用于诊断和治疗癌症的涉及ros1融合的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本文公开用于检测受试者中癌症的存在并且评估用于所述癌症的治疗的功效的方法和组合物。所公开的方法使用实时聚合酶链式反应、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、原位杂交和/或多重聚合酶链式反应技术来检测ROS1的点突变、截短或融合的存在。
【专利说明】用于诊断和治疗癌症的涉及R0S1融合的方法和组合物
[0001] 本申请要求2012年2月8日提交的美国临时申请号61/596, 720的权益，所述临 时申请以引用的方式整体并入本文。 技术背景
[0002] 最近已经报道了 ROSl酪氨酸激酶的致癌融合发生在几种人癌症的亚群中，包括 非小细胞肺癌（NSCLC)、多形性成胶质细胞瘤（GBM)脑肿瘤以及胆管癌（胆道肿瘤）。表 达ROSl融合的癌细胞对与用于其增殖和存活的激酶的组成型活性嵌合形式相关的异常信 号传导"成瘾"。与这种对异常ROSl信号传导的依赖性一致，临床前研究已经证实ROSl驱 动的癌症与突变体激酶的药理学抑制剂非常敏感。小分子抑制剂目前正处于用于治疗患有 ROSl驱动的癌症的患者的研制阶段，但没有商业诊断测试可供用于可靠地且有效地诊断 ROSl融合阳性癌症。因此，需要的是满足这种需求的ROSl融合诊断测试。
[0003] 简述
[0004] 本文所公开的方法和组合物涉及以下的领域：检测或诊断疾病或病状如癌症；评 估与核酸变异、截短或基因融合相关的疾病或病状的易感性或风险；监测疾病进展；以及 确定对治疗性治疗的易感性或抗性。一方面，本文所公开的检测和诊断方法涉及检测和/ 或诊断ROSl融合相关的癌症。
[0005] 根据本发明的一个或多个目的（如本文所体现和概括描述的），一方面，本发明涉 及通过检测目标核酸内的核苷酸变异（如融合）来检测ROSl相关癌症的存在的方法，所述 方法包括对从来自患有癌症的受试者的组织样品提取的mRNA进行实时聚合酶链式反应、 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)和或实时RT-PCR，或对从自患有癌症的受试者提取的RNA 合成的cDNA进行PCR ;其中扩增产物的存在或扩增产物相对于对照物的增加指示核苷酸变 异、截短或过度表达的存在，从而检测癌症的存在。
[0006] 另一方面，本文公开将患有癌症的受试者诊断为患有ROSl相关癌症的方法，所述 方法进一步包括确定野生型ROSl和野生型ROSl激酶的循环阈值（Ct)值；其中野生型ROSl 相对于ROSl激酶的高（Ct)值指示融合的存在。
[0007] 另一方面，本文公开将患有癌症的受试者诊断为患有ROSl相关癌症的方法，所述 方法包括与融合断裂点的ROSl融合配偶体（partner)5'结合的正向引物和与融合断裂点 的ROSl 3'结合的反向引物，其中所述引物延伸穿过融合，其中检测到具有ROSl核酸和融 合配偶体核酸两者的扩增子的存在指示融合的存在。
[0008] 另一方面，本文公开将患有癌症的受试者诊断为患有ROSl相关癌症的方法，所述 方法包括a)使用与ROSl融合配偶体结合的正向引物的第一扩增反应；其中来自所述第一 反应的扩增子用作第二扩增反应的模板；b)在所述第一反应之后的第二扩增反应，其中对 于融合断裂点的ROSl序列3'具有特异性的引物用于第二扩增反应中；以及c)检测来自所 述第二反应的扩增子中ROSl的存在；其中在来自所述第二反应的扩增子中检测到ROSl指 示ROSl融合的存在。
[0009] 另一方面，本文公开通过检测目标核酸内的核苷酸变异（如融合）来检测ROSl相 关癌症的存在的方法，所述方法包括对来自患有癌症的受试者的组织样品进行荧光原位杂 交（FISH)，其中用于杂交的探针位于ROSl融合的断裂点的侧面，其中所述探针被不同地标 记，并且其中所述探针的分离指示ROSl相关癌症的存在。在基于FISH的检测方法的情况 下，紧密放置的杂交探针指示野生型RTK，例如像ROSl。
[0010] 另一方面，本文公开用于诊断ROSl相关癌症的试剂盒，所述试剂盒包括（a)用第 一检测试剂标记的第一引物，其中所述第一引物是反向引物，其中所述反向引物是与编码 SEQ ID NO 1的氨基酸序列的第一多核苷酸或其互补序列杂交的一个或多个多核苷酸；以 及（b)至少一个第二引物，其中所述第二引物是正向引物，其中所述正向引物是与编码野 生型ROSl的第二多核苷酸杂交的一个或多个多核苷酸。
[0011] 所公开方法和组合物的另外优点将在以下描述中部分阐述，并且将从描述中部分 地理解，或可以通过实践所公开的方法和组合物来习得。所公开方法和组合物的优点将借 助在所附权利要求书中特别指出的要素和组合来实现并且达成。应了解上文一般描述与下 文详细描述均仅仅是示例性和解释性的，并且不限制所要求的本发明。
[0012] 附图简述
[0013] 并入本说明书中并且构成本说明书的一部分的【专利附图】
【附图说明】所公开方法和组合物的 一些实施方案，并且与描述一起用于阐释所公开方法和组合物的原理。
[0014] 图1示出在由于融合激酶的产生所致的肿瘤发生中涉及的受体酪氨酸激酶（RTK) 的示意性图示。所述图示出正常的跨膜RTK。在各RTK下方以红色示出的蛋白质与所述激 酶形成组成型活性致癌融合。
[0015] 图2示出代表性ROSl融合激酶，CD74-R0S1融合激酶。（A)人CD74(5q32)和 R0SU6q22)基因的染色体位置。在NSCLC中，涉及染色体5和6的相互平衡的重排在两种基 因内在断裂之后发生以便形成⑶74-R0S1融合。（B)正常⑶74和ROSl蛋白以及通过t (5; 6) (q32 ;q22)染色体重排产生的⑶74-R0S1融合蛋白的示意性图示。
[0016] 图3示出NSCLC中的ROSl融合。转录物的示意图通过具有ROSl基因的染色体易 位产生。外显子位置被指示来证实融合构型的多样性。
[0017] 图4示出ROSl断裂FISH测定。将位于ROSl基因内的断裂点位置（在所述位置 处发生染色体重排以产生人癌症中的ROSl融合基因（上部示意图））侧面的基因组DNA克 隆用绿色或红色荧光染料不同地标记，然后与来自正常外周血淋巴细胞的间期细胞核和中 期染色体（左下图）或SLC34A2-R0S1-阳性NSCLC细胞系（右下图）杂交。
[0018] 图5示出Insight ROSl Fusion Screen方法论。测定在高温下使用融合特异性 反转录（FS-RT)以便防止反转录酶的混杂（promiscuity)以引发来自位于RNA转录物内的 茎-环结构的cDNA合成。通过在高温下进行测定，这些结构在延长过程期间被最小化并且 使第一链cDNA的产生仅限制于ROSl融合。然后使第一链反应经受RNA酶消化以便去除可 能允许在下游PCR检测阶段中非特异性扩增的所有RNA。融合特异性cDNA然后用作通用下 游ROSl激酶定量PCR(qPCR)测定的模板。多重ROSl融合可通过在反转录阶段过程中使多 个FS-RT引物多重反应来靶向。这种FS-RT引物混合物可容易地进行修饰以便捕获新鉴别 的致癌融合，而无需增加用于监测的引物的数目，从而维持反应的特异性和高通量容量。
[0019] 图 6 示出 Insight ROSlFusion Screen?。ROSl cDNA、癌症相关的 ROSl 融合中断 裂点的位置以及用于实时qPCR测定的PCR引物组的近似位置的示意性图示。指示野生型 ROSl表达的正常水平、野生型ROSl过表达或ROSl融合的存在的Ct值在下部图中示出。
[0020] 图7示出Insight ROSl Screen? v2。R0S1RNA、癌症相关的ROSl融合中断裂点的 位置以及用于cDNA合成的引物的近似位置的示意性图示。还针对反应的cDNA合成后qPCR 检测阶段示出ROSl模板特异性激酶反应的位置。蓝色箭头指示SLC34A2 cDNA引物的相对 位置并且红色箭头指示近似于实际ROSl易位的⑶74特异性cDNA引物的相对位置。
[0021] 详述
[0022] 在公开并且描述本发明化合物、组合物、制品、装置和/或方法之前，应了解除非 另外规定，否则其不限于特定合成方法或特定重组生物技术方法，或除非另外规定，否则不 限于具体试剂，因为此类项目当然可变化。还应理解本文使用的术语仅出于描述具体实施 方案的目的并且不意图具有限制性。
[0023] 除非上下文另外明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式 "一个"、"一种"和"所述（the) "包括复数指示物。因此，例如，提及"药物载体"包括两个或 更多个这类载体的混合物等。
[0024] 在本文中，范围可表达为从"约"一个特定值和/或至"约"另一个特定值。当表示 这类范围时，另一个实施方案包括从所述一个特定值和/或到所述另一个特定值。类似地， 在通过使用先行词"约"将值表示为近似值时，应了解具体值形成另一个实施方案。应进一 步了解每个范围的端点相对于另一个端点，并且与另一个端点无关地均为有效的。还应理 解，本文公开了多个值，并且在本文中每个值除所述值本身之外也公开为"约"所述特定值。 例如，如果公开了值"10"，那么也公开了"约10"。还应理解，当一个值被公开时，那么还公 开了"小于或等于"所述值、"大于或等于所述值"和介于值之间的可能范围，如本领域技术 人员所恰当地理解。例如，如果公开了值"1〇"，那么还公开了 "小于或等于1〇"以及"大于 或等于10"。还应了解在整个申请中，数据以多个不同格式来提供，并且此数据代表端点和 起始点，和数据点的任何组合的范围。例如，如果公开具体数据点"10"和具体数据点15,应 了解认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及10与15之间。
[0025] 在本说明书和以下权利要求书中，提及多个术语，所述术语应被定义为具有以下 含义：
[0026] "任选"或"任选地"意指随后描述的事件或情况可发生或可未发生，并且描述包括 其中所述事件或情况发生的情况和其中它未发生的情况。
[0027] "增加"可以指相对于对照物产生更大量的组合物或化合物（如扩增产物）的任何 变化。因此，例如，扩增产物的量的增加可包括但不限于10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%、90%、或100%增加。本文进一步考虑，检测到0嫩、11^離或蛋白质相对于对照 物的表达或丰度的增加必然包括在所述DNA、mRNA或蛋白质不存在于对照物中的情况下检 测到所述DNA、mRNA或蛋白质的存在。
[0028] "获得组织样品（obtaining a tissue sample) " 或"获得组织样品（obtain a tissue sample)"意指从受试者收集组织样品或测量受试者中的组织。应了解并且本文考 虑组织样品可通过本领域已知的任何手段包括创伤性和非创伤性技术来获得。还应了解测 量方法可以是直接的或间接的。获得或测量组织样品的方法的实例可以包括但不限于，组 织活检、组织灌洗、抽吸、组织拭子、脊椎穿刺、磁共振成像（MRI)、计算机断层摄影（CT)扫 描、正电子发射断层术（PET)扫描、以及X-射线（有或无造影剂）。
[0029] DNA中已知位点处的突变的灵敏检测可用现有技术容易地进行。等位基因特异 性引物可以被设计成靶向已知位置处的突变，以使得其信号可以优先地在野生型DNA上扩 增。不幸的是，这在可能在靶序列中的任何位置（碱基）处发生的未知突变的情况下是不 可能的。
[0030] 应了解并且本文考虑，组织样品可来自体内的任何组织。因此，如本文所用，"组 织"是指血液、神经组织（例如，脑组织或脊髓组织）、淋巴组织、肝组织、脾组织、肺组织、心 脏组织、胃组织、肠组织、胰组织、来自甲状腺、唾液腺、关节以及皮肤的组织。应了解，组织 样品可仅包括来自靶组织的单个细胞或组分。例如，组织样品可以是外周血单核细胞、B细 胞、T细胞、巨噬细胞、红细胞、血小板或其它血细胞。类似地，细胞可以是上皮细胞、肝细胞、 神经元细胞或其它细胞。
[0031] 检测ROSl相关癌症的方法
[0032] 所公开的方法一方面涉及以下的方法：检测或诊断疾病或病状如ROSl相关癌症 (例如像，非小细胞肺癌（NSCLC)、成胶质细胞瘤或胆管癌）的存在，评估疾病或病状如ROSl 相关癌症（例如像，NSCLC、成胶质细胞瘤或胆管癌）的易感性或风险，监测疾病或病状如 ROSl相关癌症（例如像，NSCLC、成胶质细胞瘤或胆管癌）的进展，以及在之前被诊断为患 有癌症的受试者中确定对于疾病或病状如ROSl相关癌症（例如像，NSCLC、成胶质细胞瘤或 胆管癌）的治疗性治疗的易感性或抗性，所述方法包括获得组织样品，检测来自受试者的 组织样品的ROSlmRNA的存在或测量所述ROSlmRNA的表达水平；其中扩增产物的量相对于 对照物的增加或仅检测到扩增子指示癌症的存在，并且其中所述癌症与ROSl的核酸变异、 截短或基因融合相关（即ROSl相关癌症）。在另一个实施方案中，检测或诊断疾病或病状 如ROSl相关癌症的存在可使用原位杂交来完成，其中在基因的断裂点（即与癌症中的另一 个基因融合的位点）侧面的探针的分离指示ROSl相关癌症的存在。在另一实施方案中，
[0033] 原癌基因酪氨酸蛋白激酶ROS前体（ROSl)
[0034] 受体酪氨酸激酶（RTK)是细胞信号转导途径的重要调节因子，其通过调节细胞增 殖、分化、迁移以及死亡而在正常发育中起关键作用。通过各种遗传改变进行的RTK信号传 导的微扰可导致失调的激酶活性以及随后的恶性转化（图1)。
[0035] 对所有58种已知的人RTK的激酶结构域的种系发生关系分析证实ROSl是与间变 性淋巴瘤激酶/白细胞酪氨酸激酶（ALK/LTK)以及胰岛素受体（INSR)家族远缘相关的不 同受体。ROSl是果蝇无七（sevenless)受体酪氨酸激酶（无七的受体，还称为R0S)的孤 (即，对于其来说配体仍然有待确定）脊椎动物对应受体，其当被其配体BOSS (无七的新娘 (bride of sevenless))激活时造成发育蝇复眼中的R7光受体的分化。在Rosi-null小鼠 中所观察到的唯一异常涉及由于与支持精母细胞分化的附睾的上皮（其中表达R0S)的无 能相关的精子功能缺陷所致的雄性不育症的情况下，哺乳动物ROS的功能似乎在很大程度 上是非必要的。不同于白细胞酪氨酸激酶（LTK)，ROS是与ALK最高度相关的受体酪氨酸激 酶。
