互补于异常和野生 型等位基因中的重复子序列，但可优先与表征异常等位基因的更可接近的临时开环结构杂 交的寡核苷酸来靶向异常等位基因或编码聚-谷氨酰胺伸展的转录物的各种手段。类似 地，Hu等人（Nat. Biotechnol. 2009 ;27 (5) :478-484)评价了是否寡聚体可部分基于表征 各等位基因的结构差异来区别野生型和突变等位基因。SCA3的等位基因-特异性沉默已 被Miller等人在小干扰RNA-介导的技术的情景中描述（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003 ; 100(12) :7195-7200)。但是，Miller等人总结出，野生型和突变的等位基因之间的单核苷 酸差异可在此情景中不足以赋予等位基因特异性，除非遇到特定病情。
[0008] 由于患SCA3的患者无目前可利用的治愈法，需要进一步开发以鉴定调节编码 ATXN3的核酸的表达及抑制，抑制，预防或减少包括病原性聚-谷氨酰胺伸展的ATXN3的表 达的新治疗法作为治愈手段，或至少改善人中与SCA3关联的症状，及存活和病态。特别需 要的是能相对于功能野生型等位基因，辨别性地有效靶向编码病原性聚-谷氨酰胺段的突 变的或异常等位基因的新反义治疗法。
[0009] 【发明概述】
[0010] 在本文提供的是新寡核苷酸，特别锁核酸（LNA)反义寡核苷酸，及对于治疗 与异常，突变的或伸展的ATXN3的表达关联的疾病（例如，3型脊髓小脑共济失调或 Machado-Joseph病）有用的治疗性干预。本文公开的发明涉及这样的发现，使表达突变的 或异常ATXN3等位基因的细胞或组织与本发明的寡核苷酸接触调节该ATXN3的表达，及尤 其是调节ATXN3的突变的或天然存在的变体（例如，被表征为具有病原性，伸展的聚-谷 氨酰胺段的ATXN3)的表达。在特定实施方式中，调节异常ATXN3等位基因或转录物的表达， 例如，恢复例如，Purkinje细胞或脊髓神经元的正常功能。本发明的寡核苷酸和使用该寡 核苷酸调节异常或伸展的ATXN3的表达的方法提供改善存活和关联于，或甚至治愈，异常 ATXN3等位基因或转录物的表达的病态诸如，例如，3型脊髓小脑共济失调（SCA3)的手段。 在特定实施方式中，本发明的寡核苷酸，当施用于患SCA3的受试者时，导致SCA3症状的改 善或消退（例如，步态和肢共济失调，构音困难，锥体束征，张力失调，眼球运动病症， 面舌虚弱，神经病变，进行性感觉损失，昏睡和帕金森特征的改善）。
[0011] 一方面，本文公开的发明涉及与ATXN3靶序列（例如，哺乳动物ATXN3或由此编 码的mRNA序列）杂交的约8?约50个核苷酸长的寡核苷酸。在特定方面，该寡核苷酸与 具有足够的稳定性（例如，具有足够的杂交强度及持续足够的时间）的ATXN3靶序列杂交 而抑制或另外调节ATXN3基因产物（例如，被表征为具有伸展的病原性聚-谷氨酰胺段的 ATXN3蛋白）的表达。在本文描述了对于此目的和其他目的特别适合的寡核苷酸。
[0012] 一方面，本发明提供约8?约50个核苷酸长（例如，约8?30, 8?20, 12? 18,或14?16个核苷酸长）的寡核苷酸，其包含与对应于哺乳动物ATXN3基因的编码 区的反向互补体或编码ATXN3的mRNA的补体的区具有至少80%同一性（例如，至少约 85% ,90% ,95% ,96% ,97% ,98% ,99%或 100% 同一性）的约 8 ?约 30 个核苷酸（例 如，约 8, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17,18,19, 20, 21，22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29 或 30 个 核苷酸长）的连续的核苷酸序列（第1区）。例如，本发明的寡核苷酸可包含是至少80%互 补于编码41乂吧的部分核酸序列（例如，至少80%互补于编码41乂吧0嫩，前-1111?隱或1111?隱 的部分核酸序列）的连续的核苷酸序列。本文公开的寡核苷酸可包含互补于突变的ATXN3 基因的区或由此编码的对应mRNA的核酸序列。类似地，本文公开的寡核苷酸可包含这样 的的序列，其互补于ATXN3基因的基因产物（例如，由ATXN3基因编码的mRNA)或其编码 突变的多态型或天然存在的变体，诸如编码病原性聚-谷氨酰胺伸展（CAG) n的区及例如包 含G987C单核苷酸多态性，例如由SEQ ID N0:4编码的区，或其天然存在的变体（例如，由 NM_004993. 5编码的转录物变体或单核苷酸多态性诸如SNP ID rsl2895357)。尤其是，本文 所述的寡核苷酸可至少80 %互补（例如，至少约85 %，90%，95%，96%，97%，98%，99% 或更高互补）于编码ATXN3基因或mRNA的突变的区，诸如编码聚-谷氨酰胺伸展突变的区 和编码病原性聚-谷氨酰胺伸展区的区的立即上游和/或下游（例如，自聚-谷氨酰胺 伸展区的位置约 1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11，12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,30,35,40， 45, 50, 55,60,65, 70, 75,80,85,90,95,100,125,150,175, 200, 225, 250 个或更多核苷酸上 游和/或下游）区的核酸序列。
[0013] 在另一方面，本发明提供包含约8?约20个核苷酸的寡核苷酸，其中寡核苷酸与 编码ATXN3的核酸（例如，ATXN3mRNA)的至少8-核碱基部分杂交。例如，在本发明的一些 实施方式中，寡核苷酸与编码聚-谷氨酰胺伸展区的核酸（即，mRNA)，或与毗邻于和/或相 邻于编码聚-谷氨酰胺伸展区（例如，位于病原性（CAG) n伸展的一个核苷酸下游或3'侧 及在本文被称为"G987C" SNP或突变的G - C单核苷酸多态性）的核酸的区杂交。在一些 实施方式中，寡核苷酸互补于编码ATXN3的核酸分子的单链区，诸如，例如具有部分SEQ ID N0:4的序列的核酸分子区或其天然存在的变体（例如，SNP ID rsl2895357)。
[0014] 在一些实施方式中，要求保护的寡核苷酸包含互补于编码ATXN3mRNA的DNA序 列或其部分的序列，或替代性地，要求保护的寡核苷酸与由此编码的RNA序列（例如， 前-mRNA或其mRNA)或其部分杂交。当与靶向的细胞或组织（例如，受本文公开的SCA3 影响的或患受本文公开的SCA3的患者的中枢神经系统的神经元或其他组织）接触时，寡核 苷酸可减少ATXN3的表达（及尤其是减少突变的或异常ATXN3的表达），由此恢复神经元功 能。例如，本发明的寡核苷酸可靶向，及在特定实施方式中，杂交于编码突变的或异常ATXN3 的核酸（例如，mRNA)，诸如，例如，包含或由 SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15， SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17和/或SEQ ID NO: 18编码的mRNA，或上述任何一个特定部分 或区（例如，编码病原性聚-谷氨酰胺伸展的区）和由此调节ATXN3的表达，使得表达减 少和 / 或抑制至少约 10%，20%，25%，35%，40%，50% 或优选至少 60%，65%，70%，75%， 85%，90%，95%，99%或100%。
[0015] 在仍另一方面，本发明提供组合物，其包含寡核苷酸诸如本文所述的那些。在一些 实施方式中，组合物可包括药物组合物，其包含一种或更多本文所述的寡核苷酸以及一种 或更多药学可接受的赋形剂，佐剂或其他分子，以辅助或改善组合物的递送或稳定性。在一 些实施方式中，发明提供缀合物，其包含一种或更多本文所述的寡核苷酸及与之附接（例 如，共价或非-共价附接于所述寡核苷酸）的至少一个非-核苷酸或非-多核苷酸部分。本 文公开的也是寡核苷酸和包含所述寡核苷酸的缀合物和药物组合物，其用作药物，诸如用 于治疗与异常ATXN3的表达关联的疾病（例如，共济失调该SCA3和Machado-Jos印h病）， 及通过给哺乳动物受试者，例如，人受试者诸如小儿人受试者（出生之前或之后）或成年人 受试者施用本文所述的寡核苷酸、缀合物和/或药物组合物来治疗该疾病的方法。
[0016] 在另一方面，发明提供寡核苷酸或其缀合物用于制备治疗SCA3的药物的用途。也 被本发明涵盖的是本文所述的寡核苷酸（例如，与SEQ ID N0:4的区或包含G987C单核苷 酸多态性的SNP ID rsl2895357杂交的寡核苷酸）作为药物的用途。类似地，在本文提供 的是本文所述的寡核苷酸（例如，与编码或相邻于ATXN3聚-谷氨酰胺伸展段的mRNA杂 交的寡核苷酸）用了治疗疾病诸如SCA3的用途。本发明也提供治疗与编码突变的或异常 ATXN3的核酸的表达关联的疾病或病情，诸如SCA3或Machado-Jos印h病的方法，所述方法 包括以下步骤：将有效量的本发明的寡核苷酸、缀合物和/或药物组合物施用于患SCA3,可 能患SCA3或另外受SCA3影响或患SCA3的受试者（例如，诸如患或敏感于SCA3的人类 小儿或成年患者）。在一些实施方式中，与异常ATXN3的表达关联的疾病，病症或病情涉及 ATXN3的过表达，及尤其是突变的或伸展的ATXN3(例如，包含（CAG) n段的不稳定和/或迭 代遗传病原性伸展的ATXN3,其中"η"等于或大于52)的过表达。在一些实施方式中，本文 所述的寡核苷酸、缀合物和药物组合物优先调节ΑΤΧΝ3突变体，多态型或天然存在的变体， 诸如例如包含病原性聚-谷氨酰胺伸展（CAG) n的ΑΤΧΝ3突变体，多态型或天然存在的变 体（例如，由SEQ ID N0:4或SNP ID rsl2895357编码的）的表达。由本发明的寡核苷酸 的该ATXN3突变体，多态型或天然存在的变体的表达的优先调节可在性质上相对于野生型 ATXN3的表达（例如，由SEQ ID N0:1编码的）为部分或绝对的。例如，当施用于患（杂合） SCA3的患者时，本发明的寡核苷酸可靶向编码野生型ATXN3等位基因的mRNA和编码突变的 或伸展的ATXN3等位基因的mRNA，但是该寡核苷酸可调节各靶的表达至改变的程度，使得， 例如，相比野生型ATXN3等位基因的表达，伸展的ATXN3等位基因的表达被调节至更大程 度。本发明的寡核苷酸可，例如，靶向及减少突变的ATXN3变体或包含G987C转变取代的多 态型（例如，ATXN3变体或包含由SEQ ID N0:4, 5或6编码的序列的多态型）的表达2,4， 8,10,15, 25, 50, 75,100, 200倍或更多倍；而相同的寡核苷酸分别减少野生型ATXN3 (例如， 如由SEQIDN0:1编码的）的表达1，2,4,5，10，15,25,50,75，100倍或更多倍。类似地，本 发明的寡核苷酸可，例如，靶向及减少包含病原性聚-谷氨酰胺区的突变的ATXN3多态型或 变体（例如，如由SEQ ID N0:4或SNP ID rsl2895357编码的）的表达约1%，2· 5%，5%， 10%，20%，35%，40%，50%，60%，75%，80%，85%，90%，95%，97. 5% ,99%或更多；而相 同的寡核苷酸减少野生型ATXN3(例如，如由SEQ ID ΝΟ:1编码的）的表达约1%，2.5%， 5%，10%，20%，35%，40%，50%，60%，75%，80%或90%。本文公开的也是相对于编码有 功能的或野生型ATXN3的核酸，可辨别地靶向和/或杂交（例如，特异性杂交）于编码突变 的或伸展的ATXN3的核酸的寡核苷酸。例如，在患Machado-Jos印h病的患者中，本发明的 寡核苷酸可相对于有功能的或野生型ATXN3等位基因的表达，靶向及减少突变的或伸展的 ATXN3 等位基因的表达约 1%，2· 5%，5%，10%，20%，35%，40%，50%，60%，75%，80%， 90 %，95 %，97. 5 %，99 %或更多。或者，本发明的寡核苷酸可增加野生型ATXN3基因产物或 mRNA的表达（例如，在受SCA3影响的小儿患者中）而减少和/或抑制突变的ATXN3基因 产物或mRNA的表达。在一些实施方式中，本文公开的寡核苷酸、缀合物和药物组合物减少 或另外抑制突变的ATXN3的表达（例如，由优先靶向及杂交于患SCA3的患者的等位基因 中编码ATXN3病原性（CAG) n伸展和/或G987C单核苷酸多态性的核酸（例如，mRNA))，而 不影响或最低限度影响不编码突变的ATXN3的表达。
[0017] 在一些实施方式中，本文公开的寡核苷酸杂交（例如，特异性杂交）于ATXN3的 基因产物（即，mRNA)，例如，由包含病原性（CAG)n突变或伸展的突变的ATXN3多态型或变 体编码的mRNA基因产物（例如，如由SEQ ID N0:4或SNP ID rsl2895357编码的）。在 其他实施方式中，寡核苷酸与编码突变的或伸展的ATXN3多态型或变体的核酸的基因产物 (例如，mRNA)杂交，其中编码该ATXN3多态型的核苷酸包含病原性（CAG) n突变或区（例 如，病原性（CAG)n，其中"η"等于81)。在其他实施方式中，本发明的寡核苷酸可与编码 突变的ΑΤΧΝ3多态型或变体的核酸（S卩，mRNA)的基因产物（例如，如由SEQ ID Ν0:4或 SNP ID rsl2895357编码的）特异性杂交，而相同的寡核苷酸不与编码野生型ATXN3的核 酸（S卩，mRNA)的基因产物（例如，如由SEQ ID N0:1编码的）特异性杂交。寡核苷酸与 编码伸展的或突变的ATXN3多态型的核酸的该优先或辨别杂交可调节伸展的或突变的基 因产物的表达，而野生型ATXN3基因产物的表达保守或另外保持未变化。例如，本发明的寡 核苷酸可靶向和优先杂交于由包含SEQ ID N0:15?20的核酸编码的mRNA(或其片段），使 得由该mRNA编码的蛋白的表达被减少和/或抑制至少约10%，20%，25%，35%，40%，50% 或优选至少60%，65%，70%，75%，85%或最优选至少90%，95%，99%或100%。
[0018] 在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸与编码人ATXN3的核酸（例如，mRNA)(例 如，由登录号N〇.NM_004993编码的ATXN3mRNA，包括任何其变体和多态型）杂交。例如， 本发明的寡核苷酸可靶向及杂交于人ATXN3mRNA(例如，如由SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:4编码的）。也涵盖的是优先与一种或更多靶序列杂交的寡核苷酸，其中该靶序列包含 ATXN3mRNA (例如，包含 SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18之一个或多个的靶序列）。本发明的寡核苷酸可优选与包含病 原性（CAG)n突变，伸展的人ATXN3mRNA或其片段（例如，由登录号No. NM_004993编码的 ATXN3mRNA)杂交，由此调节靶向的人ATXN3的表达。或者，相同的寡核苷酸可与编码ATXN3 多态型的核酸特异性杂交，其编码病原性（CAG) n突变或伸展，但无法在相同的或近似严格 度条件下与编码缺乏或不另外编码该病原性（CAG)n突变或伸展的人物种的野生型的核酸 杂父。
[0019] 也提供的是抑制核酸编码突变的，伸展的或异常ATXN3的表达的方法，及尤其是 抑制表达突变的或伸展的ATXN3的细胞（例如，Purkinje细胞或神经元）中编码突变的， 伸展的或异常ATXN3基因的该核酸的基因产物（例如，编码伸展的ATXN3的mRNA)的产生 (例如，转录或翻译）的方法。在一些实施方式中，所述方法包括给患者施用本发明的寡 核苷酸、缀合物或药物组合物，或另外使细胞或组织与该寡核苷酸，缀合物或药物组合物接 触，以抑制该患者或细胞中ATXN3 (例如，包含病原性聚-谷氨酰胺伸展的ATXN3)的表达。
[0020] 也公开的是约8?50个单体的寡核苷酸，其包含约8?50个连续的单体（例 如，核苷酸）的第1区，其中该第1区的序列是至少80%同一（例如，至少85%，至少 90%，至少95%，至少99%同一）于一种或更多选择的靶序列（例如，包含编码突变的 或伸展的ATXN3的mRNA的靶序列）。在一些实施方式中，选择的靶序列可包含编码哺乳动 物ATXN3(例如，mRNA)的核酸或其片段的区。还提供的是锁的反义寡核苷酸，例如，8? 50,12?30或12?20个核苷酸长。例如，在一些实施方式中，寡核苷酸包含一个或更多锁 核酸（LNA)残基或单体单元（例如，SEQ ID N0:19，SEQ ID N0:20，SEQ ID N0:21，SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23)。当本发明的寡核苷酸包含2个或更多LNA单体单元（例如，2或 更多β -D-氧基-LNA单体单元）时，该LNA单体单元可彼此毗邻，或替代性地该LNA单体单 元可在彼此非-连续的位置。在特定实施方式中，本文公开的寡核苷酸是间隔聚体。例如， 在本文公开的是反义寡核苷酸，其包含SEQ ID Ν0:12,其中寡核苷酸调节ΑΤΧΝ3的表达，且 其中寡核苷酸在一个或更多选自下列的核苷酸包含至少一个锁核酸：其中所述寡核苷酸调 节ATXN3的表达，且其中所述寡核苷酸在一个或更多选自下列的位置包含至少一个核苷酸 类似物：（i)在第1和3位的一个或更多的腺嘌呤核苷酸是氧基-LNA ; (ii)在第10位的鸟 嘌呤核苷酸是氧基-LNA ; (iii)在第9和11位的一个或更多的胞嘧啶核苷酸是氧基-LNA ; 及（iv)在第2位的胸腺嘧啶核苷酸是氧基-LNA。
[0021] 任选地，该锁的反义寡核苷酸可包含一个或更多糖取代，诸如例如，2'-0-甲氧基 乙基糖取代。本文提供的也是包含一种或更多本发明的寡核苷酸的缀合物，其中该寡核苷 酸包含至少一个共价附接于本发明的寡核苷酸的非-核苷酸或非-多核苷酸部分。
[0022] 也提供的是药物组合物，其包含一种或更多本发明的寡核苷酸或缀合物，及药学 可接受的稀释剂，载体，盐，溶剂或佐剂。也提供的是药物组合物，其包含一种或更多本发明 的寡核苷酸。该药物组合物可例如，肠胃外通过注射或直接输注到靶作用位点来施用，或可 通过吸入，腹膜，局部，经口或鞘内施用。
[0023] 还提供的是在细胞或组织中下调编码突变的或异常ATXN3的等位基因或核酸的 表达（例如，在mRNA水平下调伸展的ATXN3的表达），及尤其是下调ATXN3的突变体或天 然存在的变体的表达的方法。该方法包括使细胞或组织与有效量的一种或更多本发明的寡 核苷酸、缀合物或组合物体外或体内接触。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸和组合物 能下调哺乳动物（例如，患SCA3或另外受SCA3影响的人患者）中突变的，伸展的或异常 ATXN3等位基因的表达，而不调节或另外最低限度影响正常有功能的或野生型等位基因的 表达。
[0024] 也公开的是通过给动物施用治疗或预防性地有效量的一种或更多本文所述的寡 核苷酸、缀合物或药物组合物来治疗疑患或敏感于与伸展的或异常ATXN3的表达或过表达 关联的疾病或病情的动物（例如，非-人动物或人）的方法。此外，在本文提供的是使用 寡核苷酸抑制突变的或异常ATXN3 (例如，ATXN3的突变的或天然存在的变体）的表达的方 法。