[0036] 最近，已经描述了 ROSl的三种自然发生的致癌型式。在2003年，在人成胶质细胞 瘤细胞系中发现了关于染色体6q21的中间微缺失，其导致被称为FIG(在成胶质细胞瘤中 融合的）的新颖基因与编码ROSl的细胞内部分的序列之间的融合事件。FIG-ROSl在基因 工程化的成年小鼠的CNS中的实验增强的表达导致多形性成胶质细胞瘤肿瘤的形成，从而 证实了这种融合激酶的致癌活性。描述成胶质细胞瘤脑肿瘤中的FIG-ROSl融合的准确发 生率的详细临床研究尚有待报道。FIG-ROSl融合不仅仅局限于成胶质细胞瘤；在2011年， 这种嵌合激酶被展示也在胆管癌（胆道癌）中表达，存在于8. 7% (23个中的2个）原发性 肿瘤样本中。如成胶质细胞瘤和NSCLC，患有胆管癌的患者的预后-其是第二最常见的原发 性肝癌-非常差，中位存活期小于两年。
[0037] 在2007年，在NSCLC中首次报道两种新颖的ROSl融合；染色体间易位被展示在 NSCLC细胞系和患者肿瘤两者中均导致SLC34A2和⑶74基因与ROSl的细胞外近膜部分的 融合（作为实例，CD74-R0S1融合在图2中示出）。在成胶质细胞瘤、胆管癌以及NSCLC中 FIG、CD74、SLC34A2、TPM3、SDC4、EZR、以及LRIG3的N-末端部分与ROSl激酶结构域的融合 导致驱动肿瘤生长的组成型激酶活性（图3)。与这些ROSl融合作为致癌驱动突变的作用 一致，SLC34A2-R0S1的siRNA介导的下调诱导人NSCLC细胞的细胞调亡。类似地，用ROSl 小分子抑制剂治疗由FIG-ROSl表达在实验上致使肿瘤发生的细胞与稳健肿瘤细胞杀死相 关。
[0038] 虽然不如NSCLC中的EGFR或ALK RTK突变那么常见，ROS融合是明显复发的-在 最近的研究中，2. 6% (17/656)的NSCLC样本展示通过免疫组织化学和FISH为ROSl融合 阳性的，并且从未在同一肿瘤中观察到ALK和ROSl融合。此外，肿瘤样本的几个独立分析 已经揭示了 20%至30%的NSCLC中ROSl的显著升高的表达，从而支持激酶在肺癌症发病 机理中的更广泛的作用。然而另外的恶性肿瘤可由异常ROSl信号传导驱动；例如在30% 至40%的成胶质细胞瘤外科肿瘤中发现了高水平的ROSl表达，并且已经在结肠直肠和肾 癌细胞系中鉴别了 ROSl突变。用于检测肿瘤中ROSl融合的存在的有效和可靠的诊断测 试的商业可用性将极大地促进翻译研究以便针对这些突变描述其它癌症，同时还提供特定 癌症的更有效和成本更低的诊断，并且使能够使用这种突变体激酶的抑制剂实现患有ROSl 融合阳性肿瘤的患者的更有效和成本更低的个体化治疗。
[0039] 因此，虽然已知的ROSl融合不代表这种酪氨酸激酶的最常见的突变，但它们仍占 酪氨酸激酶融合相关癌症的相当大的比例，其重要性随着另外融合配偶体的鉴别而增加。 这类融合包括但不限于成胶质细胞瘤（FIG)-ROSl、SLC34A2-R0S1、TPM3-R0S1、SDC4-R0S1、 EZR-R0S1、LRIG3-R0S1、以及CD74-R0S1中的融合。已经在胆管癌、非小细胞肺癌（NSCLC) 以及成胶质细胞瘤中发现了所有三种融合。因此，一方面，本文公开以下的方法：检测或诊 断疾病或病状如ROSl相关癌症；评估发展疾病或病状如ROSl相关癌症的易感性或风险； 监测ROSl相关癌症的疾病进展；以及在患有癌症的受试者中确定对于ROSl相关癌症的治 疗性治疗的易感性或抗性，所述方法包括检测来自受试者的组织样品中ROSl扩增子的存 在或测量所述ROSl扩增子的量，其中核酸的存在或核酸相对于对照物的增加指示ROSl相 关癌症（如具有ROSl融合的癌症）的存在。如本文所用，"R0S-1相关癌症"是指其中ROSl 通过ROSl融合、过表达、突变或其它机制的存在而失调的任何癌症。
[0040] 一方面，所公开的方法可通过定量PCR(qPCR)测定完成。因此，一方面，本文公开 检测（即，诊断）患有癌症的受试者中ROSl相关融合的存在，所述方法包括获得组织样品， 从所述样品分离核酸，对从来自受试者的组织样品分离的核酸进行PCR，其中qPCR测定的 引物包含对ROSl激酶具有特异性的引物对和对融合断裂点的wt R0S15'具有特异性的引 物对；并且其中确定循环阈值（Ct)值；并且其中野生型ROSl (例如，ROSl的细胞外结构域 (ECD))相对于ROSl激酶的高（Ct)值指示融合、并且因此ROSl相关癌症的存在。或者，本 文公开涉及qPCR的方法，所述方法不涉及测量Ct值，但包括与融合断裂点的ROSl融合配 偶体5'结合的正向引物，与融合断裂点的R0S13'结合的反向引物，其中所述引物延伸穿过 融合，其中检测具有ROSl和融合配偶体核酸两者的扩增子的存在指示融合、并且因此ROSl 相关癌症的存在。因此，所公开的方法可用于诊断ROSl相关癌症。
[0041] 应了解并且本文考虑，在从受试者去除组织样品之后，可从所述组织的细胞分离 核酸（例如，DNA或RNA如mRNA)。因此，另一方面，所公开的方法包括获得组织样品并且 从所述组织样品分离核酸。例如，所述方法可包括取得肺组织活检或痰样品并且从所述样 品分离mRNA。应进一步了解在从所述组织样品分离mRNA的情况下，可以从所述mRNA合成 cDNA并且对所述cDNA进行PCR(例如，作为RT-PCR反应的一部分）。因此，一方面，本文 公开诊断患有癌症的受试者中ROSl相关癌症的方法，所述方法包括从所述受试者获得组 织样品，从所述组织样品分离核酸（例如mRNA)，对所述核酸进行RT-PCR、实时PCR、或实时 RT-PCR，以及检测所述组织样品中与野生型ROSl (例如像，ROSl的E⑶）和ROSl激酶结构域 中的一个或组合相关的核酸的存在或测量所述核酸的量，其中所述PCR、RT-PCR、实时PCR、 或实时RT-PCR反应包括使用与野生型ROSl序列特异性杂交的正向和反向引物对（例如 像，与ROSl的细胞外结构域（ECD)如SEQ ID NO :13、14、20以及21杂交的引物），和/或 与野生型ROSl激酶结构域序列（例如像，SEQ ID NO :4、5、7、8、15、16、17以及18)特异性 杂交的正向和反向引物对，以及检测所述组织样品中与野生型ROSl和ROSl激酶结构域两 者之一或两者的组合相关的核酸的存在或测量所述核酸的量，其中扩增子相对于正常对照 物的增加或扩增子的存在指示所述受试者患有ROSl相关癌症。还公开诊断患有癌症的受 试者中ROSl相关癌症的方法，所述方法包括从所述受试者获得组织样品，从所述组织样品 分离核酸，其中来自所述组织样品的核酸为RNA，其中所述方法进一步包括从所述RNA样品 合成cDNA，对所述cDNA进行PCR ;以及检测所述组织样品中与野生型ROSl (例如像，ROSl 的ECD)和ROSl激酶结构域两者之一或两者的组合相关的核酸的存在或测量所述核酸的 量，其中扩增子相对于正常对照物的增加或扩增子的存在指示所述受试者患有ROSl相关 癌症。还公开所公开的方法可进一步包括确定循环阈值（Ct)值，其中野生型ROSl相对于 ROSl激酶的高（Ct)值指示融合、并且因此ROSl相关癌症的存在；或将扩增子与标记的探 针相接触以用于检测和测量扩增子的量，所述探针与所述扩增子的序列互补。
[0042] 在另一种替代方法中，通过使用两步检测的qPCR方法来检测ROSl融合，其中在第 一反应中仅使用与ROSl融合配偶体结合的正向引物，并且其中在所述第一反应之后的第 二反应中，来自所述第一反应的扩增子用作第二扩增、基于探针的检测或测序反应的模板， 其中所使用的探针或引物对融合断裂点的ROSl 3'具有特异性，并且其中在来自所述第二 反应的扩增子中检测到ROSl指示融合。此外，公开诊断患有癌症的受试者中ROSl相关癌症 的方法，所述方法包括从所述受试者获得组织样品，从所述组织样品分离核酸，使用与ROSl 融合配偶体结合的正向引物进行第一扩增反应；其中来自所述第一反应的扩增子用作第二 扩增反应的模板；在所述第一反应之后进行第二扩增反应，其中对于融合断裂点的ROSl序 列3'具有特异性的引物用于所述第二扩增反应中；以及c)检测来自所述第二反应的扩增 子中ROSl的存在；其中在来自所述第二反应的扩增子中检测到ROSl指示ROSl融合的存 在；以及检测所述组织样品中与ROSl激酶结构域相关的核酸的存在，其中扩增子的存在指 示所述受试者患有ROSl相关癌症。如以上所描述的方法一样，这种两步检测可进一步包括 确定C(t)值或将扩增子与标记的探针相接触，所述探针与所述扩增子互补。
[0043] 应了解并且本文考虑另外qPCR测定方法可用于得到相同信息。例如，一方面，本 文公开一种检测ROSl相关融合的存在的等位基因特异性方法，所述方法包括对来自受试 者的组织样品进行qPCR，其中用于所述qPCR测定的引物包含对于ROSl激酶具有特异性的 反向引物和结合ROSl融合配偶体的融合断裂点的5'的正向引物；并且其中跨所述融合断 裂点读取的扩增子的存在指示融合的存在，并且因此指示ROSl相关癌症。应了解在这种方 法中，将存在从反向引物或正向引物得到的扩增子，但因为这类扩增将仅从单向引物产生， 所以信号将显著小于来自融合事件的信号。此外，这类扩增子的大小将不同于融合扩增子 的大小，因为正向引物将仅扩增融合配偶体的剩余部分并且反向引物将仅扩增所使用的反 向ROSl激酶引物的ROSl 5'的部分。
[0044] 另一方面，本文公开通过检测目标核酸内的核苷酸变异（如融合）来检测ROSl相 关癌症的存在的方法，所述方法包括对来自患有癌症的受试者的组织样品进行荧光原位杂 交（FISH)，其中用于杂交的探针位于ROSl融合的断裂点的侧面，其中所述探针被不同地标 记，并且其中所述探针的分离指示ROSl相关癌症的存在。在基于FISH的检测方法的情况 下，紧密放置的杂交探针指示野生型RTK，例如像ROSl。
[0045] ROSl融合与几种已知的癌症类型相关。应了解一种或多种ROSl融合可与特定癌 症相关。应进一步了解，存在与ROSl融合相关的几种类型的癌症，包括但不限于间变性大 细胞淋巴瘤（ALCL)、成神经细胞瘤、乳癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、胆管癌、非小细 胞肺癌（NSCLC)、弥散性大B细胞淋巴瘤、食管鳞状细胞癌、间变性大细胞淋巴瘤、成神经细 胞瘤、炎性肌纤维母细胞瘤、恶性组织细胞增生症以及成胶质细胞瘤。因此，一方面，本文公 开诊断R0S-1相关癌症的方法，其中所述癌症是NSCLC、成胶质细胞瘤或胆管癌。还公开确 定对用针对R0S-1相关癌症的ROSl抑制剂治疗性治疗的易感性或抗性的方法，其中所述癌 症是NSCLC、成胶质细胞瘤或胆管癌。一方面，受试者应被理解为先前已被诊断患有癌症，例 如像NSCLC、成胶质细胞瘤或胆管癌。
[0046] 最近研究显示，用小分子药物候选物抑制受体酪氨酸激酶（RTK)的这些突变体形 式消除这种异常细胞增殖并且促进成神经细胞瘤和其它RTK驱动的肿瘤细胞系中的细胞 凋亡。这些发现突出了对于RTK突变的专门化的诊断测试的需要，所述测试为将具有多种 临床应用的测试。例如，这种测定可用于筛选受遗传性成神经细胞瘤影响的家庭中的儿童 以帮助促进在早期阶段检测肿瘤，此时它们更易于进行治疗。RTK介导的癌症的早期检测和 诊断显著增加患者群体内的存活率。一方面，本文公开检测或诊断疾病或病状如癌症（例 如ROSl相关癌症）的存在的方法，所述方法包括检测来自受试者的组织样品的与野生型 ROSl核酸或其变异、截短或融合相关的DNA、cDNA或mRNA的存在或测量所述DNA、cDNA的 水平或mRNA的表达水平；其中ROSl激酶的扩增产物的量相对于对照物增加而不存在野生 型ROSl的相应增加指示ROSl相关癌症的存在。
[0047] 因此，一方面，在无相应ROSl野生型序列的情况下检测到ROSl激酶序列或相对 于ROSl野生型序列的丰度指示ROSl融合序列的存在，并且因此癌症的存在。因此，本文公 开诊断受试者中ROSl相关癌症的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的组织样品中 mRNA的存在或测量所述mRNA的表达水平；其中所述mRNA对于ROSl融合具有特异性；并且 其中mRNA的量相对于对照物的增加指示ROSl相关癌症的存在。
[0048] 应了解并且本文考虑，所公开的诊断和确定对ROSl抑制剂治疗的易感性或抗性 的方法不仅可以用于之前未被诊断患有癌症的受试者以便鉴别所述受试者是否患有癌症， 而且特异性地用于之前已被诊断患有癌症的受试者，并且所述方法用于诊断所述癌症是特 异性地ROsl相关的或对治疗易感的和因此不用于诊断癌症但用于确定受:试者中的已知癌 症是否是ROSl相关的或对用ROSl抑制剂治疗易感的。
[0049] 还应了解并且本文考虑，ROSl相关癌症的原因可能不仅是由于野生型ROSl的失 调或已知的ROS1融合，而且由于一种或多种未鉴别的ROS1融合。仅能够检测已知融合的方 法将不能检测之前未知的融合或ROSl的突变。通过不仅检测ROSl的截短、核酸变异、ROSl 融合和/或野生型ROSl的存在，而且检测ROSl激酶活性或ROSl激酶扩增子的存在，本领 域技术人员可确定所述癌症是否是由于失调的野生型R0S1、已知的ROSl融合或之前未鉴 别的ROSl融合或ROSl的突变。因此，本文公开用于以下的方法：诊断ROSl相关癌症，评 估癌症的易感性或风险，或检测ROSl的失调的存在和/或野生型ROSl的存在，并且进一步 包括检测ROSl激酶活性的存在。因此，例如，本文公开诊断患有癌症的受试者中ROSl相关 癌症的方法，所述方法包括检测受试者中来自组织样品的与ROSl融合、野生型ROSl和/或 ROSl激酶结构域相关的核酸的存在。应了解并且本文考虑，在本文所公开方法的一方面， 可以测试单独野生型ROSl和ROSl激酶的存在或增加。在这种方面，野生型ROSl和ROSl 激酶的存在或其扩增相对于对照物的增加可指示ROSl的失调，所述ROSl的失调可涉及在 不是由于融合事件的R0S-1相关癌症中。相对于对照物无变化指示ROSl未涉及在癌症中。 相比之下，仅ROSl激酶的存在或相对于对照物的扩增指示ROSl融合。例如，在测量循环阈 值（Ct)值的测定中，应了解循环阈值是基于内部对照物的相对值并且高Ct指示低表达水 平。因此，应了解，在野生型ROSl引物对和ROSl激酶引物对两者的Ct值均相对于内部对 照物较高并且未在统计学上显著不同于彼此的情况下，观察到正常ROSl表达。在野生型和 ROSl激酶两者Ct值均较低（即，表达水平较高），但激酶和野生型引物对之间不存在统计 学上显著的差异的情况下，ROSl为过表达的。在其中ROSlCt值相对于ROSl激酶Ct值较 高（即，低表达）的测定中，存在ROSl融合。