[0025] 也提供的是治疗与异常ATXN3的表达关联的病情（例如，共济失调诸如SCA3和 Machado-Joseph病）的方法和恢复细胞（例如，神经元）功能的方法。该方法包括向表达 ATXN的异常等位基因的受影响的细胞（例如，神经元或Purkinje细胞）递送或接触一种 或更多本发明的寡核苷酸。要求保护的方法将寡核苷酸导入神经元细胞（例如，转染或剥 裸递送）的条件足以减少受影响的细胞中异常ATXN3等位基因的表达，由此恢复正常细胞 功能。在一些实施方式中，该方法优先减少包含G987C单核苷酸多态性的伸展的ATXN3多 态型或天然存在的变体的表达。本发明提供治疗疾病诸如SCA3和Machado-Jos印h病的方 法，所述方法包括给有需求的患者（例如，人类受SCA3影响的小儿患者）施用有效量的一 种或更多寡核苷酸，缀合物或其药物组合物。本发明提供抑制（例如，通过下调）细胞或 组织中突变的或异常ATXN3的表达的方法，所述方法包括以下步骤：使细胞或组织与有效 量的一种或更多本文公开的寡核苷酸或其缀合物或药物组合物接触，由此下调突变的或异 常ATXN3等位基因的表达（例如，在mRNA水平）。
[0026] 以上讨论的，及本发明的许多其他特征和伴随优势会通过引用以下本发明的详述 结合伴随的实施例而变得更佳明晰。 【【专利附图】

【附图说明】】
[0027] 图1A和1B例证经历了用互补于包括G987C单核苷酸多态性的伸展的ATXN3等位 基因区的部分的寡核苷酸（来自ATXN3mRNA的病原性（CAG) n伸展的一个核苷酸）48小时的 剥裸处理的HEK-293细胞中的FLAG-标记的突变体（MUT)报告子构建体和野生型（WT)内 源性表达报告子构建体水平。将HEK-293细胞用包含与萤火虫萤光素酶转录物融合的具有 G987C SNP和81个（CAG)重复子的突变的ATXN3转录物的编码区的pFLAG-ATX3Q81-FL-FF 萤光素酶报告子构建体稳定地转染，并通过在1 μ M，5 μ Μ和25 μ Μ的培养基浓度剥裸而将 寡核苷酸随后导入转染的细胞。然后在48小时之后收获细胞，并通过使用关联qPCR测定 测定mRNA表达的百分率。结果表示为模拟物-治疗的样品的百分率，及报道为每寡核苷酸 3次独立研究的平均。描绘的误差条指示标准偏差。如在图1A和1B中所示，20种寡核苷 酸展示具有相对于内源性WT报告子的显著的剂量应答的MUT报告子构建体的稳健的敲落。
[0028] 图2A和2B显示12种选择的寡核苷酸的剥裸递送后，ATXN3-Q81转染的HEK-293 细胞中伸展的ATXN3转录物（MUT)和内源性ATXN3(WT)mRNA的表达。将结果标准化到内源 性GAPDH水平及表示为模拟物处理的样品的百分率。将寡核苷酸由剥裸，使用具有0. 3 μ M， 1 μ Μ，3 μ Μ，9 μ Μ，27 μ Μ和81 μ Μ的终浓度的培养基导入细胞。然后在寡核苷酸的剥裸递送 之后48小时收获细胞，及提取突变的ΑΤΧΝ3转录物（报告子构建体）和内源性ΑΤΧΝ3转录 物的mRNA及由qPCR分析。结果报道为每寡核苷酸3次独立研究的平均值，和误差条指示 标准偏差。如显示于图2A和2B，评价的全部12种寡核苷酸被发现在评价的浓度范围产生 MUT报告子构建体（相对于WT报告子构建体）的剂量-依赖性敲落。
[0029] 图3例证被选择为领先的及被设计为互补于包括位于自ATXN3mRNA的病原性 (CAG) n伸展一个核苷酸的G987C单核苷酸多态性的伸展的ATXN3等位基因的区的部分的 5种寡核苷酸的半最大抑制性浓度（IC 5(I)曲线。将HEK-293细胞用包含与萤火虫萤光素 酶转录物融合的具有G987C SNP和81个（CAG)重复子的突变的ATXN3转录物的编码区的 PFLAG-ATX3Q81-FL-FF萤光素酶报告子构建体稳定地转染，并通过使用具有0. 3 μ M，1 μ M， 3 μ Μ，9 μ Μ，27 μ Μ和81 μ Μ的终浓度的培养基剥裸而将寡核苷酸随后导入转染的细胞。然 后在寡核苷酸的剥裸递送之后48小时收获细胞，及提取突变的ΑΤΧΝ3转录物（报告子构建 体）和内源性ΑΤΧΝ3转录物的mRNA，并由qPCR分析。标绘的数据点表示3次独立实验的平 均报告子信号，和误差条表示标准偏差。灰色曲线（?)表示野生型（WT)报告子的拟合的 应答曲线，和黑色曲线（▲)表示伸展的或突变体（MUT)报告子的拟合的应答曲线。各曲 线的对应IC 5(I值显示在各图上，和5个选择的领先的寡核苷酸的实际值也报道于表2。
[0030] 图4例证互补于包括位于自ATXN3mRNA的病原性（CAG) n伸展一个核苷酸的G987C 单核苷酸多态性的伸展的ATXN3等位基因的区的部分的各12种寡核苷酸的稳定性。将各寡 核苷酸于37°C，在含添加的脑组织的脑脊液中温育120小时。在0, 24,48,96和120小时取 样品，及由SDS-PAGE分析。各12种寡核苷酸的血浆稳定性被发现在预期的范围之内良好， 且尤其是，全部寡核苷酸被发现具有大于96小时的总体半衰期，和多数寡核苷酸未产生任 何可感觉到的降解产物。
[0031] 图5A和5B显示16天体内耐受性研究的结果，其中将互补于包括及邻接编码 G987C单核苷酸多态性的核苷酸的区的部分的寡核苷酸在第0, 3, 7,10和14天施用于小鼠。 在第16天处死小鼠及评价。对照施用盐水对照。结果报道为每寡核苷酸5次独立研究的 平均值，和误差条指示标准偏差。如显示于图5A和5B，相对于盐水对照，5种选择的寡核苷 酸（SH06, SH10, SH13, SH16 和 SH20,它们分别对应于 SEQ ID N0:19, 20, 21，22 和 23)导致 肝酶丙氨酸氨基转移酶（ALT)和天冬氨酸氨基转移酶（AST)的可忽略的升高。
[0032] 【发明详述】
[0033] 本文所述的寡核苷酸提供能调节ATXN3的表达的特定治疗性工具。在一些实施方 式中，本文所述的短（例如，通常的少于50, 40, 30, 20, 18, 17, 16, 15, 14, 13,12,11，10,9,8 个或更少核苷酸长）单链合成寡核苷酸具有互补于ATXN3RNA靶序列（例如，前-mRNA或 mRNA)的碱基序列，及由氢键合的碱基配对形成杂交体双联体。例如，在本发明的一些实施 方式中，寡核苷酸可靶向或互补于编码ATXN3的核酸（例如，编码ATXN3的mRNA)或其片 段（例如，SEQ ID N0:5或6)，由此调节ATXN3的表达。在其他实施方式中，本发明的寡核 苷酸（例如，锁核酸间隔聚体）可通常由切割作用模式或空间阻断加工前-mRNA或mRNA 的翻译中涉及的酶来工作。此杂交可被预期预防表达，（即，靶mRNA代码翻译为其蛋白产 物）由此排除随后蛋白产物的效应。因此，本文所述的寡核苷酸和方法可用于改善或治疗 一种或更多与异常ATXN3的表达关联的病情（例如，疾病或综合征），例如，共济失调该3 型脊髓小脑共济失调（SCA3)。
[0034] SCA3 (也被称为Machado-Jos印h病）是具有初现和严重性的可变年龄的常染色体 显性，进行性神经退行性病症。SCA3由编码共济蛋白-3的核酸中病原性（CAG) n三核苷酸伸 展导致，其导致ATXN3蛋白中聚-谷氨酰胺结构域或段的伸展。SCA3原本描述于葡萄牙人后 裔，及尤其是来自SCA3和Machado-Joseph病是最普遍的亚速尔群岛（例如，在Flores小 岛，SCA3 的发生率是 1/140)。（Sudarsky L·，等人，Clin. Neurosci. 1995;3:17-22)。SCA3 随后在其他几个国家被鉴定，及现在被认为是最常见的显性地遗传的遗传性共济失调。
[0035] 临床，SCA3和Machado-Joseph病呈现进行性步态和肢共济失调，构音困难和其更 严重的形式的其他症状的可变的组合，包括锥体束征，张力失调，昏睡，眼球运动病症，面舌 虚弱，神经病变，进行性感觉损失和帕金森特征,SCA3特征在于锥体（例如，运动，躯体感 觉），锥体外束（例如，肌张力）和神经功能缺陷。在受影响的家族之内，此形式的共济失 调也展示预期效应，其特征在于早先疾病初现和随各新的受影响的代的更严重的症状。
[0036] 如同临床特征，成为基础的SCA3中退行性变化以一些程度改变。在中枢神经系统 之中，经历神经元损失和反应性星形胶质化的区是选择的端脑，小脑和脑干核，脊髓前角， Clarke 氏柱和背根神经节。（Diirr A,等人，Ann Neurol 1996 ;39 :490-9)。SCA3 的分子发 病机制仍是推测性的，由于对ATXN3的正常功能知之甚少，但是全部形式的SCA3归因于染 色体14q32. 1上ATXN3的编码区中的不稳定和迭代遗传伸展。（Kawaguchi Y.， 等人，Nature Genet. 1994 ;8 :221 ?228)。
[0037] ATXN3是聚泛素-结合蛋白，其生理学功能已连系到泛素-介导的蛋白水解。 (Doss-P印e EW，Mol. Cell. Biol. 2003 ;23:6469 - 6483)。编码ATXN3 的核酸中伸展的（CAG) n突变的存在在ATXN3蛋白的C-端区导致长聚-谷氨酰胺链，及其在本文被称为"聚-谷氨 酰胺伸展"或"聚-谷氨酰胺段"。（Diirr A，等人，Ann Neurol 1996;39:490-9)。如本文 所用，术语"伸展的"指称存在聚-谷氨酰胺伸展（例如，具有（CAG)n的伸展的等位基因， 其中η大于52)。聚-谷氨酰胺伸展增加蛋白错折叠，其导致核和细胞质包裹体的聚集和形 成。（Paulson HL,等人，1997, Neuron 19, 333 ?344)。聚-谷氨酰胺伸展也与 Purkinje 细胞和脊髓神经元中有害泛素化的核聚集物和包裹体的形成关联。错折叠的蛋白聚集物不 仅是SCA3的特征，而且也是许多其他神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病和帕金森病的常 见的特征。
[0038] 因为SCA3的显性遗传模式，及因为ATXN3功能的损失不赋予与聚-谷氨酰胺 伸展相同的疾病表型，伸展的等位基因在受影响的神经元获取显性毒性。（Schmitt等 人，Biochem Biophys Res Commun 2007 ;362 (3) : 734-9)。毒性可出现自泛素 / 蛋白酶体 机制的饱和，或出现自未折叠或错折叠的蛋白的蓄积，或自缺陷蛋白降解的其他调控缺陷。