[0050] 在诊断ROSl相关癌症的替代方法中，所述方法可包括第一扩增反应，其中仅使用 与融合断裂点的ROSl融合配偶体5'结合的正向引物产生扩增子。所述扩增子用作模板以 用于使用对于融合断裂点的ROSl 3'具有特异性的引物或探针进行测序、扩增或基于探针 的检测。扩增子中ROSl的存在指示ROSl融合、并且因此ROSl相关癌症的存在。
[0051] 因此，如以上所公开，本文公开诊断患有癌症的受试者中ROSl相关癌症的方法， 所述方法包括对来自所述受试者的核酸进行第一基于PCR的反应，并且对来自所述第一反 应的扩增子进行第二基于PCR的反应、测序反应或基于探针的检测，其中来自第一 PCR反应 的引物是与融合断裂点的ROSl融合配偶体5'结合的正向引物，其中所述第二PCR反应或 检测中使用的任何引物或探针对于融合断裂点的3'中的ROSl (例如SEQ ID NO :4、5、7、8、 15、16、17以及18)具有特异性，并且其中来自所述第一反应的扩增子中ROSl的存在指示 ROSl融合并且因此ROSl相关癌症的存在。
[0052] 另一方面，本文公开诊断患有癌症的受试者中ROSl相关癌症的方法，所述方法包 括对来自所述受试者的核酸进行基于PCR的反应，其中正向引物对ROSl融合配偶体具有特 异性并且结合融合断裂点的5'，并且反向引物对ROSl具有特异性并且结合融合断裂点的 3'，其中检测到含有ROSl和ROSl融合配偶体的扩增子指示ROSl相关癌症的存在。
[0053] 或者，在FISH用作检测测定的情况下，与位于ROSl的断裂点侧面的序列杂交的单 独间隔的探针的存在指示融合事件并且因此癌症的存在。
[0054] 应了解并且本文考虑，一旦使用任何上述诊断方法检测到ROSl相关癌症或诊断 其存在，所述方法然后就可进一步包括向患有ROSl相关癌症的受试者施用ROSl抑制剂。
[0055] -方面，本文公开用于诊断患有癌症的受试者中ROSl相关癌症的方法，所述方法 包括检测ROSl激酶活性的存在。因此，例如，本文公开诊断患有癌症的受试者中ROSl相 关癌症的方法，所述方法包括从所述受试者获得组织样品，从所述组织样品分离核酸，对所 述核酸进行RT-PCR、实时PCR、或实时RT-PCR，以及检测所述组织样品中与野生型ROSl和 ROSl激酶结构域相关的核酸的存在或测量所述核酸的量，其中所述RT-PCR或实时PCR反 应包括使用与野生型ROSl序列（例如，SEQ ID NO :13、14、20以及21)特异性杂交的正向 和反向引物对以及与野生型ROSl激酶结构域序列（例如，SEQ ID SO :4、5、7、8、15、16、17 以及18)特异性杂交的正向和反向引物对中的一种或其组合，以及检测所述组织样品中与 野生型ROSl和ROSl激酶结构域两者之一或两者的组合相关的核酸的存在或测量所述核酸 的量，其中扩增子相对于正常对照物的增加或扩增子的存在指示所述受试者患有ROSl相 关癌症。不存在扩增子或扩增子水平等于正常对照物指示癌症是ROSl相关癌症。还公开 用于诊断患有癌症的受试者中ROSl相关癌症的方法，所述方法包括从所述受试者获得组 织样品，从所述组织样品分离核酸，其中来自所述组织样品的核酸为RNA，其中所述方法进 一步包括从所述RNA样品合成cDNA，对所述cDNA进行PCR ;以及检测所述组织样品中与野 生型ROSl和ROSl激酶结构域两者之一或两者的组合相关的核酸的存在或测量所述核酸的 量，其中扩增子相对于正常对照物的增加或扩增子的存在指示所述受试者患有ROSl相关 癌症。另一方面，所公开的方法可使用与具有实时RT-PCR的产物的序列（例如，SEQ DI NO: 6、8、19以及22)互补的探针，或所述方法可包括确定野生型ROSl和野生型ROSl激酶的循 环阈值（Ct)值；其中野生型ROSl相对于ROSl激酶的高（Ct)值指示融合的存在。当癌症 被确定为ROSl相关癌症时，还公开以下方法：所述方法进一步包括向患有对ROSl抑制剂治 疗易感的癌症的受试者施用ROSl抑制剂。相反，在癌症不是rOSl相关癌症的情况下，所述 方法可进一步包括使用不同于ROSl抑制剂的治疗形式来治疗患有所述癌症的受试者。
[0056] 在用于诊断患有癌症的受试者中ROSl相关癌症的另一种替代方法中，通过使用 两步检测的qPCR方法来检测ROSl融合，其中在第一反应中仅使用与ROSl融合配偶体结合 的正向引物，并且其中在所述第一反应之后的第二反应中，来自所述第一反应的扩增子用 作第二扩增、基于探针的检测或测序反应的模板，其中所使用的探针或引物对融合断裂点 的ROSl 3'具有特异性，并且其中在来自所述第二反应的扩增子中检测到ROSl指示融合并 且因此指示ROSl相关癌症。此外，公开用于诊断患有癌症的受试者中ROSl相关癌症的方 法，所述方法包括从所述受试者获得组织样品，从所述组织样品分离核酸，使用与ROSl融 合配偶体结合的正向引物进行第一扩增反应；其中来自所述第一反应的扩增子用作第二扩 增反应的模板；在所述第一反应之后进行第二扩增反应，其中对于融合断裂点的ROSl序列 3'具有特异性的引物用于所述第二扩增反应中（例如，SEQ ID勵：4、5、7、8、15、16、17以及 18);以及检测来自所述第二反应的扩增子中ROSl的存在；其中在来自所述第二反应的扩 增子中检测到ROSl指示ROSl融合并且因此ROSl相关癌症的存在。当癌症被确定为ROSl 相关癌症时，还公开以下方法：所述方法进一步包括向患有对ROSl抑制剂治疗易感的癌症 的受试者施用ROSl抑制剂。相反，在癌症不是rOSl相关癌症的情况下，所述方法可进一步 包括使用不同于ROSl抑制剂的治疗形式来治疗患有所述癌症的受试者。
[0057] 本文还公开诊断受试者中ROSl相关癌症的方法，所述方法包括将细胞中的核酸 与和ROSl激酶杂交的第一探针和与ROSl的融合断裂点的ROSl序列3'杂交的第二探针相 接触；其中所述探针被不同地标记；其中检测到由分离的探针所指示的破坏的基因座指示 ROSl融合的存在，所述ROSl融合的存在指示ROSl相关癌症的存在。一方面，本文公开探 针包含与具有实时RT-PCR的产物的序列互补的序列，并且其中所述探针在其一端上具有 报道基因染料并且在其另一端上具有淬灭染料。应进一步了解探针可选自表7中的任何探 针，包括但不限于SEQ ID NO :6、8、19以及22。
[0058] mRNA检测和量化
[0059] 本文所公开的方法涉及检测呈例如点突变和截短形式的核酸变异，或检测ROSl 融合的表达、异常野生型ROSl表达、野生型ROSl表达或ROSl截短突变体的表达。对于这 些后面的表达水平检测来说，所述方法包括检测mRNA的丰度或存在或两者。因此，本文公 开用于诊断受试者中ROSl相关癌症的方法和组合物，所述方法包括测量来自所述受试者 的组织样品的mRNA的存在或水平；其中mRNA的量相对于对照物的增加指示ROSl相关癌症 的存在。
[0060] 存在多种广泛使用的工序用于检测和确定总或聚（A) RNA样品中特定mRNA的丰 度。例如，可使用以下来检测特异性mRNA :Northern印迹分析、核酸酶保护测定（NPA)、原 位杂交（例如，荧光原位杂交）、实时PCR反应或反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR)、以及 微阵列。
[0061] 这些技术中的每种可用于检测特异性RNA并且精确地确定其表达水平。一般来 说，Northern分析是提供关于转录物大小的信息的唯一方法，而NPA是同时检查多个消息 的最容易的方式。原位杂交用于定位组织或细胞类型内的特定基因的表达，并且RT-PCR是 用于检测和定量基因表达的最灵敏的方法。
[0062] 实时PCR、RT-PCR以及实时RT-PCR允许检测任何基因的RNA转录物，不管起始材 料的稀缺性（scarcity)或特异性mRNA的相对丰度。在RT-PCR中，使用反转录病毒反转录 酶将RNA模板拷贝成互补DNA (cDNA)。然后使用DNA聚合酶通过PCR将cDNA成指数地扩 增。反转录和PCR反应可在同一或不同管中发生。RT-PCR在某种程度上容忍降解的RNA。 只要所述RNA在由引物跨越的区域内是完整的，那么靶标将进行扩增。
[0063] 相对定量RT-PCR涉及与目标基因同时地扩增内部对照物。内部对照物用于标准 化样品。一旦标准化，可以在样品间进行特异性mRNA的相对丰度的直接比较。选择在所有 实验样品间具有恒定表达水平的内部对照物（即，不受实验治疗的影响）是至关重要地。通 常使用的内部对照物（例如，GAPDH、β-肌动蛋白、亲环蛋白（cyclophilin))经常在表达 方面变化，并且因此可能不是适当的内部对照物。另外，最常见的内部对照物以比所研究的 mRNA高得多的水平表达。为了使相对RT-PCR结果有意义，PCR反应的所有产物必须在扩增 的线性范围中进行分析。这对于具有广泛不同的丰度水平的转录物来说变得困难。
[0064] 竞争性RT-PCR用于绝对定量。这种技术涉及设计、合成并且精确地定量竞争者 RNA，所述竞争者RNA可在大小或序列方面与内源性靶存在较小差异。将已知量的竞争者 RNA添加至实验样品并且进行RT-PCR。将来自内源性靶的信号与来自所述竞争者的信号进 行比较以确定样品中所存在的靶的量。
[0065] 一方面，本文公开诊断受试者中ROSl相关癌症的方法，所述方法包括对来自所述 受试者的组织样品的核酸（例如像mRNA或DNA)进行实时PCR、RT-PCR或其它PCR反应； 其中所述聚合酶链式反应包括能够与一个或多个ROSl序列特异性地杂交的反向引物和至 少一个正向引物；并且其中扩增产物的量相对于对照物的增加指示ROSl相关癌症的存在。 本文还公开诊断受试者中ROSl相关癌症的方法，所述方法包括对来自所述受试者的组织 样品进行FISH ;其中所述聚合酶链式反应包括能够在ROSl融合断裂点的单独侧上与一个 或多个ROSl序列特异性地杂交的探针；并且其中由分离的探针指示的破坏的基因座指示 ROSl相关癌症的存在。用于在这一测定中使用的探针的实例包括表7中所发现的那些。 [0066] 因为所公开的方法可以用于检测野生型R0S1、ROSl融合以及ROSl激酶结构域活 性，所以本文还公开诊断受试者中ROSl相关癌症或检测受试者中ROSl激酶失调的方法，所 述方法包括对来自所述受试者的组织样品的mRNA进行第一 RT-PCR反应；其中所述反转录 聚合酶链式反应（RT-PCR)包括能够与ROSl激酶序列（例如像SEQ ID NO :4、5、7、8、15、16、 17以及18)特异性地杂交的一个引物对，和能够与任何融合断裂点的ROSl 5'（即，外部野 生型ROSl位点，例如像SEQ ID NO :13、14、20以及21)特异性地杂交的至少一个引物对，以 及确定来自各引物对的扩增子的循环阈值；并且其中野生型引物对扩增子的循环阈值高于 ROSl激酶的循环阈值统计学显著的量，这指示融合或突变的ROSl的存在。还公开诊断受 试者中ROSl相关癌症或检测受试者中ROSl激酶失调的方法，所述方法包括对来自所述受 试者的组织样品的mRNA进行第一 RT-PCR反应；其中所述反转录聚合酶链式反应（RT-PCR) 包括能够与任何融合断裂点的ROSl融合配偶体5'特异性地杂交并且仅在正向方向上扩增 的一个引物对；其中所述方法进一步包括使用与融合断裂点的ROSl序列3'特异性地杂交 的一个或多个引物来检测来自所述第一反应的扩增子的存在或扩增所述扩增子，其中来自 所述第一反应的扩增子中ROSl序列的存在指示ROSl融合的存在。
[0067] Northern分析是用于确定转录物大小并且用于鉴别选择性剪接的转录物和多基 因家族成员的最简单的方法。它还可用于在印迹上的所有样品之间直接地比较给定消息的 相对丰度。Northern印迹工序是直接的并且提供评价各点处的进展（例如，RNA样品的完 整性和它转移到膜的有效程度）的机会。RNA样品首先在变性条件下在琼脂糖凝胶中经由 电泳通过大小分离。所述RNA然后转移至膜、交联并且与标记的探针杂交。非同位素或高比 活性放射性标记的探针可以用于，包括随机引发的、切口-移位的或PCR产生的DNA探针、 体外转录的RNA探针以及寡核苷酸。另外，仅具有部分同源性的序列（例如，来自不同物种 的cDNA或可能包含外显子的基因组DNA片段）可以用作探针。
[0068] 核酸酶保护测定（NPA)(包括核糖核酸酶保护测定和Sl核酸酶测定）是用于检测 和定量特异性mRNA的灵敏方法。NPA的基础是反义探针（放射性标记的或非同位素）与 RNA样品的溶液杂交。在杂交后，单链、未杂交的探针和RNA被核酸酶降解。剩余受保护的 片段在丙烯酰胺凝胶上进行分离。溶液杂交通常比基于膜的杂交更有效，并且与印迹杂交 的20至30 μ g最大量相比，其可容纳高达100 μ g的样品RNA。NPA对RNA样品降解的敏感 性也比Northern分析低，因为仅在与探针重叠的区域中检测到裂解（探针的长度通常为约 100至400个碱基）。
[0069] NPA是用于同时检测几个RNA物种的选择的方法。在溶液杂交和随后分析过程中， 单独的探针/靶相互作用是完全彼此独立的。因此，可同时测定几个RNA靶和适当的对照 物（已经在同一反应中使用了多达十二个），其条件是各个探针具有不同的长度。NPA还通 常用于精确地绘制mRNA末端和内含子/外显子接点。
[0070] 原位杂交（ISH)是用于定位细胞或组织中的特异性mRNA的强大且通用的工具。 与Northern分析和核酸酶保护测定不同，ISH不需要RNA的分离或电泳分离。探针的杂交 发生在细胞或组织内。由于细胞结构在整个工序中得以维持，ISH提供关于组织样品内的 mRNA的位置的信息。ISH可与荧光标记物组合以达成荧光原位杂交（FISH)。
[0071] 工序开始于将样品固定在中性缓冲福尔马林中，并且将组织包埋在石蜡中。然后 将样品切成薄切片并且安装到显微镜载玻片上。（或者，组织可进行冰冻切片并且后固定在 多聚甲醛中。）在一系列洗涤以脱蜡和再水化切片之后，进行蛋白酶K消化以增加探针可接 近性，并且然后将标记的探针与样品切片进行杂交。放射性标记的探针可使用干燥到载玻 片上的液膜进行可视化，而非同位素标记的探针可用比色或荧光试剂方便地检测。
[0072] DNA检测和量化
[0073] 本文所公开的方法涉及检测呈例如点突变和截短形式的核酸变异，或检测ROSl 融合的表达、异常野生型ROSl表达或ROSl截短突变体的表达。对于这些后面的表达水平检 测来说，所述方法包括检测mRNA的丰度或存在或两者。或者，检测可涉及DNA (例如cDNA) 的丰度或存在。因此，本文公开用于诊断受试者中ROSl相关癌症的方法和组合物，所述方 法包括测量来自所述受试者的组织样品的DNA的存在或水平；其中DNA的量相对于对照物 的增加指示ROSl相关癌症的存在。
[0074] 存在多种广泛使用的工序用于检测和确定样品中特定DNA的丰度。例如，PCR技 术允许扩增并且随后检测靶核酸的微量。PCR的细节在本领域，包括例如Mullis等人的美 国专利号4, 683, 195、Mullis的4, 683, 202以及Mullis等人的4, 965, 188中进行了良好描 述。通常，将寡核苷酸引物退火至靶核酸的变性链，并且引物延伸产物通过聚合酶聚合脱氧 核苷三磷酸形成。典型的PCR方法涉及模板核酸变性、引物退火以及退火引物的通过热稳 定聚合酶的作用的延伸的重复循环。所述过程产生靶核酸的指数扩增，并且因此允许检测 样品中以极低浓度存在的靶。应理解并且本文考虑存在也可用于所公开方法中的本领域已 知的变化形式的PCR方法，例如，定量PCR(QPCR);微阵列；实时PCT ;热启动PCR ;巢式PCR ; 等位基因特异性PCR ;以及降落（Touchdown) PCR。
[0075] 微阵列
[0076] 阵列是样品的有序排列，从而提供用于基于碱基配对规则来匹配已知和未知的 DNA样品并且自动进行鉴别未知的过程的培养基。阵列实验可利用常见测定系统，如微量 培养板或标准印迹膜，并且可手工或利用机器人技术来沉积样品而建立。一般来说，阵列被 描述为宏阵列（macroarray)或微阵列，区别在于样品斑点的大小。宏阵列包含约300微米 或更大的样品斑点大小，并且可容易地通过现有凝胶和印迹扫描器成像。微阵列中的样品 斑点大小可以是300微米或更小，但直径通常小于200微米，并且这些阵列通常包含数千个 斑点。微阵列需要通常不是作为完整系统可商购的专门化的机器人技术和/或成像设备。 已经在文献中用于描述这种技术的术语包括但不限于：生物芯片、DNA芯片、DNA微阵列、 GENECHIP? (Affymetrix，Inc.其是指其高密度、基于寡核苷酸的DNA阵列）以及基 因阵列。
[0077] DNA微阵列或DNA芯片通过高速机器人技术、通常在玻璃或尼龙底物上来制作，具 有已知身份的探针被用于所述微阵列以便确定互补结合，从而允许大规模平行基因表达和 基因发现研究。使用单个DNA芯片的实验可同时提供关于数千个基因的信息。本文考虑所 公开的微阵列可用于监测基因表达、疾病诊断、基因发现、药物发现（药物基因组学）以及 毒理学研究或毒理基因组学。
[0078] 就具有已知身份的排列的DNA序列的特性而言，存在DNA微阵列技术的两种变化 形式。I型微阵列包含探针cDNA (500至5, 000个碱基长），所述探针cDNA使用机器人点样 固定至固体表面（如玻璃）并且暴露于一组单独地或呈混合物的靶标。所述方法传统上被 称为DNA微阵列。使用I型微阵列，定位的一个或多个多核苷酸序列的多个拷贝、优选单个 多核苷酸序列的拷贝被固定在底物表面的多个限定区域上。多核苷酸是指5至10, 000个 核苷酸范围的核苷酸链。这些固定的多核苷酸序列的拷贝适用于用作杂交实验中的探针。
[0079] 为了制备用固定的探针涂覆的珠粒，将珠粒浸入含有所需探针序列的溶液，并且 然后通过共价或非共价方式固定在珠粒上。或者，当探针被固定在棒上时，给定探针可被点 样在所述棒的限定区域处。典型的分配器包括用控制微量移液管相对于底物的位置的机器 人系统将溶液递送至底物的微量移液管。可存在多个分配器，以使得试剂可被同时递送至 反应区。在一个实施方案中，微阵列是基于压电效应通过使用油墨喷射技术形成，由此含有 目标液体如寡核苷酸合成试剂的窄管被适配器环绕。通过适配器发送的电荷使所述适配器 以不同于管的速率膨胀并且迫使一小滴液体到底物上。
[0080] 样品可以是含有目标多核苷酸（多核苷酸靶标）的任何样品并且从任何体液（血 液、尿、唾液、痰、胃液等）、培养细胞、活组织检查或其它组织制备物获得。DNA或RNA可以 根据本领域技术人员熟知的多种方法中的任何一种从样品分离。在一个实施方案中，总RNA 是使用 TRIzol 总 RNA 分离试剂（Life Technologies，Inc.，Rockville，Md.)进行分离并 且RNA是使用寡d(T)柱色谱法或玻璃珠粒进行分离。在杂交和加工之后，所获得的杂交信 号应准确地反映添加至样品的对照靶多核苷酸的量。
[0081] 底物上的多个限定区域可以各种格式布置。例如，所述区域可垂直或平行于肠衣 的长度布置。此外，靶标不必与底物直接结合，而是可通过连接基团与底物结合。连接基团 通常可从约6至50个原子长变化。连接基团包括乙二醇低聚物、二胺、二酸和类似物。底 物表面上的反应性基团与接头的一个末端部分反应以便使接头与底物结合。所述接头的另 一末端部分然后进行官能化以用于结合探针。
[0082] 样品多核苷酸可用一个或多个标记部分进行标记以便允许检测杂交的探针/靶 多核苷酸复合物。标记部分可包括能够通过光谱、光化学、生物化学、生物电子、免疫化学、 电学、光学或化学手段检测的组合物。标记部分包括放射性同位素（如32P、33P或35S)、化 学发光化合物、标记的结合蛋白、重金属原子、光谱标记物（如荧光标记物和染料）、磁性标 记、连接酶、质谱标签、自旋标记、电子转移供体和受体、生物素等。
[0083] 标记可在扩增反应如聚合酶链式反应和体外或体内转录反应过程中进行。或者， 标记部分可在杂交一旦形成探针-靶标复合物之后掺入。在一个实施方案中，生物素如以 上所描述在扩增步骤过程中首先引入。在杂交反应后，未结合的核酸被冲洗掉以使得仅仍 与底物结合的生物素附接至与多核苷酸探针杂交的靶多核苷酸。然后，添加以高亲和力结 合生物素的抗生物素蛋白缀合的荧光团，如抗生物素蛋白-藻红蛋白。
[0084] 杂交引起多核苷酸探针和互补靶标通过碱基配对形成稳定的双链体。杂交方法是 本领域技术人员熟知的。用于杂交的严格条件可通过盐浓度、温度以及其它化学品和条件 定义。如杂交时间、洗涤剂（十二烷基硫酸钠，SDS)或溶剂（甲酰胺）的浓度以及包含或 不包含载体DNA的各种其它参数是本领域技术人员熟知的。这些条件的另外变化对于本领 域技术人员来说将是显而易见的。
[0085] 用于检测复合物形成的方法是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中，将多 核苷酸探针用荧光标记进行标记并且复合物形成的水平和模式的测量是通过荧光显微术、 优选共焦荧光显微术来完成。氩离子激光器激发所述荧光标记，将发射引导至光电倍增管 并且检测和定量所发射的光的量。检测信号应在微阵列的每个位置处与探针/靶多核苷酸 复合物的量成比例。荧光显微镜可与计算机驱动的扫描器装置相关联以便产生杂交强度的 定量二维图像。检查扫描的图像以便确定每个杂交的靶多核苷酸的丰度/表达水平。
[0086] 在差示杂交实验中，将来自两个或更多个不同生物样品的多核苷酸靶标用两种或 更多种具有不同发射波长的不同荧光标记进行标记。分别用不同的光电倍增管设置检测荧 光信号以便检测特定波长。获得两个或更多个样品中靶多核苷酸的相对丰度/表达水平。 通常，微阵列荧光强度可进行标准化以便在类似测试条件下使用多于一个微阵列时将杂交 强度的变化考虑在内。在一个实施方案中，将单独多核苷酸探针/靶复合物杂交强度使用 源自每个微阵列上所包含的内部标准化对照物的强度进行标准化。
[0087] II型微阵列包含原位（芯片上）或通过常规合成接着芯片上固定来合成的寡核苷 酸（20至80链节寡核苷酸）或肽核酸（PNA)探针的阵列。将阵列暴露于标记的样品DNA，杂 交并且确定互补序列的身份/丰度。"历史上"称为DNA芯片的这种方法是在Affymetrix， Inc.开发的，所述公司以GENECHIP?商标出售其光刻制作的产品。
[0088] 使用II型阵列用于基因表达背后的基本概念很简单：将源自实验样品的mRNA的 标记的cDNA或cRNA祀标与附接至固相支持体的核酸探针杂交。通过监测与每个DNA位置 相关联的标记的量，有可能推断所表示的每个mRNA样本的丰度。虽然杂交已经使用了数十 年来检测和定量核酸，但本技术的小型化与大且增长量的序列信息的组合已经极大地扩展 了可以研究基因表达的规模。
[0089] 微阵列制造可开始于5平方英寸的石英晶片。最初洗涤石英以确保跨其表面的均 匀羟基化。因为石英是自然羟基化的，所以它提供用于化学品（如接头分子）附接的优异 底物，所述化学品随后用于定位阵列上的探针。
[0090] 将晶片放置在硅烷浴中，所述硅烷与石英的羟基反应并且形成共价连接分子的基 质。这些硅烷分子之间的距离决定探针的填充密度，从而允许阵列在仅1. 28平方厘米内保 持超过500, 000个探针位置或者特征。这些特征中的每个均含有数百万个相同的DNA分子。 硅烷薄膜提供均匀的羟基密度以便启动探针组装。附接至硅烷基质的接头分子提供可在空 间上被光激活的表面。
[0091] 探针合成并行发生，从而导致A、C、T或G核苷酸同时添加至多个生长链。为了定 义哪些寡核苷酸链将在每个步骤中接收核苷酸，将携带对应于单独特征的尺寸的18至20 平方微米窗口的光刻掩模放置在涂覆的晶片上。所述窗口基于每个探针的所需序列分布在 掩模上。当紫外光在第一合成步骤中照射在掩模上时，暴露的接头变成脱保护的并且可供 用于核苷酸偶联。
[0092] -旦所需特征已被激活，含有单一类型的具有可去除的保护基团的脱氧核苷酸的 溶液在晶片的表面上进行冲洗。核苷酸附接至激活的接头，从而启动合成过程。
[0093] 虽然寡核苷酸的序列中的每个位置可以由4个核苷酸中的1个占据，从而导致每 个晶片25X4或100个不同的掩模的表观需要，但合成过程可被设计成显著减少这种要求。 帮助最小化掩模使用的算法计算如何在同一掩模可多次使用时通过调节单独探针的合成 速率和识别情况来最佳地协调探针生长。
[0094] 选择和设计的一些关键要素对于所有微阵列的产生来说是共用的，而不管其意图 应用。例如，用于优化探针杂交的策略总是包括在探针选择的方法中。在特定pH、盐以及温 度条件下的杂交可通过将解链温度考虑在内并且使用与所需杂交行为相关的经验法则来 进行优化。
[0095] 为获得基因活性的完整图像，一些探针选自由多个剪接或聚腺苷酸化变体共享的 区域。在其它情况下，区分变体的独特探针是有利的。还将探针分离距离作为选择方法的 因素考虑。
[0096] 不同组的策略用于选择用以基因分型依赖于多个探针的阵列的探针以便询问序 列中的单独核苷酸。可以使用仅在靶标位置上变化的四个相同探针来推导靶碱基的身份， 每个探针含有四种可能的喊基中的一种。
[0097] 或者，可使用一个或两个表示特定等位基因的探针来测试共有序列的存在。为了 基因分型杂合的或遗传混合的样品，可建立具有许多探针的阵列以便提供冗余信息，从而 导致明确的基因分型。此外，通用探针可用于一些应用中以最大化柔性。例如一些探针阵 列允许单独反应产物与复合物混合物的分离和分析，如用于一些方案中来鉴别单个核苷酸 多态性（SNP)的那些。
[0098] 实时 PCR
[0099] -方面，所公开的诊断方法可通过实时PCR方法来进行。例如，一方面，本文公开 检测ROSl相关融合的存在的方法或诊断ROSl相关癌症或检测受试者中ROSl激酶的失调 的方法，所述方法包括对来自所述受试者的组织样品的mRNA进行第一 RT-PCR反应；其中反 转录聚合酶链式反应（RT-PCR)包含能够与ROSl激酶序列特异性地杂交的一个引物对和能 够与任何融合断裂点的ROSl 5'（即外部野生型ROSl位点）特异性地杂交的至少一个引物 对，以及确定来自每个引物对的扩增子的循环阈值；并且其中野生型引物对扩增子的循环 阈值高于ROSl激酶的循环阈值统计学上显著的量指示融合或突变的ROSl的存在。
[0100] 实时PCR监测在反应过程中作为每个PCR循环过程中扩增子产生的指标的所发射 的荧光（即，实时），而不是终点检测。可在一些系统中观察反应的实时进展。实时PCR不检 测扩增子的大小，并且因此不允许区分DNA和cDNA扩增，然而，其不受非特异性扩增影响， 除非使用SYBR Green。实时PCR定量消除PCR产物的PCR后加工。这有助于增加通量并且 减少携带污染的机会。实时PCR还提供高达IO 7倍的宽动态范围。任何测定的动态范围决 定靶浓度可以变化并且仍然被定量的范围。宽动态范围意指靶标与标准化子（normalise!·) 比率的宽范围可用相等灵敏度和特异性进行测定。由此可见，动态范围越宽，定量越精确。 当与RT-PCR组合时，实时RT-PCR反应通过在扩增过程正在进行时提供扩增子的可视化来 减少测量扩增子的量所需的时间。
[0101] 实时PCR系统是基于检测和定量的荧光报道分子。所述信号与反应中PCR产物的 量成正比地增加。通过记录每个循环的荧光发射的量，有可能在指数期过程中监测PCR反 应，其中PCR产物的量的第一次显著增加与靶标模板的初始量相关。核酸靶标的起始拷贝 数目越高，所观察到的荧光的显著增加越快。在3至15个循环过程中测量的荧光高于基线 值的显著增加可指示检测到累积的PCR产物。
[0102] 固定荧光阈值被设置成显著高于可由操作者改变的基线。参数Ct (阈值循环）被 定义为荧光发射超过固定阈值的循环数。
[0103] 对于DNA扩增来说存在三种主要的荧光监测系统：（1)水解探针；（2)杂交探针； 以及（3) DNA结合剂。水解探针包括TaqMan探针、分子信标以及蝎（scorpion)。它们使用 Taq聚合酶的荧光5'外切核酸酶活性来测量cDNA样品中靶序列的量。