[0039] 相比可展示约55?84之间或更伸展的谷氨酰胺重复长度（通常在本文被称为 "病原性（CAG)Ji展"或"病原性伸展"（例如，（CAG) n其中n=约55?84或更多））的患 SCA3患者，未受SCA3影响的个体正常展示ATXN3蛋白中约10?40个之间的谷氨酰胺重复 长度（例如，（CAG) n其中"η"等于约 10_4〇)。（见，Paulson, HL, Intranuclear inclusions of expanded polyglutamine protein in spinocerebellar ataxia type 3/Machado Joseph disease. BIOS Scientific Publishers, Oxford, United Kingdom ；Kawaguchi Y. , et al.Nat.Genet. 1994 ;8:221-228)。聚-谷氨酰胺段的伸展给突变的ATXN3蛋白赋予毒 性功能获得，这导致神经元核内包裹体的形成。（Schmidt T,等人，Brain Pathol. 1998; 8:669-679)。聚-谷氨酰胺段的长度与SCA3初现年龄相反地关联。（Netravathi M，等人， J. Neurol Sci. (2009)2771-2:83-6)。
[0040] 野生型ATXN3等位基因的功能损失也已显示在泛素-介导的蛋白水解中起到作 用，且该功能损失可为有害的。（Doss-P印e EW, Mol. Cell. Biol. 2003;23:6469 - 6483)。因 此，本发明的寡聚体化合物单独靶向病原性（CAG)n伸展的策略可不是有益的。反之，在特定 实施方式中，可优选战略性和辨别性地靶向突变的（例如，导致疾病的）ATXN3等位基因。
[0041] 基于单核苷酸多态性（SNP)的存在的突变的ATXN3等位基因的战略性靶向已被提 议确保区别野生型和突变ATXN3等位基因。（Miller VM,等人.Proc Natl Acad Sci. 2003 ; 100:7195-7200)。该位于突变的ATXN3等位基因的病原性（CAG)n伸展的一个核苷酸下 游或3'侧的SNP与导致疾病的聚-谷氨酰胺伸展处于连锁不平衡，和一般随患病的等位 基因分开。（Stevanin G,等人.Am J Hum Genet. 1995;57:1247 - 1250 ;及 Gaspar C,等 人.Hum Genet. 1996;98:620-624)。在多数SCA3患者中，野生型ATXN3等位基因在第987 位具有G，然而伸展的/突变ATXN3等位基因在第987位具有C。（Gaspar C，等人.Am J Hum Genet. 2001 ;68:523-528)。全部编码聚-谷氨酰胺伸展的突变ATX3等位基因在第987 位具有C，而大致50 %的野生型等位基因在此位置具有G。
[0042] 减少的野生型ATXN3等位基因的表达不导致单倍不足，及因此减少的野生型 ATXN3等位基因的表达未被预期为有害。因此，G-到-C SNP或突变（在本文被称为 "G987C" SNP或突变）的存在提供使用本发明的寡聚体化合物来有区别地靶向伸展的或突 变的ATXN3等位基因，而保存野生型ATXN3等位基因的功能的机会。
[0043] 因此，在一实施方式中，本公开涉及负责SCA3发展的编码ATXN3的突变体或伸展 的等位基因的等位基因-特异性靶向或敲落。在这点上特别考虑的是，假定（CAG) n重复子 的末端不稳定性，（CAG)n段的复制是常见的。如之前讨论，正常等位基因已显示含有约13 和36个之间的CAG重复子；但是，在特定实例中，正常等位基因可含有多至47个CAG重复 子。SCA3疾病病理学在具有更多末端复制，例如超过52个CAG重复子的伸展的等位基因中 发生。（见，Kawaguchi Y.，等人· Nat. Genet. 1994 ;8 :221 ?228)。
[0044] 寡核苷酸，本文所述的药物组合物和方法可，例如，通过调节一种或更多异常核酸 分子（例如，伸展的ATXN3)的表达或功能来用于改善或治疗共济失调诸如SCA3。
[0045] 【寡核苷酸】
[0046] 在一些实施方式中，本文所述的寡核苷酸靶向编码异常ATXN3的核酸（例如，编 码ATXN3的mRNA，如SEQIDN0:4中提供和/或其片段，如SEQIDN0:5和SEQIDN0:6中 提供）和该核酸的天然存在的变体，由此调节ATXN3的表达。如本文所用，术语"寡核苷酸" 指称由2个或更多核苷酸共价连接形成的分子。术语寡核苷酸通常包括寡核苷酸类似物， 寡核苷酸模拟物和这些的嵌合组合。在本发明的情景中，单核苷酸单元也可被称为单体或 单元。在一些实施方式中，术语"核苷"，"核苷酸"，"单元"和"单体"互换使用。需知，当指 称核苷酸或单体的序列时，所指的是碱基，诸如，例如A，T (或U)，G或C的序列。
[0047] 在一些实施方式中，本文公开的寡核苷酸对于经反义作用机理调节核酸分子的表 达（例如，调节异常ATXN3的表达）有用。此调节可，例如，通过提供互补于和/或杂交于 一种或更多靶核酸分子，诸如mRNA的寡核苷酸（例如，SEQ ID N0:4或SNP ID rsl2895357) 来实现。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸互补于靶核酸的特定区（例如，相邻于或 邻接位于病原性（CAG)Ji展的立即下游（3')的G987C转变取代的编码ATXN3的核酸的 区）。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸能与靶核酸的特定区（例如，编码G987C SNP 或转变取代的ATXN3mRNA的区）杂交（例如，在生理条件特异性杂交）。
[0048] 如本文所用，短语"靶核酸"旨在包括DNA和自该DNA转录的RNA (包括前-mRNA和 mRNA或其部分），及也包括源于该RNA的cDNA。例如，在一些实施方式中，短语"靶核酸"用 于指称编码ATXN3的核酸（例如，mRNA)或尤其是编码突变的或异常ATXN3的核酸。如本 文所用，术语"基因产物"指称自基因或核酸的表达得到的任何生物化学物质（例如，DNA或 RNA)及包括，但不限于mRNA，RNA和/或蛋白。例如，在一些实施方式中，当关于ATXN3基 因使用时，短语基因产物指称由ATXN3编码的mRNA。在特定实施方式中，靶核酸包含选自下 列的核酸序列：SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:13，SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18。在其他实施方 式中，本文公开的寡核苷酸互补于和/或杂交于包含下列之一个或更多的核酸序列：SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:5，SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:13， SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 和 / 或 SEQ ID NO: 18。
[0049] 在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸化合物互补于一种或更多靶核酸（例 如，mRNA编码ATXN3)及干扰靶向的核酸的正常功能（例如，由反义作用机理）。此靶核 酸的功能由与之特异性杂交的本发明的寡核苷酸干扰或调节通常被称为"反义"。待干扰 的DNA的功能可包括复制和转录。待干扰的RNA的功能可包括功能诸如，例如，RNA转位到 蛋白翻译的位点，蛋白自RNA翻译，RNA剪接而产生一种或更多mRNA种，及可啮合RNA或由 RNA辅助的催化性活性。在一些实施方式中，干扰靶核酸功能的总体效应是调节该靶核酸的 产物的表达。
[0050] 如短语在本文所用，"反义化合物"和"反义寡核苷酸"指称至少部分互补（例 如，100%，约 99%，98%，97. 5%，95%，90%，85%，80%，75%，70%，65%，60%，55% 或50%互补）于核酸分子，及尤其是靶核酸诸如编码异常或突变的蛋白或酶的mRNA的区 的。在一些实施方式中，反义化合物或反义寡核苷酸能与靶核酸杂交，由此调节其表达。
[0051] 本发明的寡核苷酸包含约8?50个核苷酸长，诸如例如8?30个核苷酸长的连 续的核苷酸序列或由其组成。在各种实施方式中，本发明的化合物不包含RNA单元或单体， 而是，例如，包含DNA单元或单体和/或在一些实例中LNA单元或单体。优选的是，本发明 的化合物是线性分子或被合成为线性分子。在一些实施方式中，寡核苷酸是单链分子，及优 选不包含，例如，至少3,4或5个连续的核苷酸的短区（其互补于相同的寡核苷酸之内的相 当的区（即，双联体））。在这点上，寡核苷酸基本上不是双链的。
[0052] 【靶序列】
[0053] 在特定实施方式中，本文所述的寡核苷酸能调节，或在一些实施方式中，下调（例 如减少或消除）ATXN3的表达（例如，在mRNA水平下调编码异常或突变的ATXN3的核酸的 翻译）。在这点上，本发明的寡核苷酸可一般在哺乳动物细胞诸如人细胞（例如，A549细 胞，HeLa细胞，Purkinje细胞或神经元细胞）中影响ATXN3的抑制。在一些实施方式中， 本发明的寡核苷酸与靶核酸（例如，编码伸展的，突变的或异常ATXN3mRNA的mRNA)杂 交，及相比正常表达水平影响表达的抑制或减小至少约10%?100% (例如，诸如寡核苷 酸或缀合物缺失下的表达水平）。例如，见于携带ATXN3突变等位基因的个体，本文公开的 寡核苷酸可相比ATXN3的正常表达水平，影响ATXN3的表达的减小或抑制至少约5 %，10 %， 20%，25%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%，97. 5% ,98% ,99%或 100%。在 一些实施方式中，该调节在使靶向的细胞或组织暴露于约0. 04nM?25nM浓度（例如，约 0.8nM?20nM浓度）的本发明的化合物之后显现。在相同的或不同实施方式中，靶核酸（例 如，编码突变的ATXN3的mRNA)的表达抑制小于100% (例如，诸如小于约98%抑制，小 于约95%抑制，小于约90%抑制，小于约80%抑制或小于约70%抑制）。在一些实施方 式中，本文公开的寡核苷酸能在mRNA水平调节ATXN3的表达（例如，通过靶向及杂交于编 码突变的或异常ATXN3的mRNA)。表达调节（例如，在mRNA水平）可通过测量蛋白水平 或浓度测定（例如，由SDS-PAGE之后是使用针对靶蛋白产生的适合的抗体的蛋白印迹）。 或者，表达调节（例如，在mRNA水平）可通过测量mRNA的水平或浓度来测定（例如，由 RNA印迹或定量RT-PCR)。当经mRNA水平或浓度的评估测量表达时，使用适当的剂量或浓 度的寡核苷酸（例如，约〇. 〇4nM?25nM，或约0. 8nM?20nM)的下调程度可相对于在缺 失本发明的寡核苷酸、缀合物或组合物下观察到的正常水平或浓度为大于约10%，约10? 20 %，大于约20 %，大于约25 %，或大于约30 %。
[0054] 在本发明的情景中，术语"调节"和"调节"可指下列之一种或更多：基因或基 因产物（例如，ATXN3mRNA)的表达增加（例如，刺激或上调），基因或基因产物（例 如，ATXN3mRNA)的表达减少（例如，下调或抑制），和2种或更多基因产物之间相对表达 变化（例如，相对于野生型ATXN3的表达，突变ATXN3的表达减少）。在本文所述的一些 情景中，下调和抑制是调节的优选的形式，尤其是当其涉及调节突变的或伸展的ATXN3 (例 如，包含病原性聚-谷氨酰胺段的ATXN3)的表达时。在本文所述的一些情景中，术语"表 达"是指来自基因或核酸（例如，DNA)的信息用于合成基因产物（例如，mRNA，RNA和/或 蛋白）的过程，及包括，但不限于，下列之一种或更多：复制步骤，转录和翻译。可由本发明 的寡核苷酸调节的表达步骤可包括，例如，蛋白的转录，剪接，翻译和翻译后修饰。
[0055] 由于其涉及靶向，调节和表达，术语"ATXN3"广泛地可指称共济蛋白-3基因或其 基因产物（例如，前-mRNA，成熟mRNA，cDNA或蛋白）和可包括突变的及野生型形式，同种 型和其变体（例如，编码人ATXN3及编码ATXN3蛋白的核酸）。用斜体显示的术语，"ATXN3" 如本文所用，一般指称共济蛋白-3基因。术语"野生型"（如其描述ATXN3)指称受试者或 群中最常观察到的ATXN3等位基因，核苷酸序列，氨基酸序列，或表型。例如，相对于由编码 该伸展的聚-谷氨酰胺段的核酸的存在表征的突变的ATXN3等位基因，术语"野生型"指称 不包含该突变的余下等位基因。术语"突变体"和"突变的"（如它们描述ATXN3)指称包含， 例如，一个或更多导致单碱基核苷酸用遗传物质（例如，DNA或RNA)的另一核苷酸取代的 转变和颠换点突变的受试者或群中改变的等位基因，核苷酸序列，氨基酸序列，或表型。突 变的一例是作为病原性（CAG) n伸展立即3'侧的G-到-C转变取代及位于NM_004993的第 987位的ATXN3中的单核苷酸多态性（包括包含相同的G-到-C转变取代的其任何变体和 多态型），及在本文被称为"G987C"突变或SNP。G987C突变与导致疾病的聚-谷氨酰胺伸 展处于连锁不平衡，因此在多数患SCA3的患者中，G987C突变随编码病原性聚-谷氨酰胺 伸展的等位基因分开。G987C突变的SNP ID是SNP ID rsl2895357。术语"突变体"和"突 变的"也旨在包括导致单碱基核苷酸用遗传物质（DNA或RNA)的另一核苷酸取代的转变和 颠换点突变。该突变以相邻于病原性（CAG) n伸展的G987C转变取代为例，其在多数患SCA3 的患者中呈现为在第987位C代替G (如在正常患者中）。
[0056] 如本文所用，术语"伸展"或"伸展的"（如它们描述或定性ATXN3或编码ATXN3的 核酸）指称遗传密码中迭代基因复制的区，及尤其是编码病原性聚-谷氨酰胺伸展的包含 (CAG) nH-核苷酸重复子的区（例如，编码包含区（CAG)IJ^ATXN的核酸，其中"η"大于 约52)。伸展的一例是编码ΑΤΧΝ3的核酸中不稳定复子的迭代基因复制，其编码 及导致翻译的ΑΤΧΝ3蛋白产物的病原性聚-谷氨酰胺伸展。
[0057] 如特别涉及ΑΤΧΝ3，短语"调节表达"是指刺激，上调，下调和/或抑制ΑΤΧΝ3基因的 基因产物（例如，野生型和/或突变的ΑΤΧΝ3的基因产物）。例如，靶向编码异常ΑΤΧΝ3的 核酸（例如，mRNA)，且与该核酸特异性杂交的本发明的寡核苷酸（例如，mRNA编码ΑΤΧΝ3) 可调节ATXN3表达。本文所述的寡核苷酸可调节患Machado-Joseph病或SCA3的患者中野 生型及突变的ATXN3的表达。或者，在优选的实施方式中，本文所述的寡核苷酸可优先下 调或抑制突变体或伸展的ATXN3的表达（例如，在本文描述的寡核苷酸可调节由病原性 (CAG) n三-核苷酸重复子的存在表征的突变ATXN3的表达）。
[0058] 在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸能靶向特定核酸。在本文所述的反义寡核 苷酸的情景中，靶向特定核酸可为多步过程。过程通常始于鉴定其功能待调节的核酸序列。 此可为，例如，其表达相关于特定病症或疾病状态（例如，SCA3)的核酸（例如，mRNA)。在 一些实施方式中，靶核酸（例如，mRNA)编码ATXN3。在本发明的一些实施方式中，寡核苷 酸能导致靶核酸的等位基因-特异性调节（例如，通过选择性地靶向编码病原性聚-谷氨 酰胺段的等位基因，而由此辨别性地调节伸展的等位基因（相对于有功能的野生型等位基 因）的表达）。例如，在特定实施方式中，靶核酸可包含编码ATXN3的G987C转变取代和/ 或（CAG)Ji展段的核酸基因的区或片段。或者，在一些实施方式中，靶核酸编码包含ATXN3 的G987C突变和/或（CAG) n伸展段的ATXN3的特定区（或对应mRNA)。靶向过程也可包括 在靶基因之内确定发生反义相互作用的位点，使得一个或更多期望效果会产生。一个或更 多期望效果可包括，例如，基因产物（例如，野生型和/或突变mRNA或蛋白）的表达的调 节，在相同的基因或mRNA上或在其他基因或mRNA上，相对于其他位点，就靶位点的选择性 结合（例如，增加的结合亲和力），足够的或增强的递送到靶，及最小或无不需要的副作用。 在一些实施方式中，优选的靶向的核酸或mRNA位点编码ATXN3的G987C SNP和/或（CAG) "伸展段和/或相邻区。
[0059] 聚-谷氨酰胺伸展呈现负责脊髓小脑共济失调3发展的最常见的突变。如上所述， 术语"聚-谷氨酰胺伸展"指称由（CAG) n三-核苷酸编码及可存在于编码ATXN3的核酸中 的谷氨酰胺残基的迭代和病原性重复子（在本文被称为"病原性（CAG) n伸展"，其中η >约 52)。由（CAG)n(其中η彡约52)编码的聚-谷氨酰胺伸展已相关于SCA3,而η彡约47可 为更常见的和欠可能导致SCA3。聚-谷氨酰胺伸展也指称毗邻病原性（CAG) nH-核苷酸 重复子的区，例如，自该聚-谷氨酰胺伸展（例如，G987C突变）测量2, 5,10,12, 20, 30, 50， 60, 75,80或100密码子上游和下游的区。聚-谷氨酰胺伸展给ATXN3赋予毒性功能获得， 其导致神经元核内包裹体的形成，及呈现负责SCA3发展的最常见的突变。在本发明的情景 中，术语"单-核苷酸多态性"或"SNP"指称当物种成员之间或个体中配对的染色体之间单 核苷酸不同时发生的核苷酸序列中的变异，例如，位于病原性（CAG) n伸展的：V端的G987C SNP。
[0060] 聚-谷氨酰胺伸展赋予ATXN3导致疾病的功能获得，因此，选择性地下调突变的或 伸展的ATXN3等位基因的反义寡聚体化合物被预测改善或恢复余下（野生型）等位基因 的正常ATXN3功能。特别是，在患SCA3的患者中，本发明的寡聚体化合物辨别性地靶向及 杂交于编码突变的ATXN3等位基因的核酸（S卩，mRNA)(例如，包含SEQID N0:4或SNP ID rsl2895357的核酸），使得突变的ATXN3等位基因的表达被下调或抑制，而相同的化合物不 或以更少程度靶向或杂交于野生型等位基因（例如，SEQ ID N0:1)，由此保存余下野生型等 位基因的功能。
[0061] 本文所述的寡核苷酸可被递送到下列之一种或更多：动物，哺乳动物，人，或细胞。 革巴向的细胞类型可，在一些实施方式中，包括神经元细胞，脑细胞，Purkinje细胞，HeLa细 胞，HEK-293或A549细胞。在特定实施方式中，（例如，HEK-293或A549细胞中）使用的寡 核苷酸浓度可为约 〇· 〇25ηΜ，(λ 03ηΜ，(λ 05ηΜ，(λ ΙηΜ，(λ 25ηΜ，(λ 27ηΜ，(λ 3ηΜ，(λ 5ηΜ，(λ 81nM， 0· 9nM，InM，2. 5nM，5nM，40nM，100nM，200nM，250nM或更。使用的寡核苷酸浓度可，在一些实 施方式中，是25nM(例如，在Purkinje细胞中）。在转染试剂缺失下（例如，使用剥裸递 送），被表征为具有约1 μ Μ?25 μ Μ之间的寡核苷酸浓度（例如，诸如约5 μ M)的介质可 用于下调靶基因。
[0062] 使用的寡核苷酸浓度可，在一些实施方式中，是0. InM?InM(例如，在神经元细 胞中）。在特定实施方式中，本文公开的寡核苷酸可以约〇. 2?约20mg/kg的剂量（例如，以 至少约 0· 2mg/kg，0· 25mg/kg，0· 5mg/kg，1. Omg/kg，1. 5mg/kg，2. Omg/kg，2. 5mg/kg，3. Omg/ kg, 3. 5mg/kg, 4. Omg/kg, 4. 5mg/kg, 5. Omg/kg, 6. Omg/kg, 7. 5mg/kg, 8. Omg/kg, lOmg/kg, 12. 5mg/kg, 15mg/kg或20mg/kg的每天或每周剂量施用）周期性地施用给受试者（例如， 每天，每周，每月，每季，每半年或每年静脉内或皮下施用给人）。需知，在一些实施方式 中，可在体外细胞测定中，使用转染试剂（例如，脂转染剂）实施用来处理细胞的寡核苷酸 的适当的浓度的确定。