[0104] TaqMan探针是比引物（20至30个碱基长，其中Tm值高于KTC )长的寡核苷酸， 所述寡核苷酸通常在5'碱基上包含荧光染料并且通常在3'碱基上包含淬灭染料（通常 TAMRA)。当照射时，激发的荧光染色将能量转移至附近的淬灭染料分子而不是发荧光（这 被称为FRET= RVrsier或荧光共振能量转移）。因此，报道子和淬灭剂的紧密靠近防止在 探针是完整时任何荧光的发射。TaqMan探针被设计成退火至PCR产物的内部区域。当聚合 酶复制TaqMan探针所结合的模板时，其5'外切核酸酶活性使探针裂解。这结束了淬灭剂 (无 FRET)的活性，并且报道染料开始发射荧光，所述荧光在每个循环中与探针裂解的速率 成比例地增加。PCR产物的累积是通过监测报道染料的荧光的增加来检测（注意引物未进 行标记）。TaqMan测定使用通用的热循环参数和PCR反应条件。由于裂解仅在探针与靶标 杂交的情况下发生，所以所检测的荧光的原点是特异性扩增。杂交和裂解的过程不干扰产 物的指数累积。用于荧光探针的一个具体要求是在5'端不存在G。与报道染料相邻的"G" 可甚至在裂解之后淬灭报道分子荧光。
[0105] 分子信标还在任一端包含荧光团（FAM、TAMRA、TET、R0X)和淬灭染料（通常 DABCYL)，但它们被设计成采用发夹结构，同时在溶液中游离以便使荧光染料和淬灭剂紧密 靠近，以用于FRET发生。它们具有带互补序列的两个臂，所述臂形成非常稳定的杂交体或 茎。所述发夹构型中报道分子与淬灭剂的紧密靠近抑制报道分子荧光。当信标与靶标在退 火步骤过程中杂交时，报道染料与淬灭剂分尚并且报道分子发突光（FRET不会发生）。分子 信标在PCR过程中保持完整并且必须在每一循环与靶标再结合以用于荧光发射。这将与可 获得的PCR产物的量相关。所有实时PCR化学允许通过将每个探针/信标设计为具有光谱 独特的荧光/淬火对来检测多种DNA物种（多重反应），只要平台在使用SYBR绿的情况下 适用于解链曲线分析。通过多重反应，一个或多个靶标和内源对照可在单个试管中进行扩 增。
[0106] 使用Scorpion探针，序列特异性引发和PCR产物检测是使用单个寡核苷酸来实 现。Scorpion探针在未杂交状态中保持茎-环构型。荧光团附接至5'端并且通过偶联至 3'端的部分淬灭。茎的3'部分还包含与引物的延伸产物互补的序列。所述序列经由不可 扩增的单体连接至特定引物的5'端。在Scorpion引物的延伸之后，特异性探针序列能够 与延伸的扩增子内的其互补序列结合，从而打开发夹环。这防止荧光被淬灭并且观察到信 号。
[0107] 另一种替代方案是双链DNA结合染料化学，其通过使用非序列特异性荧光嵌入剂 (SYBR-绿I或溴化乙锭）来定量扩增子产生（包括非特异性扩增和引物二聚体复合物）。 它不与ssDNA结合。SYBR绿是荧光小沟结合染料，所述染料当在溶液中时表现出很少荧光 但在结合双链DNA之后发射强荧光信号。基于SYBR绿的实时PCR的缺点包括需要广泛优 化。此外，非特异性扩增需要后续测定（熔点曲线或解离分析）以用于扩增子鉴别。所述方 法已用于HFE-C282Y基因分型中。另一个可控制的问题是，较长扩增子产生更强信号（如 果与其它因素组合，这可以引起CDC照相机饱和度，见下文）。通常在单重反应中使用SYBR 绿，然而当与熔点分析结合时，其可以用于多重反应。
[0108] 阈值循环或Ct值是首次检测到ARn的显著增加的循环（对于ARn的定义，参 见下文）。阈值循环是在对数-线性期过程中当系统开始检测到与PCR产物的指数生长相 关的信号的增加时。所述期提供关于反应的最有用的信息（当然比端点更重要）。所述对 数-线性期的斜率是扩增效率的反映。反应的效率（Eff)可由以下公式计算：Eff = 10H/ 斜率>-1。PCR的效率应是90%至100% (3.6 >斜率>3.1)。许多变量可能影响PCR的效 率。这些因素包括扩增子的长度、二级结构以及引物质量。虽然可获得不属于效率范围内 的有效数据，但qRT-PCR应进行进一步优化或替代扩增子设计。对于为真实扩增（而不是 信号漂移）的指示符的斜率来说，必须存在拐点。这是当对数线性期开始时生长曲线上的 点。它还表示沿生长曲线的最大变化速率。（信号漂移的特征在于荧光的逐渐增加或减小 而无产物的扩增。）用于定量的重要参数是(^。基因组DNA的初始量越高，越早在PCR过 程中检测到累积产物，并且C t值越低。阈值将被放置高于任何基线活性并且在指数增加期 内（其在对数转化中看起来是线性的）。一些软件允许通过生长曲线的数学分析来确定循 环阈值（C t)。这提供更好的运行到运行可再现性。40的Ct值意指无扩增并且所述值不能 包括在计算中。除了用于定量，C t值可用于作为通过/失败测量的定性分析。
[0109] 可使用多种具有不同发射波长的染料进行多重TaqMan测定。为此目的可用染料 是FAM、TET、VIC以及JOE (最昂贵的）。TAMRA作为淬灭剂保留在探针上并且ROX作为无源 参考（passive reference)。为了获得最佳结果，推荐FAM(祀标）与VIC(内源对照）的组 合（它们具有发射最大值的最大差别），而JOE和VIC不应进行组合。重要的是，如果没有 正确地选择染料层，那么机器将仍然读取其它染料的光谱。例如，VIC和FAM两者在彼此相 似的范围内发射荧光并且当进行单个染料时，孔应被正确地标记。在多重反应的情况下，应 打开运行后分析的光谱补偿（在ABI7700上：仪器/诊断/高级选项/杂项）。激活光谱 补偿改进染料光谱分辨率。
[0110] 巢式 PCR
[0111] 所公开的方法可进一步利用巢式PCR。巢式PCR通过减少由于DNA的非特异性扩 增所致的背景来增加 DNA扩增的特异性。两组引物用于两个连续PCR中。在第一反应中， 一对引物用于产生DNA产物，所述DNA产物除所意图的靶标之外还可由非特异性扩增的DNA 片段组成。所述一种或多种产物然后用于使用一组引物的第二PCR中，所述引物的结合位 点完全或部分不同于并且位于所述第一反应中所使用的每个引物的3'。巢式PCR经常在 特异性扩增长DNA片段方面比常规PCR更成功，但它需要靶序列的更详细的知识。
[0112] 因此，一方面，本文公开诊断受试者中ROSl相关癌症的方法，所述方法包括对来 自所述受试者的组织样品的DNA进行PCR反应；其中所述PCR反应包括能够与一个或多个 ROSl序列特异性地杂交的反向引物和至少一个正向引物；并且其中扩增产物的量相对于 对照物的增加指示ROSl相关癌症的存在。
[0113] 引物和探针
[0114] 如本文所用，"引物"是探针的子集，所述探针能够支持一些类型的酶操作并且能 够与靶核酸杂交以使得可发生酶操作。引物可由本领域可获得的不会干扰酶操作的核苷酸 或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制成。
[0115] 如本文所用，"探针"是通常以序列特异性方式，例如通过杂交能够与靶核酸相互 作用的分子。核酸的杂交是本领域充分了解的并且在本文进行了讨论。通常探针可由本领 域可获得的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制成。如本文所用，探针可包含在 其一端上的报道染料和在其另一端上的淬灭染料。
[0116] 公开包含引物和探针的组合物，所述引物和探针能够与所公开的核酸如SEQ ID NO :1或其互补序列（如表7中所列出的那些）相互作用（例如，为与SEQ ID NO :1相互作 用的引物的SEQIDN0:4、5、7、8、12、13、14、15、16、17、18、20、以及21和为与SEQIDN0 :1 相互作用的探针的SEQ ID NO :6、8、19以及22)。所公开的引物和探针可用于以下中：用于 诊断本文所公开的ROSl相关癌症的任何所公开的方法以及用于确定癌症是否对用ROSl抑 制剂治疗具有易感性或抗性的方法。在某些实施方案中，所述引物用于支持核酸延伸反应、 核酸复制反应和/或核酸扩增反应。通常所述引物将能够以序列特异性方式延伸。引物以 序列特异性方式的延伸包括任何方法，其中引物与其杂交或以另外方式缔合的核酸分子的 序列和/或组成引导或影响通过引物的延伸所产生的产物的组成或序列。引物以序列特异 性方式的延伸因此包括但不限于PCR、DNA测序、DNA延伸、DNA聚合、RNA转录或反转录。公 开了以序列特异性方式扩增引物的技术和条件。在某些实施方案中，引物用于DNA扩增反 应，如PCR或直接测序。应了解在某些实施方案中，引物还可使用非酶技术进行延伸，其中 例如用于延伸引物的核苷酸或寡核苷酸进行修饰以使得它们将对以序列特异性方式延伸 引物具有化学反应。通常所公开的引物与所公开的核酸或核酸的区域杂交或它们与所述核 酸的互补序列或所述核酸的区域的互补序列杂交。作为引物的用途的实例，一种或多种引 物可用于从第一核酸产生延伸产物和产生通过第一核酸模板化的延伸产物。
[0117] 用于与核酸相互作用的引物或探针的大小可为支持引物的所需酶操作（如DNA 扩增或探针或引物的简单杂交）的任何大小。典型的引物或探针将是至少6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、 300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、 1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500、或4000 个核苷酸长。
[0118] 在其它实施方案中，引物或探针可以是少于或等于6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、 400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、 2000、2250、2500、2750、3000、3500、或 4000 个核苷酸长。
[0119] 用于目标核酸的引物通常将用于产生包含目标核酸的的区域的延伸产物和/或 其它复制的或扩增的产物。产物的大小可以是使得所述大小可被精确地确定至在3、或2或 1个核苷酸内。
[0120] 在某些实施方案中，产物可以是例如至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、 225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、 900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500、或 4000 个核苷酸长。
[0121] 在其它实施方案中，产物可以是例如少于或等于20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、 175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、 800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500、或 4000 个核 苷酸长。
[0122] 因此，应了解并且本文考虑所公开的RT-PCR和PCR反应需要至少一个正向引物和 /或至少一个反向引物以便扩增靶核酸。本文公开正向引物可以是例如细胞内（即ROSl 断裂点的3，）ROSl引物或ROSl激酶正向引物，例如像SEQ ID NO :4、7、15、17或20。反向 引物可以是例如ROSl激酶反向引物，例如像SEQ ID N0:5、8、12、16、18或21。应了解所述 方法可包括至少一个正向引物和反向引物。因此，本文公开诊断受试者中ROSl相关癌症的 方法，所述方法包括对来自所述受试者的组织样品的核酸（如mRNA或DNA)进行实时PCR、 RT-PCR、或其它PCR反应；其中所述聚合酶链式反应（RT-PCR)包括能够与一个或多个ROSl 序列特异性地杂交的一个或多个反向引物和至少一个正向引物；其中所述正向引物可以是 例如 CD74-R0S1 引物（例如像 SEQ ID NO :2 和 10)、FIG-ROSl 引物、SLC34A2-R0S(短）弓丨 物、SLC34A2-R0S (短和长）引物（例如像 SEQ ID NO :3 和 11)、SLC34A2-R0S (长）引物、 ROSl激酶引物（例如像SEQ ID NO :4、7、15或17)、和/或野生型ROSl引物，包括结合融合 断裂点的5'的野生型ROSl引物（例如像SEQ ID NO. 13或20);并且其中ROSl激酶的扩增 产物的量相对于野生型ROSl中无相应增加的对照物的增加指示ROSl相关癌症的存在。在 使用与ROSl融合配偶体结合的引物的情况下，已知的R0S1-融合相关癌症的存在由相对于 对照物ROSl激酶的扩增产物的量的增加和所述融合配偶体的扩增的增加指示。应了解融 合配偶体的扩增可通过使用包含与断裂点的ROSl 3'杂交的反向引物和与断裂点的融合配 偶体5'杂交的正向引物的引物对或仅使用与融合配偶体杂交的正向引物。在使用由与融 合配偶体结合的正向引物和与融合断裂点的ROSl 3'结合的反向引物组成的引物对的方法 中，使用仅正向或反向引物在扩增子中检测到ROSl和融合配偶体两者、对于包含引物之间 的融合的扩增子来说检测到适当大小的扩增子、或检测到扩增子的量大于对照物指示ROSl 融合。在使用具有与融合配偶体结合的正向引物的引物对的情况下，与断裂点的ROSl 5' 杂交的引物对用作针对融合事件的错误鉴别和未知融合的确定的对照物。或者，一方面，本 文所公开的方法可包括仅使用与融合配偶体结合的正向引物来在第一反应中扩增来自受 试者的核酸，和使用与融合断裂点的ROSl 3'结合的引物对来扩增所述第一反应的扩增子， 其中含有ROSl序列的扩增子指不ROSl相关癌症的存在。
[0123] 另一方面，还公开诊断受试者中ROSl相关癌症的方法，所述方法包括对来自所述 受试者的组织样品的核酸（如mRNA或DNA)进行实时PCR、RT-PCR或其它PCR反应；其中所 述聚合酶链式反应包括能够与一个或多个ROSl序列特异性地杂交的反向引物和至少一个 正向引物；其中所述正向引物是外部野生型ROSl引物（即融合断裂点的5'），并且其中扩 增产物的量相对于对照物的增加指示ROSl相关癌症的存在。
[0124] 应了解并且本文考虑存在以下情况：其中可能有利的是使用多于一个引物对来检 测融合、截短或过表达突变的存在。如实时PCR、RT-PCR或其它PCR反应可单独地或在单个 反应中进行。当多个引物对被放置至单个反应中时，这被称为"多重PCR"。例如，反应可包 括与反向引物配对的野生型ROSl引物，以及与相同反向引物配对的ROSl激酶引物。因此， 本文公开诊断受试者中ROSl相关癌症的方法，所述方法包括对来自所述受试者的组织样 品的mRNA进行实时或RT-PCR反应；其中所述聚合酶链式反应包括能够与一个或多个ROSl 序列特异性地杂交的反向引物和至少两个正向引物；并且其中扩增产物的量相对于ROSl 激酶的对照物而不是两种引物的增加指示ROSl相关癌症的存在。类似地公开包括至少三 个正向引物的方法。应了解并且本文考虑本文所公开的两个或更多个或三个或更多个正向 引物的任何组合可用于多重反应中。因此，例如，本文公开诊断方法，其中正向引物是ROS1 融合引物（例如像CD74-R0S1、FIG-ROSl或SLC34-R0S1)、ROSl激酶引物以及野生型ROSl 引物。