[0063] 在一些实施方式中，本文所述的寡核苷酸是ATXN3的有力的抑制物（即，在细胞 或组织暴露于相对低浓度的寡核苷酸后，能调节该细胞或组织中ATXN3的表达）。在一些 实施方式中，寡核苷酸能在相对低浓度的该寡核苷酸减少或另外抑制ATXN3(例如，突变 的ATXN3)的表达。例如，在一些实施方式中，寡核苷酸可以相对低浓度抑制ATXN3由细胞 的表达（例如，如通过转染测定测定的小于约5nM的IC 5(I，或小于约4nM，诸如小于2nM的 ic5。）。如本文所用，术语"IC5Q"指称足以抑制对象参数（例如，ATXN3蛋白表达）约50% 的寡核苷酸的浓度。在特定实施方式中，本文公开的反义寡核苷酸特征在于选择性地抑制 突变ATXN3蛋白的表达（相对于野生型ATXN3蛋白的表达）。因此，寡核苷酸可特征在于相 对于抑制野生型ATXN3蛋白的表达需要的浓度，以更低浓度（例如，约2倍更低）抑制突 变ATXN3蛋白的表达。例如，反义寡核苷酸可展示突变体和野生型ATXN3蛋白的IC 5Q的至 少2倍差异（例如，在患SCA3的哺乳动物中，相对于正常或野生型蛋白，抑制ATXN3突变 蛋白的表达需要的IC 5Q中至少约2_，2. 5_，3_，4_，5_，6_，7_，8_，9-或10倍差异）。
[0064] 本发明因此提供调节（例如，下调或抑制）表达该伸展的或突变的ATXN3蛋白 和/或mRNA的细胞（例如，表达突变ATXN3蛋白和/或mRNA的Purkinje细胞）中编码 伸展的或异常ATXN3蛋白和/或ATXN的mRNA，及尤其是包含或编码聚-谷氨酰胺伸展的 ATXN3mRNA的表达的方法。该方法包括给细胞施用本发明的寡核苷酸或缀合物（或另外使 该细胞与该寡核苷酸或缀合物接触），以下调或抑制所述细胞中ATXN3蛋白和/或mRNA的 表达。在一些实施方式中，细胞可为体外或体内哺乳动物细胞，诸如人细胞。例如，本发明 的寡核苷酸靶向编码伸展的或突变的ATXN3的核酸和特异性杂交于其基因产物，由此调节 伸展的或突变的ATXN3的表达。本发明的寡核苷酸可调节患SCA3的患者中野生型和/或 突变的ATXN3等位基因的表达。施用于患者（例如，人或哺乳动物），受试者（例如，人 或哺乳动物），和/或细胞（例如，人或哺乳动物）可体内，离体或体外发生。例如，在一 些实施方式中，药学可接受的制剂和/或药学可接受的载体或递送媒质中的寡核苷酸可直 接施用于患者的或受试者的身体，由本文所述的方法。或者，在一些实施方式中，寡核苷酸 可在它们被移出之后及在它们回到患者的或受试者的身体之前施用于细胞。在一些实施方 式中，细胞可在它们被移出之后及在它们回到患者的或受试者的身体之前维持在培养条件 下。
[0065] 短语"靶核酸"，如本文所用指称编码哺乳动物ATXN3的核酸（例如，mRNA)，及尤其 是指称编码突变的或异常ATXN3的核酸（例如，mRNA)。例如，在本文公开的是编码包含病 原性聚-谷氨酰胺伸展的ATXN3的靶核酸（例如，诸如由SEQ ID N0:4编码的）。适合的 靶核酸包括编码ATXN3的核酸或其天然存在的变体，及源于其的RNA核酸（例如，包含或对 应于SEQ ID N0:15?20的mRNA靶序列），优选mRNA，诸如前-mRNA，尽管优选成熟mRNA。 在一些实施方式中，（例如，当在研究或诊断情景中使用时）"靶核酸"可为源于以上DNA 或RNA核酸靶的cDNA或合成寡核苷酸。本发明的寡核苷酸能与靶核酸或与该靶核酸的基 因产物杂交。需知，在一些实施方式中，靶核酸序列是cDNA序列和像这样，对应于成熟mRNA 靶序列，尽管在cDNA序列中尿嘧啶可用取代胸苷。
[0066] 术语"其天然存在的变体"指称定义的分类群之内，诸如哺乳动物，诸如小鼠，猴 和优选人中天然地存在的ATXN3多肽或核酸序列的变体。一般而言，当说到多核苷酸的 "天然存在的变体"时，术语也可包括由染色体转位或复制见于染色体的编码基因组DNA 的ATXN3,及RNA，源于其的诸如mRNA的任何等位基因变体。例如，ATXN3的天然存在的变 体可包括G987C突变体，例如由SEQ ID N0:4编码，或其天然存在的变体（例如，SNP ID rsl2895357)。天然存在的变体也可包括源于ATXN3mRNA的可变剪接的变体。当说到特定 多肽序列时，术语也包括蛋白的天然存在的形式，其可因此，例如，由共翻译或翻译后修饰 加工（例如，信号肽切割，蛋白水解切割，糖基化，等）。
[0067] 【序列】
[0068] 在一些实施方式中，寡核苷酸包含对应于SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 4的核苷酸 序列，或SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:4的片段的反向互补体的连续的核苷酸序列或由其组 成。由此，寡核苷酸可包含选自下列的序列或由其组成：SEQ ID从):9，10，11，12，13或14，其 中所述寡核苷酸（或其连续的核苷酸部分）可针对选择的靶序列任选地具有1，2或3个错 配。在一些实施方式中，寡核苷酸可包含对应于编码包括G987C SNP和该SNP附近的核苷酸 的ATXN3序列区的核苷酸序列的反向互补体的连续的核苷酸序列或由其组成。例如，在一 些实施方式中，寡核苷酸可包含表1中鉴定的序列（即，SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 或 SEQ ID NO: 12)。寡核苷酸可互补于编码包括 G987C 突变的ATXN3的核酸（例如，mRNA)的区（例如，自G987C突变约1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10， 11，12,13,14,15,16,17,18,19, 20或更多核苷酸上游和/或下游的区），诸如表1中鉴定的 靶序列。例如，在一些实施方式中，寡核苷酸可互补于表1中鉴定的mRNA靶序列（例如，SEQ IDN0:13，SEQIDN0:14，SEQIDN0:15，SEQIDN0:16，SEQIDN0:17*SEQIDN0:18)。 在一些实施方式中，该互补寡核苷酸能与ATXN3的基因产物（即，ATXN3mRNA)和尤其是包 含G987C SNP的ATXN3的基因产物杂交（例如，特异性杂交）。
[0069] 表 1
[0070]
【权利要求】
1. 寡核苷酸，其与包含G987C单核苷酸多态性的SEQ ID N0:4的区杂交，其中寡核苷酸 调节ATXN3的表达。
2. 权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸调节编码伸展的ATXN3的核酸的表达。
3. 权利要求2的寡核苷酸，其中寡核苷酸选自：SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9，SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:19,SEQ ID N0:20,SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22 和 SEQ ID NO:23。
4. 权利要求2的寡核苷酸，其中寡核苷酸与选自下列的寡核苷酸具有至少80%同一 性：SEQIDN0:7，SEQIDN0:8，SEQIDN0:9，SEQIDN0:10，SEQIDN0:11和SEQIDN0:12。
5. 权利要求2的寡核苷酸，其中寡核苷酸是14个核苷酸长。
6. 权利要求2的寡核苷酸，其中寡核苷酸是至少15个核苷酸长。
7. 权利要求2的寡核苷酸，其中寡核苷酸是至少16个核苷酸长。
8. 权利要求2的寡核苷酸，其中寡核苷酸是至少18个核苷酸长。
9. 权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸能与包含G987C单核苷酸多态性的SEQ ID NO:4的区特异性地杂交。
10. 权利要求1的寡核苷酸，其中调节减少ATXN3的表达至少约50%。
11. 权利要求1的寡核苷酸，其中调节减少ATXN3的表达至少约75%。
12. 权利要求1的寡核苷酸，其中调节减少ATXN3的表达至少约90%。
13. 权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸不与编码野生型ATXN3的核酸杂交。
14. 权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸相对于野生型ATXN3的表达而优先调节伸展 的ATXN3的表达。
15. 权利要求9的寡核苷酸，其中寡核苷酸抑制伸展的ATXN3的表达。
16. 权利要求1的寡核苷酸，其中所述调节下调ATXN3的表达。
17. 权利要求1的寡核苷酸，其中所述调节相对于伸展的ATXN3的表达而上调野生型 ATXN3的表达。
18. 权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸不与包含SEQ ID NO: 1的核酸特异性杂交。
19. 权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸不在第987位与包含SEQ ID NO: 1的核酸杂 交。
20. 权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸与包含SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6的核 酸杂交。
21. 权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸还与相邻于G987C单核苷酸多态性的迭代 (CAG)n伸展的部分杂交。
22. 权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸在包含G987C单核苷酸多态性的区与包含 SEQ ID N0:4的核酸特异性杂交。
23. 权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸在第987位与包含SEQ ID NO: 4的核酸特异 性杂交。
24. 权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸是反义寡核苷酸。
25. 权利要求24的寡核苷酸，其中寡核苷酸选自：SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID N0:9,SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19, SEQ ID N0:20,SEQ ID N0:21,SEQ ID NO:22 和 SEQ ID NO:23。
26. 权利要求24的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含至少一个选自下列的糖修饰的核苷 酸：锁核酸（LNA)单元；2'-0-烷基-RNA单元，2'-OMe-RNA单元，2' -氨基-DNA单元和 2' -氣-DNA单兀。
27. 权利要求26的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含2个或更多LNA单体单元。
28. 权利要求27的寡核苷酸，其中寡核苷酸是间隔聚体。
29. 权利要求27的寡核苷酸，其中2个或更多LNA单体单元彼此毗邻。
30. 权利要求1的寡核苷酸，其中ATXN3的表达的调节恢复神经元功能。
31. 权利要求1的寡核苷酸用于治疗与伸展的ATXN3的表达关联的病情的用途。
32. 权利要求1的寡核苷酸用于治疗脊髓小脑共济失调3的用途。
33. 寡核苷酸，其包含SEQ ID N0:7,其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。
34. 寡核苷酸，其包含SEQ ID N0:8,其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。
35. 寡核苷酸，其包含SEQ ID N0:9,其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。
36. 寡核苷酸，其包含SEQ ID N0:10,其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。
37. 寡核苷酸，其包含SEQ ID N0:11，其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。
38. 寡核苷酸，其在包含G987C单核苷酸多态性的区与包含SEQ ID N0:4的核酸杂交， 其中寡核苷酸包含一个或更多LNA单体单元，且其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。
39. 权利要求38的寡核苷酸，其中寡核苷酸是14个核苷酸长。
40. 权利要求38的寡核苷酸，其中寡核苷酸是15个核苷酸长。
41. 权利要求38的寡核苷酸，其中寡核苷酸是16个核苷酸长。
42. 权利要求38的寡核苷酸，其中调节减少ATXN3的表达至少约50%。
43. 权利要求38的寡核苷酸，其中调节减少ATXN3的表达至少约75%。
44. 权利要求38的寡核苷酸，其中调节减少ATXN3的表达至少约90%。
45. 权利要求38的寡核苷酸，其中ATXN3包含突变的形式的ATXN3。
46. 权利要求45的寡核苷酸，其中调节抑制突变的形式的ATXN3的表达。
47. 权利要求46的寡核苷酸，其中突变的形式的ATXN3是伸展的ATXN3。
48. 权利要求47的寡核苷酸，其中寡核苷酸不调节野生型形式的ATXN3的表达。
49. 权利要求38的寡核苷酸，其中寡核苷酸在包含G987C单核苷酸多态性的区与包含 SEQ ID N0:4的核酸特异性杂交。
50. 权利要求38的寡核苷酸，其中寡核苷酸与包含SEQ ID N0:4的片段的核酸杂交，其 中片段包含核苷酸987。
51. 权利要求38的寡核苷酸，其中寡核苷酸在G987C单核苷酸多态性与包含SEQ ID NO:4的核酸特异性杂交。
52. 权利要求38的寡核苷酸，其中寡核苷酸是反义寡核苷酸。
53. 权利要求38的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含2个或更多LNA单体单元。
54. 权利要求53的寡核苷酸，其中寡核苷酸是间隔聚体。
55. 权利要求53的寡核苷酸，其中2个或更多LNA单体单元彼此毗邻。
56. 权利要求38的寡核苷酸，其中ATXN3的表达的调节恢复神经元功能。
57. 权利要求38的寡核苷酸用于治疗与异常ATXN3的表达关联的病情的用途。
58. 权利要求57的寡核苷酸的用途，其中与异常ATXN3的表达关联的病情是脊髓小脑 共济失调3。
59. 对于治疗脊髓小脑共济失调3有用的寡核苷酸，其中寡核苷酸与包含G987C单核苷 酸多态性的SEQ ID NO:4的区杂交，且其中寡核苷酸包含至少一个LNA单体单元。
60. 权利要求59的寡核苷酸，其中寡核苷酸是14个核苷酸长。
61. 权利要求59的寡核苷酸，其中寡核苷酸是15个核苷酸长。
62. 权利要求59的寡核苷酸，其中寡核苷酸是16个核苷酸长。
63. 权利要求59的寡核苷酸，其中寡核苷酸下调ATXN3的表达，且其中ATXN3包含病原 性聚-谷氨酰胺伸展。
64. 权利要求59的寡核苷酸，其中寡核苷酸是反义寡核苷酸。
65. 对于治疗脊髓小脑共济失调3有用的寡核苷酸，其中寡核苷酸在包含G987C单核苷 酸多态性的区与SEQ ID NO:4杂交，且其中寡核苷酸包含至少一个LNA单体单元。
66. 调节ATXN3mRNA的表达的方法，包括下列步骤：使ATXN3mRNA与权利要求1的寡核 苷酸在对于ATXN3mRNA与寡核苷酸杂交适当的条件下接触，由此调节ATXN3mRNA的表达。
67. 权利要求66的方法，其中ATXN3mRNA编码病原性聚-谷氨酰胺伸展，且其中调节 ATXN3的表达导致减少的ATXN3的表达。
68. 调节ATXN3的表达的方法，其中ATXN3包括病原性聚-谷氨酰胺伸展，其中方法包 括使一种或更多编码ATXN3的核酸与权利要求2的寡核苷酸在对于一种或更多核苷酸与寡 核苷酸杂交适当的条件下接触，由此调节ATXN3的表达。
69. 权利要求68的方法，其中调节ATXN3的表达导致减少的ATXN3的表达。
70. 治疗与异常ATXN3的表达关联的病情的方法，包括选择被诊断患该病情的受试者 及给受试者施用权利要求2的寡核苷酸。
71. 治疗与异常ATXN3的表达关联的病情的方法，包括选择被诊断患该病情的受试者 及给受试者施用权利要求38的寡核苷酸。
72. 寡核苷酸，其在包含G987C单核苷酸多态性的区与包含SEQ ID N0:4的核酸特异 性杂交，其中寡核苷酸包含至少一个LNA单体单元，且其中寡核苷酸不与包含SEQ ID NO: 1 的核酸特异性杂交。
73. 药物组合物，其包含对于治疗脊髓小脑共济失调3有用的寡核苷酸，其中寡核苷酸 在包含G987C单核苷酸多态性的区与包含SEQ ID NO: 4的核酸杂交，且其中寡核苷酸包含 至少一个LNA单体单元。
74. 权利要求73的药物组合物，其中寡核苷酸是反义寡核苷酸。
75. 权利要求73的药物组合物，其中组合物被配制用于脑室内施用。
76. 权利要求73的药物组合物，其中组合物被配制用于肠胃外施用。
77. 权利要求73的药物组合物，其中寡核苷酸通过在包含G987C单核苷酸多态性的区 与包含SEQ ID N0:4的核酸杂交来调节ATXN3的表达。
78. 权利要求77的药物组合物，其中寡核苷酸不与包含SEQ ID NO: 1的核酸杂交。
79. 权利要求73的药物组合物，其中寡核苷酸通过与包含SEQ ID N0:4的核酸在G987C 单核多态性特异性杂交来调节ATXN3的表达。
80. 权利要求79的药物组合物，其中寡核苷酸不与包含SEQ ID NO: 1的核酸特异性杂 交。
81. 寡核苷酸，其调节ATXN3的表达，其中寡核苷酸包含SEQ ID N0:12,且其中寡核苷 酸包含至少一个LNA单体单元。
82. 约14?20个核苷酸长的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含与包含G987C单核苷酸多态 性的SEQ ID N0:4的区的反向互补体具有至少80%同源性的核苷酸序列，或其天然存在的 变体。
83. 权利要求82的寡核苷酸，其中连续的核苷酸序列与SEQ ID N0:4的反向互补体包 含不多于一个错配，且其中错配不在第987位。
84. 权利要求82的寡核苷酸，其中核苷酸序列包含一个或更多核苷酸类似物。
85. 权利要求84的寡核苷酸，其中一个或更多核苷酸类似物是糖修饰的核苷酸。
86. 权利要求85的寡核苷酸，其中糖修饰的核苷酸选自：锁核酸（LNA)单元，2'-0-烷 基-RNA单元，2' -OMe-RNA单元，2' -氨基-DNA单元和2' -氟-DNA单元。
87. 权利要求84的寡核苷酸，其中一个或更多核苷酸类似物是LNA。
88. 权利要求82的寡核苷酸，其中寡核苷酸选自：SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21，SEQ ID N0:22 和 SEQ ID N0:23。
89. 权利要求82的寡核苷酸，其中寡核苷酸是间隔聚体。
90. 权利要求82的寡核苷酸，其中寡核苷酸抑制表达ATXN3mRNA的细胞中ATXN3mRNA 的表达，其中ATXN3mRNA编码病原性聚-谷氨酰胺伸展。