[0125] 本文还公开诊断患有癌症的受试者中ROSl相关癌症的方法，所述方法包括从所 述受试者获得组织样品，从所述组织样品分离核酸，对核酸进行核酸扩增过程，以及检测所 述组织样品中与野生型ROSl和ROSl激酶结构域两者之一或两者的组合相关的核酸的存在 或测量所述核酸的量，其中所述扩增过程是对cDNA的PCR或对mRNA的实时PCR、RT-PCR或 实时RT-PCR，其中所述PCR、RT-PCR、实时PCR或实时RT-PCR反应包括使用与野生型ROSl 序列特异性地杂交的正向和反向引物对（例如像与ROS1的细胞外结构域结合的引物，如正 向引物SEQ ID NO :13和20和反向引物SEQ ID NO :14和21)和与野生型ROSl激酶结构域 序列特异性地杂交的正向和反向引物对（例如像，正向引物SEQ ID NO :4、7、13、15、17或20 和反向引物（SEQ ID NO :5、8、12、14、16、18或21)。应了解可使用特定野生型ROSl或ROSl 激酶结构域的正向和反向引物的任何组合。例如，野生型ROSl (例如ROSl的E⑶）的正向 和反向引物对可以是SEQ ID N0:13和14;SEQ ID N0:13和21;SEQ ID N0:20和21;或 SEQ ID NO :20和14。类似地，对ROSl的激酶结构域具有特异性的引物可以是所述激酶结 构域的正向引物和反向引物的任何组合，例如像SEQ ID N0:4和5;SEQ ID N0:4和8;SEQ ID NO :4 和 14 ;SEQ ID NO :4 和 16 ;SEQ ID NO :4 和 18 ;SEQ ID NO :4 和 21 ;SEQ ID NO :7 和 5 ;SEQ ID NO :7 和 8 ;SEQ ID NO :7 和 14 ;SEQ ID NO :7 和 16 ;SEQ ID NO :7 和 18 ;SEQ ID NO :7 和 21 ;SEQ ID NO :13 和 5 ;SEQ ID NO :13 和 8 ;SEQ ID NO :13 和 14 ;SEQ ID NO : 13 和 16 ;SEQ ID NO :13 和 18 ;SEQ ID NO :13 和 21 ;SEQ ID NO :15 和 5 ;SEQ ID NO :15 和 8;SEQIDN0:15和14;SEQIDN0:15和16 ;SEQIDN0:15和18;SEQIDN0:15和21 ; SEQ ID NO :17 和 5 ;SEQ ID NO :17 和 8 ;SEQ ID NO :17 和 14 ;SEQ ID NO :17 和 16 ;SEQ ID NO :17 和 18 ;SEQ ID NO :17 和 21 ;SEQ ID NO :20 和 5 ;SEQ ID NO :20 和 8 ;SEQ ID NO :20 和 14 ;SEQ ID NO :20 和 16 ;SEQ ID NO :20 和 18 ;以及 SEQ ID NO :20 和 21。
[0126] 荧光变化探针和引物
[0127] 荧光变化探针和荧光变化引物是指涉及基于探针或引物和待检测、测定或复制的 核酸的形式或构象的变化的荧光强度或波长的变化的所有探针和引物。荧光变化探针和引 物的实例包括分子信标、Amplifluor、FRET探针、可裂解的FRET探针、TaqMan探针、蝎形引 物、荧光三链体寡核苷酸（包括但不限于三链体分子信标或三链体FRET探针）、荧光水溶性 缀合的聚合物、PNA探针和QPNA探针。
[0128] 荧光变化探针和引物可根据其结构和/或功能进行分类。荧光变化探针包括发夹 淬灭的探针、裂解淬灭的探针、裂解激活的探针以及荧光激活的探针。荧光变化引物包括茎 淬灭的引物和发夹淬灭的引物。
[0129] 发夹淬灭的探针是以下探针，所述探针在未与靶序列结合时形成发夹结构（并且 通常为环），所述发夹结构使荧光标记和淬灭部分靠近以使得来自所述标记的荧光被淬灭。 当探针与靶序列结合时，茎被破坏，淬灭部分不再与荧光标记靠近并且荧光增加。发夹淬灭 的探针的实例是分子信标、荧光三链体寡核苷酸、三链体分子信标、三链体FRET探针以及 QPNA探针。
[0130] 裂解激活的探针是其中荧光通过探针的裂解而增加的探针。裂解激活的探针可包 括靠近的荧光标记和淬灭部分以使得来自所述标记的荧光被淬灭。当探针被剪除或消化时 (通常在扩增过程中通过聚合酶的5' -3'外切核酸酶活性），淬灭部分不再靠近荧光标记 并且荧光增加。TaqMan探针是裂解激活的探针的实例。
[0131] 裂解淬灭的探针是其中荧光通过探针的裂解而减少或改变的探针。裂解淬灭的探 针可包括受体荧光标记和供体部分，以使得当受体和供体靠近时，从供体至受体的荧光共 振能量转移引起受体发荧光。所述探针因此例如在与靶序列杂交时是荧光的。当探针被剪 除或消化时（通常在扩增过程中通过聚合酶的5' -3'外切核酸酶活性），供体部分不再靠 近受体荧光标记并且来自受体的荧光减少。如果供体部分本身是荧光标记，那么它可在不 靠近受体时释放作为荧光的能量（通常以与受体的荧光不同的波长）。总体作用然后将是 受体荧光的减少和供体荧光的增加。在裂解淬灭的探针的情况下，供体荧光等于由裂解激 活的探针产生的荧光，其中受体是淬灭部分并且供体是荧光标记。可裂解的FRET(荧光共 振能量转移）探针是裂解淬灭的探针的实例。
[0132] 荧光激活的探针是其中荧光通过探针与靶序列的杂交增加或改变的探针或探针 对。荧光激活的探针可包括受体荧光标记和供体部分，以使得当受体和供体靠近时（当探 针与靶序列杂交时），从供体至受体的荧光共振能量转移引起受体发荧光。荧光激活的探针 通常是被设计成与相邻序列杂交以使得受体和供体靠近的探针对。荧光激活的探针还可以 是含有供体和受体两者的单个探针，其中当探针未与靶序列杂交时供体和受体不靠近，但 其中当探针与靶序列杂交时供体和受体靠近。这可例如通过以下方式来完成：将供体和受 体放置在探针的相对端上并且将靶互补序列放置在探针的每一端处，其中靶互补序列是与 靶序列中的相邻序列互补的。如果荧光激活的探针的供体部分本身是荧光标记，那么它可 在未靠近受体时（即，在探针未与靶序列杂交时）释放作为荧光的能量（通常以与受体的 荧光不同的波长）。当探针与靶序列杂交时，总体作用然后将是供体荧光的减少和受体荧光 的增加。FRET探针是荧光激活的探针的实例。
[0133] 茎淬灭的引物是以下引物，所述引物在未与互补序列杂交时形成茎结构（分子内 茎结构或分子间茎结构），所述茎结构使荧光标记和淬灭部分靠近，这样使得来自标记的荧 光被淬灭。当引物与互补序列结合时，茎被破坏，淬灭部分不再与荧光标记靠近并且荧光增 力口。在所公开的方法中，茎淬灭的引物用作核酸合成的引物并且因此变成掺入到合成的或 扩增的核酸中。茎淬灭的引物的实例是肽核酸淬灭的引物和发夹淬灭的引物。
[0134] 肽核酸淬灭的引物是与肽核酸淬灭剂或肽核酸荧光缔合以形成茎结构的引物。所 述引物包含荧光标记或淬灭部分并且分别与肽核酸淬灭剂或肽核酸荧光缔合。这样使得荧 光标记靠近淬灭部分。当引物复制时，肽核酸被置换，从而允许荧光标记产生荧光信号。
[0135] 发夹淬灭的引物是以下引物，所述引物在未与互补序列杂交时形成发夹结构（并 且通常为环），所述发夹结构使荧光标记和淬灭部分靠近以使得来自所述标记的荧光被淬 灭。当引物与互补序列结合时，茎被破坏，淬灭部分不再与荧光标记靠近并且荧光增加。发 夹淬灭的引物通常用作核酸合成的引物并且因此变成掺入到合成的或扩增的核酸中。发夹 淬灭的引物的实例是Amplifluor引物和蝎形引物。
[0136] 裂解激活的引物与裂解激活的探针类似，除了他们是掺入到复制链中并且然后随 后裂解的引物。
[0137] 标记
[0138] 为了使用所公开的方法帮助检测和定量所产生的核酸，标记可以直接地掺入至核 苷酸或核酸中或可与检测分子如探针和引物偶联。如本文所用，标记是可与核苷酸或核酸 直接地或间接地缔合并且直接地或间接地产生可测量的、可检测的信号的任何分子。用于 掺入至核苷酸和核酸或与核酸探针偶联的许多这类标记是本领域技术人员已知的。适用于 在所公开的方法中使用的标记的实例是放射性同位素、荧光分子、磷光分子、酶、抗体以及 配体。荧光标记，尤其是在荧光变化探针和引物的背景下，适用于扩增的实时检测。
[0139] 适合的荧光标记的实例包括异硫氰酸荧光素（FITC)、5,6-羧甲基荧光素、德克萨 斯红、硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑-4-基（NBD)、香豆素、丹磺酰氯、罗丹明、氨基-甲基香 豆素（AMCA)、曙红、藻红、BODIPY?、CASCADE BLUE?、OREGON GREEN*'、芘、丽丝胺 (Iissamine)、咕吨（xanthenes)、Π 丫陡、P惡嗪、藻红蛋白、镧系元素离子的大环螯合剂如量子 染料?、荧光能量转移染料如噻唑橙-乙啡啶异源二聚体、以及花青染料Cy3、Cy3. 5、Cy5、 Cy5. 5以及Cy7。其它特异性荧光标记的实例包括3-羟基芘5,8,10-三磺酸、5-羟基色 胺（5-HT)、酸性品红、茜素络合酮（Alizarin Complexon)、茜红（Alizarin Red)、别藻蓝 素（Allophycocyanin)、氨基香豆素（Aminocoumarin)、蒽基硬脂酸酯、Astrazon 亮红 4G、 Astrazon 澄 R、Astrazon 红 6B、Astrazon 黄 7GLL、阿的平（Atabrine)、金胺（Auramine)、 金膦（Aurophosphine)、金膦G、BA09(双氨基苯基卩惡二唑）、BCECF、硫酸黄连素、双苯甲酰 胺、Blancophor FFG 溶液、Blancophor SV、氟硼突（Bodipy)Fl、亮 Sulphoflavin FF、?丐 黄绿素蓝（Calcien Blue)、|丐绿（Calcium Green)、Calcofluor RW 溶液、Calcofluor 白、 Calcophor白ABT溶液、Calcophor白标准溶液、Carbostyryl、Cascade黄、儿茶酚胺、奎纳 克林（Chinacrine)、Coriphosphine 0、香豆素-鬼笔环肤（Phalloidin)、CY3. 18、CY5. 18、 CY7、Dans(l-二甲基氨基萘5磺酸）、Dansa (二氨基萘基磺酸）、丹酰NH-CH3、二氨基苯基 噁二唑（DAO)、二甲基氨基-5-磺酸、二吡咯亚甲基二氟化硼、二苯基亮黄素7GFF、多巴胺、 藻红ITC、吖啶橙、FIF(甲醛诱导的荧光）、Flazo橙、Fluo3、荧光胺、Fura-2、Genacryl亮 红 B、Genacryl 亮黄 10GF、Genacryl 粉 3G、Genacryl 黄 5GF、乙醒酸（Gloxalic Acid)、粒状 蓝、血口卜啉（Haematoporphyrin)、Indo-I、Intrawhite Cf 液体、Leucophor PAF、Leucophor SF、Leucophor WS、丽丝胺罗丹明 B200(RD200)、荧光黄 CH、荧光黄 VS、萘红（Magdala Red)、 Marina蓝、Maxilon亮黄素10GFF、Maxilon亮黄素8GFF、MPS (甲基绿派若宁二苯乙烯）、 光辉霉素（Mithramycin)、NBD胺、硝基苯并卩惡二唑（Nitrobenzoxadidole)、去甲肾上腺 素、核固红、核黄、Nylosan亮黄素 E8G、噁二唑、太平洋蓝（Pacific Blue)、碱性副品红 (Pararosaniline) (Feulgen)、Phorwite AR 溶液、Phorwite BKL、Phorwite Rev、Phorwite RPA、Phosphine3R、酞菁染料、藻红蛋白 R、藻红蛋白 B、Polyazaindacene Pontochrome 蓝 黑、卩卜啉（Porphyrin)、搜草灵（Primuline)、普施安黄（PrccionYellow)、派若宁、派若宁 B、Pyrozal亮黄素7GF、氮芥喹卩丫因 （Quinacrine Mustard)、罗丹明123、罗丹明5GLD、罗 丹明6G、罗丹明B、罗丹明B200、罗丹明B Extra、罗丹明BB、罗丹明BG、罗丹明WT、血清素、 Sevron 亮红 2B、Sevron 亮红 4G、Sevron 亮红 B、Sevron 澄、Sevron 黄 L、SITS (搜草灵）、 SITS(二苯乙烯异硫磺酸）、二苯乙烯、Snarfl、磺基罗丹明B Can C、磺基罗丹明G Extra、 四环素、噻嗪红R、硫磺素 S、硫磺素 TCN、硫磺素5、Thiolyte、Thiozol橙、Tinopol CBS、真 蓝、Ultralite、荧光素钠（Uranine) B、Uvitex SFC、二甲苯橙、以及 XRITC。
[0140] 这些荧光剂中的一些的吸收和发射最大值分别是：FITC (490nm ;520nm)、 Cy3 (554nm ;568nm)、Cy3. 5 (581nm ;588nm)、Cy5 (652nm ;672nm)、Cy5. 5 (682nm ;703nm)以 及Cy7 (755nm ;778nm)，从而允许其同时检测。荧光素染料的其它实例包括6-羧基荧光素 (6-卩六厘)、2/，4 /，1，4，-四氯荧光素〇^1')、2/，4/，5/，7 /，1，4-六氯荧光素（冊父)、 2'，7'-二甲氧基-4' ,5'-二氯-6-羧基罗丹明（JOE)、2'-氯-5'-氟-7' ,8'-融 合的苯基-1，4-二氯-6-羧基荧光素（NED)、以及2'-氯-7'-苯基-1，4-二氯-6-羧 基突光素（VIC)。突光标记可从多种商业来源获得，包括Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ ；Molecular Probes, Eugene, OR ;以及 Research Organics, Cleveland, Ohio。