91. 权利要求90的寡核苷酸，其中ATXN3mRNA包含三-核苷酸重复（CAG)n，其中"η"大 于52。
92. 权利要求91的寡核苷酸，其中"η"等于或大于81。
93. 缀合物，其包含权利要求82的寡核苷酸和共价附接于寡核苷酸的至少一个非-核 苷酸部分。
94. 药物组合物，其包含权利要求82的寡核苷酸和药学可接受的稀释剂，载体，盐或佐 剂。
95. 权利要求82的寡核苷酸用于治疗脊髓小脑共济失调3的用途。
96. 治疗受脊髓小脑共济失调3影响的受试者的方法，所述方法包括给受试者施用权 利要求82的寡核苷酸的步骤，使得脊髓小脑共济失调3的一个或更多目标症状改善。
97. 权利要求96的方法，其中目标症状选自：减少的痉挛状态，增加的肌张力及改善的 步态。
98. 减少表达异常ΑΤΧΝ3的细胞中异常ΑΤΧΝ3的表达的方法，所述方法包括使所述细胞 与权利要求82的寡核苷酸接触的步骤，使得异常ΑΤΧΝ3的表达减少。
99. 权利要求98的方法，其中ΑΤΧΝ3包含病原性聚-谷氨酰胺伸展。
100. 治疗患脊髓小脑共济失调3的哺乳动物的方法，所述方法包括给所述哺乳动物 施用治疗有效量的靶向ΑΤΧΝ3的寡核苷酸，其中寡核苷酸与包含G987C单核苷酸多态性的 SEQ ID Ν0:4的区杂交，其中寡核苷酸包括一个或更多LNA单元，且其中ΑΤΧΝ3包含病原性 聚-谷氨酰胺伸展。
101. 权利要求100的方法，其中寡核苷酸包含选自下列的序列：SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21， SEQ ID NO:22 和 SEQ ID NO:23。
102. 权利要求100的方法，其中寡核苷酸肠胃外施用。
103. 权利要求100的方法，其中寡核苷酸静脉内施用。
104. 权利要求100的方法，其中寡核苷酸由推注施用于靶器官或组织。
105. 权利要求100的方法，其中寡核苷酸腹膜内施用。
106. 寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:19,其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。
107. 权利要求106的寡核苷酸，其中寡核苷酸与编码ATXN3的核酸杂交而形成具有至 少约65°C的解离的双联的结构。
108. 权利要求106的寡核苷酸，其中ATXN3包含G987C突变，且其中调节ATXN3的表达 包含抑制ATXN3的表达。
109. 权利要求108的寡核苷酸，其中寡核苷酸以约0. 3?约81 μ Μ之间的IC5(I浓度抑 制ATXN3的表达。
110. 权利要求106的寡核苷酸，其中寡核苷酸于37°C，在血楽中稳定至少约96小时。
111. 寡核苷酸，其包含SEQ ID N0:20,其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。
112. 权利要求111的寡核苷酸，其中寡核苷酸与编码ATXN3的核酸杂交而形成具有至 少约60°C的解离的双联的结构。
113. 权利要求111的寡核苷酸，其中ATXN3包含G987C突变，且其中调节ATXN3的表达 包含抑制ATXN3的表达。
114. 权利要求113的寡核苷酸，其中寡核苷酸以约0. 3?约81 μ Μ之间的IC5(I浓度抑 制ATXN3的表达。
115. 权利要求111的寡核苷酸，其中寡核苷酸于37°C，在血楽中稳定至少约96小时。
116. 寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:21，其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。
117. 权利要求116的寡核苷酸，其中寡核苷酸与编码ATXN3的核酸杂交而形成具有至 少约65°C的解离的双联的结构。
118. 权利要求116的寡核苷酸，其中ATXN3包含G987C突变，且其中调节ATXN3的表达 包含抑制ATXN3的表达。
119. 权利要求118的寡核苷酸，其中寡核苷酸以约0. 3?约81 μ Μ之间的IC5(I浓度抑 制ATXN3的表达。
120. 权利要求116的寡核苷酸，其中寡核苷酸于37°C，在血楽中稳定至少约96小时。
121. 寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:22,其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。
122. 权利要求121的寡核苷酸，其中寡核苷酸与编码ATXN3的核酸杂交而形成具有至 少约60°C的解离的双联的结构。
123. 权利要求121的寡核苷酸，其中ATXN3包含G987C突变，且其中调节ATXN3的表达 包括抑制ATXN3的表达。
124. 权利要求123的寡核苷酸，其中寡核苷酸以约0. 3?约81 μ Μ之间的IC5(I浓度抑 制ATXN3的表达。
125. 权利要求121的寡核苷酸，其中寡核苷酸于37°C，在血楽中稳定至少约96小时。
126. 寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:23,其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。
127. 权利要求126的寡核苷酸，其中寡核苷酸与编码ATXN3的核酸杂交而形成具有至 少约55°C的解离的双联的结构。
128. 权利要求127的寡核苷酸，其中ATXN3包含G987C突变，且其中调节ATXN3的表达 包含抑制ATXN3的表达。
129. 权利要求128的寡核苷酸，其中寡核苷酸以约0. 3?约81 μ Μ之间的IC5(I浓度抑 制ATXN3的表达。
130. 权利要求126的寡核苷酸，其中寡核苷酸于37°C，在血楽中稳定至少约96小时。
131. 寡核苷酸，其与包含SEQ ID NO: 18的核酸杂交，其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。
132. 权利要求131的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含SEQ ID NO: 12。
133. 寡核苷酸，其包含SEQ ID NO: 12,其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。
134. 权利要求133的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含至少一个核苷酸类似物，且其中核 苷酸类似物是锁核酸。
135. 寡核苷酸，其包含SEQ ID NO: 12,其中寡核苷酸调节ATXN3的表达，且其中寡核苷 酸在一个或更多选自下列的位置包含至少一个核苷酸类似物： (a) 在第1和3位的一个或更多的腺嘌呤核苷酸是氧基-LNA ; (b) 在第10位的鸟嘌呤核苷酸是氧基-LNA ; (c) 在第9和11位的一个或更多的胞嘧啶核苷酸是氧基-LNA ;以及 (d) 在第2位的胸腺嘧啶核苷酸是氧基-LNA。
136. 权利要求135的寡核苷酸，其中在第1和3位的腺嘌呤核苷酸是β-D-氧基-LNA， 其中在第2位的胸腺嘧啶核苷酸是β -D-氧基-LNA，其中在第9位的胞嘧啶核苷酸是C5-甲 基胞嘧啶，且其中全部核苷酸间连接基团是硫代磷酸酯核苷酸间连接基团。
137. 权利要求135的寡核苷酸，其中在第1位的腺嘌呤核苷酸是β -D-氧基-LNA，其 中在第9位的胞嘧啶核苷酸是C5-甲基胞嘧啶，且其中全部核苷酸间连接基团是硫代磷酸 酯核苷酸间连接基团。
138. 权利要求135的寡核苷酸，其中在第9和11位的胞嘧啶核苷酸均是C5-甲基胞嘧 啶，其中在第11位的胞嘧啶核苷酸是β-D-氧基-LNA，且其中全部核苷酸间连接基团是硫 代磷酸酯核苷酸间连接基团。
139. 权利要求135的寡核苷酸，其中在第10位的鸟嘌呤核苷酸是β-D-氧基-LNA，其 中在第11位的胞嘧啶核苷酸是β -D-氧基-LNA，其中在第9和11位的胞嘧啶核苷酸均是 C5-甲基胞嘧啶，且其中全部核苷酸间连接基团是硫代磷酸酯核苷酸间连接基团。
140. 权利要求135的寡核苷酸，其中在第9和11位的胞嘧啶核苷酸均是β-D-氧 基-LNA，其中在第10位的鸟嘌呤核苷酸是β -D-氧基-LNA，其中在第9和11位的胞嘧啶 核苷酸均是C5-甲基胞嘧啶，且其中全部核苷酸间连接基团是硫代磷酸酯核苷酸间连接基 团。
141. 权利要求135的寡核苷酸，其中至少一个核苷酸是独立地选自下列的修饰的核碱 基：5-甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-二氨基嘌呤， 2_二氨基嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-二氨基嘌呤胞嘧啶。
142. 权利要求135的寡核苷酸，其中氧基-LNA是β -D-氧基LNA。
143. 权利要求135的寡核苷酸，其中至少一个核苷酸间连接基团是硫代磷酸酯核苷酸 间连接基团。
144. 权利要求135的寡核苷酸，其中全部核苷酸间连接基团是硫代磷酸酯核苷酸间连 接基团。
145. 权利要求135的寡核苷酸，其用作药物。
146. 权利要求135的寡核苷酸，其用于治疗3型脊髓小脑共济失调（SCA3)。
147. 权利要求1的寡核苷酸，其用作药物。
148. 权利要求1的寡核苷酸，其用于治疗3型脊髓小脑共济失调（SCA3)。
【文档编号】C12N15/63GK104254610SQ201380013752
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年3月12日 优先权日:2012年3月12日
【发明者】N·乌斯卡特吉, M·黑特耶恩, J·B·R·海森 申请人:桑塔里斯制药公司