[0141] 另外目标标记包括仅在所述标记所缔合的探针与靶分子特异性地结合时提供信 号的那些，其中这类标记包括：如 Tyagi&Kramer，Nature Biotechnology (1996) 14 :303 和 EPO 070 685R1中所描述的"分子信标"。其它目标标记包括美国专利号5, 563, 037中所描 述的那些，所述专利以引用的方式并入本文。
[0142] 标记的核苷酸是标记的在合成过程中可直接地掺入至扩增产物中的形式。可掺 入至扩增的核酸中的标记的实例包括核苷酸类似物如BrdUrd、氨基烯丙基脱氧尿苷、5-甲 基胞啼陡、溴尿苷，和用生物素或用适合的半抗原修饰的核苷酸如地高辛（digoxygenin)。 适合的荧光标记的核苷酸是异硫氰酸荧光素-dUTP、菁蓝-3-dUTP以及菁蓝-5-dUTP。 用于DNA的核苷酸类似物标记的一个实例是BrdUrd (溴脱氧尿苷，BrdUrd、BrdU、 BUdR，Sigma-Aldrich Co)。用于将标记掺入至DNA中的核苷酸类似物的其它实例是 AA-dUTP (氨基烯丙基-脱氧尿苷三磷酸酯，Sigma-Aldrich Co.)和5-甲基-dCTP (Roche Molecular Biochemicals)。用于将标记掺入至RNA中的核苷酸类似物的一个实例是生物 素 _16_UTP(生物素-16-尿昔-5'-三憐酸醋，Roche Molecular Biochemicals)。突光 素、Cy3以及Cy5可连接至dUTP以用于直接标记。Cy3. 5和Cy7是作为用于生物素或地高 辛标记的探针的二次检测的抗生物素蛋白或抗地高辛缀合物可获得的。
[0143] 掺入至扩增的核酸中的标记如生物素可随后使用本领域熟知的灵敏方法进行检 测。例如，生物素可使用链霉亲和素-碱性磷酸酶缀合物（Tr 〇piX，Inc.)进行检测，其与生 物素结合并且随后通过适合的底物（例如，化学发光底物csro :二钠，3-(4-甲氧基螺-[1， 2，-二氧杂环丁烧-3-2' -(5'-氯）二环[3. 3.1. I3'7]癸烧]_4_基）憐酸苯酯；Tropix， Inc.)的化学发光进行检测。标记还可以是酶，如碱性磷酸酶、大豆过氧化物酶、辣根过氧化 物酶以及聚合酶，所述酶可例如用化学信号扩增或通过使用酶的底物来进行检测，所述底 物产生光（例如，化学发光1，2_二氧杂环丁烷底物）或荧光信号。
[0144] 组合两种或更多种这些标记的分子也被认为是标记。任何已知标记可以与所公开 的探针、标签以及方法一起使用以便使用所公开的方法标记并且检测所扩增的核酸。用于 检测和测量由标记产生的信号的方法也是本领域技术人员已知的。例如，放射性同位素可 通过闪烁计数或直接可视化检测；荧光分子可用荧光分光光度计检测；磷光分子可用分光 光度计检测或用照相机直接可视化；酶可通过检测或可视化由所述酶催化的反应的产物来 进行检测；抗体可通过检测与所述抗体偶联的二级标记来进行检测。如本文所用，检测分子 是与扩增的核酸相互作用并且一种或多种标记所偶联的分子。
[0145] 应了解并且本文考虑，评估具体mRNA是否增加或mRNA的表达是否发生或具体 mRNA是否存在的一种方法是通过与对照样品进行比较。因此，本文考虑诊断受试者中的癌 症的方法，所述方法包括用来自所述受试者的组织样品的mRNA进行实时PCR、RT-PCR、或其 它PCR反应；其中所述聚合酶链式反应（RT-PCR)包括能够与一个或多个ROSl序列特异性 地杂交的至少一个反向引物和至少一个正向引物；其中扩增产物的量相对于对照物的增加 指示ROSl相关癌症的存在；并且其中所获得的对照组织是非癌组织。应进一步了解关于 ROSl相关癌症，非癌组织对照物的使用可利用但不是必要的，因为还可使用来自非ROSl相 关癌症的癌组织。因此，本文公开诊断受试者中ROSl相关癌症的方法，所述方法包括对来 自所述受试者的组织样品的mRNA进行实时PCR或反转录-PCR(RT-PCR)反应；其中所述聚 合酶链式反应包括能够与一个或多个ROSl序列特异性地杂交的反向引物和至少一个正向 引物；并且其中扩增产物的量相对于对照物的增加指示ROSl相关癌症的存在；并且其中对 照组织是从非ROSl相关癌组织获得。
[0146] 所公开的方法可以用于诊断其中在本文被称为"癌症"的不受控制的细胞增殖发 生的任何疾病。不同类型的ROSl相关癌症的非限制性列表如下：淋巴瘤（霍奇金氏和非霍 奇金氏）、白血病、癌、实体组织癌、鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤、神经胶质瘤、高级神经胶质瘤、 胚细胞瘤、成神经细胞瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、黑色素瘤、腺瘤、缺氧肿瘤、骨髓瘤、AIDS 相关淋巴瘤或肉瘤、转移性癌症或一般癌症。
[0147] 所公开的方法可用于诊断的癌症的代表性但非限制性列表如下：淋巴瘤、B细胞 淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿、霍奇金氏病、髓细胞性白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统 癌、头颈癌、头颈鳞状细胞癌、肾癌、肺癌（lung cancer)如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、 成神经细胞瘤/成胶质细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肝癌、黑色素瘤，口腔、 咽、喉和肺的鳞状细胞癌，结肠癌、胆管癌、结肠直肠癌、宫颈癌（cervical cancer)、宫颈癌 (cervical carcinoma)、乳腺癌和上皮癌、肾癌、泌尿生殖器癌、肺癌（pulmonary cancer)、 食道癌、头颈癌、大肠癌、造血癌、睾丸癌、结肠和直肠癌、前列腺癌或胰腺癌。
[0148] 因此，本文公开诊断癌症的方法，其中所述癌症选自由以下各项组成的组：非小细 胞肺癌、弥散性大B细胞淋巴瘤、系统性组织细胞增多症、乳腺癌、结肠直肠癌、食管鳞状细 胞癌、间变性大细胞淋巴瘤、成神经细胞瘤、胆管癌、肾癌、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤以及 炎性肌纤维母细胞肿瘤（IMT)。例如，本文公开诊断受试者中ROSl相关癌症的方法，所述方 法包括对来自所述受试者的组织样品的mRNA进行实时PCR、RT-PCR或其它PCR反应；其中 所述聚合酶链式反应包括能够与一个或多个ROSl序列特异性地杂交的反向引物和至少一 个正向引物；其中扩增产物的量相对于对照物的增加指示ROSl相关癌症的存在，并且其中 所述癌症选自由以下各项组成的组：非小细胞肺癌、弥散性大B细胞淋巴瘤、系统性组织细 胞增多症、乳腺癌、结肠直肠癌、食管鳞状细胞癌、间变性大细胞淋巴瘤、成神经细胞瘤、胆 管癌、肾癌、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤以及炎性肌纤维母细胞肿瘤（IMT)。
[0149] 评估针对ROSl的治疗的适合性的方法
[0150] 虽然不希望受现有理论束缚，据信用小分子药物候选物抑制这些形式的RTK基因 消除相关的异常细胞增殖并且促进成神经细胞瘤和其它RTK相关肿瘤细胞系中的细胞凋 亡；此外，临床前动物模型和使用这些抑制剂的早期临床经验两者均表明，RTK小分子抑制 剂不仅具有针对RTK相关癌症的显著抗肿瘤活性，而且对无限制性靶标相关的毒性还是良 好耐受的。
[0151] 这些发现突出了对于ROSl突变的专门化的诊断测试的需要。例如，这种测定可用 于筛选受遗传性成神经细胞瘤影响的家庭中的儿童以帮助促进在早期阶段检测肿瘤，此时 所述肿瘤更易于进行治疗。因此，本文公开评估受试者中针对癌症的ROSl抑制剂治疗的适 合性的方法，所述方法包括测量来自所述受试者的组织样品的核酸；其中ROSl序列mRNA的 量相对于对照物的增加指示可以用ROSl抑制剂治疗的癌症。
[0152] 应了解并且本文考虑，本文所公开的任何所公开的mRNA测量技术可用于这些方 法中。因此，例如，本文公开评估受试者中针对癌症的ROSl抑制剂治疗的适合性的方法，所 述方法包括用来自所述受试者的组织样品的mRNA或DNA进行实时PCR、RT-PCR或其它PCR 反应；其中所述PCR反应包括能够与一个或多个ROSl序列特异性地杂交的反向引物和至少 一个正向引物；并且其中扩增产物的量相对于对照物的增加指示可用ROSl抑制剂治疗的 癌症。应进一步了解所公开的方法可进一步包括本文所公开的任何引物并且利用所公开的 多重PCR技术。
[0153] 因此，一方面，本文公开在受试者中评估疾病或病状的易感性或风险、监测疾病进 展、确定癌症对于治疗性ROSl抑制剂治疗的易感性或抗性、或确定针对与核酸变异、截短 或TOSl融合相关的癌症的ROSl抑制剂治疗的适合性的方法，所述方法包括检测来自所述 受试者的组织样品的DNA、cDNA的存在或测量DNA、cDNA的水平或mRNA的表达水平；其中 ROSl激酶的扩增产物的量相对于不存在野生型ROSl的相应增加的对照物的增加指示ROSl 相关癌症的存在，并且因此指示对ROSl抑制剂治疗易感的癌症的存在。这类方法可用扩增 方法如PCR、实时PCR、RT-PCR或实时RT-PCR或通过进行原位杂交方法如FISH来完成。
[0154] 一方面，本文公开用于确定患有癌症的受试者中对于ROSl抑制剂的癌症的治疗 性治疗的易感性或抗性或针对癌症的ROSl治疗剂治疗的适合性的方法，所述方法包括检 测ROSl激酶活性的存在。因此，例如，本文公开确定患有癌症的受试者中针对ROSl相关 癌症的治疗性治疗的易感性或抗性或待用ROSl抑制剂治疗的癌症的适合性的方法，所述 方法包括从所述受试者获得组织样品，从所述组织样品分离核酸，对所述核酸进行RT-PCR、 实时PCR、或实时RT-PCR，以及检测所述组织样品中与野生型ROSl和ROSl激酶结构域相关 的核酸的存在或测量所述核酸的量，其中所述RT-PCR或实时PCR反应包括使用与野生型 ROSl序列（例如，ROSl的细胞外结构域序列，如SEQ ID NO :13、14、20以及21)特异性地 杂交的正向和反向引物对和/或与野生型ROSl激酶结构域序列（例如，SEQ ID SO :4、5、 7、8、15、16、17以及18)特异性地杂交的正向和反向引物对，以及检测所述组织样品中与野 生型ROSl和ROSl激酶结构域两者之一或两者的组合相关的核酸的存在或测量所述核酸的 量，其中扩增子相对于正常对照物的增加或扩增子的存在指示所述受试者患有ROSl相关 癌症并且因此对用ROSl抑制剂治疗是易感的。不存在扩增子或扩增子水平等于正常对照 物指示所述癌症不对ROSl治疗易感并且将对这种治疗具有抗性。还公开用于确定患有癌 症的受试者中对于针对ROSl相关癌症的治疗性治疗的易感性或抗性或待用ROSl抑制剂治 疗的癌症的适合性的方法，所述方法包括从所述受试者获得组织样品，从所述组织样品分 离核酸，其中来自所述组织样品的核酸为RNA，其中所述方法进一步包括从所述RNA样品合 成cDNA，对所述cDNA进行PCR ;以及检测所述组织样品中与野生型ROSl和ROSl激酶结构 域两者之一或两者的组合相关的核酸的存在或测量所述核酸的量，其中扩增子相对于正常 对照物的增加或扩增子的存在指示所述受试者患有ROSl相关癌症。另一方面，所公开的方 法可使用与具有实时RT-PCR的产物的序列（例如，SEQ DI NO :6、8、19以及22)互补的探 针，或所述方法可包括确定野生型ROSl和野生型ROSl激酶的循环阈值（Ct)值；其中野生 型ROSl相对于ROSl激酶的高（Ct)值指示融合的存在并且因此指示所述癌症对用ROSl抑 制剂治疗易感或ROSl抑制性治疗适合用于所述癌症。在使用探针的情况下，应了解探针可 包含在其一端上的报道染料和在其另一端上的淬灭染料。当癌症被确定为对用ROSl抑制 剂治疗易感或适合用于用ROSl抑制剂治疗时，还公开以下方法：所述方法进一步包括向患 有对ROSl抑制剂治疗易感的癌症的患者施用ROSl抑制剂。相反，在癌症不对ROSl抑制剂 易感的情况下，所述方法可进一步包括使用不同于ROSl抑制剂的治疗形式来治疗患有所 述癌症的受试者。
[0155] 在用于确定患有癌症的受试者中针对ROSl相关癌症的治疗性治疗的易感性或 抗性或待用ROSl抑制剂治疗的癌症的适合性的另一种替代方法中，通过使用两步检测的 qPCR方法来检测ROSl融合，其中在第一反应中仅使用与ROSl融合配偶体结合的正向引物， 并且其中在所述第一反应之后的第二反应中，来自所述第一反应的扩增子用作第二扩增、 基于探针的检测或测序反应的模板，其中所使用的探针或引物对融合断裂点的ROSl 3'具 有特异性，并且其中在来自所述第二反应的扩增子中检测到ROSl指示ROSl融合并且因此 指示对ROSl抑制剂治疗易感的ROSl相关癌症。此外，公开用于确定患有癌症的受试者中 对于针对ROSl相关癌症的治疗性治疗的易感性或抗性或待用ROSl抑制剂治疗的癌症的 适合性的方法，所述方法包括从所述受试者获得组织样品，从所述组织样品分离核酸，使用 与ROSl融合配偶体结合的正向引物进行第一扩增反应；其中来自所述第一反应的扩增子 用作第二扩增反应的模板；在所述第一反应之后进行第二扩增反应，其中对于融合断裂点 的ROSl序列3'具有特异性的引物用于所述第二扩增反应中（例如，SEQ ID NO :4、5、7、8、 15、16、17以及18);以及检测来自所述第二反应的扩增子中ROSl的存在；其中在来自所述 第二反应的扩增子中检测到ROSl指示ROSl融合的存在；并且检测所述组织样品中与ROSl 激酶结构域相关的核酸的存在，其中扩增子的存在指示所述受试者将是对用ROSl抑制剂 治疗易感的并且存在在扩增子将指示所述癌症对ROSl抑制剂治疗具有抗性或不具有易感 性。当癌症被确定为对用ROSl抑制剂治疗易感或适合用于用ROSl抑制剂治疗时，还公开以 下方法：所述方法进一步包括向患有对ROSl抑制剂治疗易感的癌症的患者施用ROSl抑制 齐U。相反，在癌症不对ROSl抑制剂易感的情况下，所述方法可进一步包括使用不同于ROSl 抑制剂的治疗形式来治疗患有所述癌症的受试者。
[0156] 筛选方法
[0157] 本文所公开的ROSl融合是癌症治疗的靶标。因此，本文公开在受试者中针对抑制 ROSl相关癌症的药剂进行筛选的方法，所述方法包括
[0158] a)从患有ROSl相关癌症的受试者获得组织样品；
[0159] b)从所述组织样品提取mRNA ;
[0160] c)使所述组织样品与所述药剂相接触；
[0161] d)对来自所述组织样品的mRNA进行实时PCR、RT-PCR或其它PCR反应；
[0162] 其中所述RT-PCR反应包括能够与一个或多个ROSl序列特异性地杂交的反向引物 和至少一个正向引物；并且其中指示ROSl融合的扩增产物的量相对于未治疗的对照物的 减少指不可抑制ROSl相关癌症的药剂。应了解并且本文考虑通过所述药剂有效治疗的一 个度量是融合断裂点的ROSl 5'的扩增子的循环阈值相对于未治疗的对照物的减少。应了 解并且本文考虑进行RT-PCR反应的过程涉及从分离的RNA合成cDNA并且对所述cDNA进 行 PCR。
[0163] 核酸
[0164] 所公开的方法和组合物利用各种核酸。一般来说，任何核酸可用于所公开的方法 中。例如，所公开的目标核酸和所公开的参考核酸可基于所需分析和待获得或评估的信息 进行选择。所公开的方法还产生新的和改变的核酸。这类核酸的性质和结构将通过以下方 式形成：其中所述核酸在所述方法中产生和操作。因此，例如，延伸产物和杂交核酸在所公 开的方法中产生。如本文所用，杂交核酸是延伸产物和第二核酸的杂交体。
[0165] 应了解并且本文考虑目标核酸可以是任何核酸，对于所述核酸来说需要确定核苷 酸变异的存在或不存在。因此，例如，目标核酸可包含对应于参考核酸的野生型序列的序 列。本文进一步公开，所公开的方法可在以下情况下进行：其中第一核酸是参考核酸并且第 二核酸是目标核酸，或其中第一核酸是目标核酸并且第二核酸是参考核酸。
[0166] 应了解并且本文考虑，参考核酸可以是目标核酸有待针对其进行比较的任何核 酸。通常，参考核酸具有已知序列（和/或已知具有作为参考的目标序列）。虽然不要求， 但以下情况是有用的：如果参考序列与目标核酸具有已知或疑似的紧密关系。例如，如果希 望检测单个核苷酸变异，参考序列可以被有用地选择为以下序列：所述序列是目标核酸的 同系物或与目标核酸紧密匹配，如来源于来自相同或相关生物体或个体的相同基因或遗传 元件的核酸。因此，例如，本文考虑参考核酸可包含野生型序列或可替代地包含已知突变， 包括例如以下突变：所述突变的存在或不存在与疾病或对治疗性治疗的抗性相关。因此，例 如，考虑所公开的方法可用于通过以下方式来检测或诊断目标核酸中已知突变的存在：通 过将目标核酸与包含野生型序列（即，已知不具有所述突变）的参考核酸进行比较并且针 对目标核酸中变异的存在或不存在进行检查，其中不存在变异将指示不存在突变。或者，参 考核酸可具有已知突变。因此，例如，考虑所公开的方法可用于通过以下方式来检测疾病或 病状的易感性：通过将目标核酸与包含已知突变（其指示对于疾病的易感性）的参考核酸 进行比较并且检查所述突变的存在或不存在，其中所述突变的存在指示疾病。
[0167] 在本文，术语"核苷酸变异"是指目标核酸的核苷酸序列相对于参考核酸的核苷酸 序列的任何变化或不同。因此，核苷酸变异据说在以下情况下发生：当参考核酸与目标核酸 (或其互补序列，如在上下文中适当的）之间的序列不同时。因此，例如，核酸中特定位置处 腺嘌呤（A)对鸟嘌呤（G)的取代将是核苷酸变异，其条件是参考核酸包含在相应位置处的 A。应了解并且本文考虑确定变异是基于参考核酸并且不指示序列是否是野生型的。因此， 例如，当具有已知突变的核酸用作参考核酸时，不具有所述突变的核酸（包括野生型核酸） 将被认为具有核苷酸变异（相对于参考核酸）。
[0168] 核苷酸
[0169] 所公开的方法和组合物利用各种核苷酸。在整个本申请中和本文所公开的方法参 考了核苷酸的碱基类型。应了解并且本文考虑其中在参考一种类型的碱基的情况下，这是 指在核酸链中的核苷酸中能够与限定组的一个或多个规范碱基杂交（结合）的碱基。因此， 例如，在参考在存在三种类型的核酸酶抗性的核苷酸和不存在包含相同类型的碱基作为修 饰的核苷酸的核苷酸的情况下延伸的延伸产物的情况下，这意味着例如如果所述修饰的核 苷酸的碱基是腺嘌呤（A)，那么所述核酸酶抗性的核苷酸可以是例如鸟嘌呤（G)、胸腺嘧啶 (T)以及胞嘧啶（C)。这些碱基（其表示四种规范碱基）各自能够与所述四种规范碱基中 的不同的一个杂交并且因此各自适合作为如本文所定义的不同类型的碱基。作为另一个实 例，肌苷碱基主要与腺嘌呤和胞嘧啶（DNA中）配对，并且因此可被认为是与腺嘌呤和胞嘧 啶（分别与胸腺嘧啶和鸟嘌呤配对的碱基）不同类型的碱基，但不是与鸟嘌呤或胸腺嘧啶 不同类型的碱基（分别与胞嘧啶和腺嘌呤配对的碱基），因为鸟嘌呤和胸腺嘧啶的碱基配 对与肌苷的杂交模式重叠（即，没有不同）。
[0170] 任何类型的修饰的或替代碱基可用于所公开的方法和组合物中，通常仅受用于使 用这类碱基的酶的能力的限制。许多修饰的和替代核苷酸和碱基是已知的，它们中的一些 在下文和本文的其它地方进行了描述。这类修饰的和替代碱基所表示的碱基的类型可通过 如本文所描述的所述碱基的碱基配对的模式来确定。因此，例如，如果所修饰的核苷酸是腺 嘌呤，那么主要与胸腺嘧啶碱基配对的任何类似物、衍生物、修饰的或变体碱基将被认为是 与腺嘌呤相同类型的碱基。换句话说，只要类似物、衍生物、修饰的或变体具有与另一个碱 基相同模式的碱基配对，它就可被认为是相同类型的碱基。可对核苷酸的糖基或磷酸酯基 进行修饰。通常这类修饰将不会改变所述碱基的碱基配对模式。然而，核酸链中核苷酸的 碱基配对模式决定所述核苷酸中碱基的碱基类型。
[0171] 待掺入至延伸产物中并且待通过所公开的方法中的所公开的药剂选择性地去除 的修饰的核苷酸可以是任何修饰的核苷酸，所述核苷酸如本文其它地方所描述根据需要在 所公开的方法中起作用。修饰的核苷酸还可在现有核酸链中产生，如通过例如化学修饰、酶 修饰或组合的延伸产物。
[0172] 许多类型的核酸酶抗性核苷酸是已知的并且可用于所公开的方法中。例如，具有 修饰的磷酸酯基和/或修饰的糖基的核苷酸可以是对一种或多种核酸酶抗性的。核酸酶抗 性在本文被定义为对通过任何一种或多种核酸酶从核酸去除是抗性的。通常，特定核苷酸 的核酸酶抗性可就相关核酸酶而言进行定义。因此，例如，如果特定核酸酶用于所公开的方 法中，那么核酸酶抗性的核苷酸仅需要对所述特定核酸酶是抗性的。有用的核酸酶抗性的 核苷酸的实例包括硫代修饰的核苷酸和硼烷合修饰的核苷酸。
[0173] 存在多种本文所公开的为基于核酸的分子。这些和其它分子的非限制性实例在 本文进行论述。应了解，例如核苷酸是包含碱基部分、糖部分以及磷酸部分的分子。核苷 酸可通过其产生核苷间键联的磷酸部分和糖部分来连接在一起。核苷酸的碱基部分可为 腺嘌呤-9-基（腺嘌呤，A)、胞嘧啶-1-基（胞嘧啶，C)、鸟嘌呤-9-基（鸟嘌呤，G)、尿嘧 啶-1-基（尿嘧啶，U)以及胸腺嘧啶-1-基（胸腺嘧啶，T)。核苷酸的糖部分是核糖或脱 氧核糖。核苷酸的磷酸部分是五价磷酸。核苷酸的非限制性实例将是3' -AMP(3'-腺苷 单磷酸）或5' -GMP (5'-鸟苷单磷酸）。
[0174] 核苷酸类似物是含有碱基、糖或磷酸部分的某种类型修饰的核苷酸。对碱基部 分的修饰将包括A、C、G和T/U以及不同的嘌呤或嘧啶碱基的天然和合成修饰，如尿嘧 啶-5-基（Ψ)、次黄嘌呤-9-基（肌苷，I)、以及2-氨基腺嘌呤-9-基。修饰的碱基包括 但不限于5-甲基胞嘧啶（5-甲基-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、 腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生 物、2-硫脲嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿 嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶（假尿嘧啶）、4_硫脲嘧啶、 8_卤代、8-氨基、8-氢硫基、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤 代，特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基 腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌 呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的碱基修饰可例如在美国专利号3, 687, 808中找到，所述美国专 利针对其碱基修饰的教义整体并入本文。某些核苷酸类似物，如5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧 啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔 基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶可增加双链体形成的稳定性。经常时基修饰可与例如糖修饰（如 2' -0-甲氧基乙基）组合以便实现独特特性，如增加的双链体稳定性。
[0175] 核苷酸类似物还可包括糖部分的修饰。对糖部分的修饰将包括核糖和脱氧核糖的 天然修饰以及合成修饰。糖修饰包括但不限于在W位置处的以下修饰：0H;F ;0-、S-或 N-烷基；0-、S-或N-烯基；0-、S-或N-炔基；或0-烷基-0-烷基，其中所述烷基、烯基和炔 基可为取代的或未取代的：Cl至ClO烷基或C2至ClO烯基和炔基。2'糖修饰还包括但不 限于 _〇[(CH2)n 0]m CH3、-0(CH2)n 0CH3、-0(C H2)n NH2、-0(CH2)n CH3、-0(CH2)n-0NH2、 以及-0(CH2)n0N[(C H2)n CH3)]2,其中 n 和 m 是从 I 至约 10。
[0176] 2'位置处的其它修饰包括但不限于：Cl至ClO低级烷基、取代的低级烷基、烷芳 基、芳烷基、〇-烷芳基或 〇-芳烷基，SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、0CF3、S0CH3、S02CH3、 0N02、N02、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、 RNA裂解基团、报道基团、嵌入剂、用于改进寡核苷酸的药物代谢动力学特性的基团或用于 改进寡核苷酸的药效学特性的基团，以及具有类似特性的其它取代基。类似修饰还可在糖 上的其它位置处进行，特别是:V端核苷酸上或2' -5'连接型寡核苷酸中的糖的:V位置 和Y端核苷酸的Y位置。修饰的糖还将包括包含在桥接环氧处的修饰如CH2和S的那 些。核苷酸糖类似物还可具有糖模拟物（如环丁基部分）以替代戊呋喃糖基糖。
[0177] 核苷酸类似物还可在磷酸部分处进行修饰。修饰的磷酸部分包括但不限于那些可 进行修饰以使得两个核苷酸之间的键联包含以下的那些：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二 硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯包括3'-亚烷基膦酸 酯和手性膦酸酯、亚膦酸酯、氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、 硫羰氨基磷酸酯、硫羰磷酸烷基酯、硫羰烷基磷酸三酯以及硼磷酸酯。应了解两个核苷酸之 间的这些磷酸或修饰的磷酸键联可通过3' -5'键联或2' -5'键联，并且所述键联可包含反 转的极性如3'-5'至5' -3'或2'-5'至5'-2'。还包括各种盐、混合盐以及游离酸形式。
[0178] 应了解核苷酸类似物仅需要包含单个修饰，但还可包含所述部分中的一个内或不 同部分之间的多重修饰。
[0179] 核苷酸取代物是具有与核苷酸类似的功能特性、但不含有磷酸部分的分子，如肽 核酸（PNA)。核苷酸取代物是将以Watson-Crick或Hoogsteen方式来识别核酸、但通过不 同于磷酸部分的部分连接在一起的分子。在与适当的靶标核酸相互作用时，核苷酸取代物 能够符合双螺旋类型结构。
[0180] 核苷酸取代物是磷酸部分和/或糖部分已经被替代的核苷酸或核苷酸类似物。核 苷酸取代物不包含标准磷原子。磷酸的取代物可以是例如，短链烷基或环烷基核苷间键联、 混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键联、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键联。 这些包括具有以下的那些：吗啉代键联（部分由核苷的糖部分形成）；硅氧烷主链；硫化 物、亚砜和砜主链；甲酰基（formacetyl)和硫代甲酰基主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基 主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺 主链；酰胺主链；以及具有混合的N、0、S和CH2组成部分的其它主链。
[0181] 还应了解在核苷酸取代物中，核苷酸的糖部分和磷酸部分两者均可通过例如酰 胺类型键联（氨基乙基甘氨酸）（PNA)被替代。美国专利5, 539, 082 ;5, 714, 331 ;以及 5, 719, 262教导如何制备和使用PNA分子，所述专利各自以引用的方式并入本文。
[0182] 还有可能将其它类型的分子（缀合物）连接至核苷酸或核苷酸类似物。缀合物可 化学连接至核苷酸或核苷酸类似物。这类缀合物包括但不限于脂质部分，如胆固醇部分、 胆酸、硫醚（例如己基-S-三苯甲基硫醇基）、硫代胆固醇、脂肪族链（例如十二烷二醇或 十一烷基残基）、磷脂（例如二-十六烷基-外消旋-甘油或1，2-二-0-十六烷基-外消 旋-甘油-3-H-膦酸三乙铵）、聚胺或聚乙二醇链或金刚烷乙酸、棕榈基部分、或十八烷基胺 或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。
[0183] Watson-Crick相互作用是至少一个与核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代物的 Watson-Crick端面的相互作用。核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代物的Watson-Crick端 面包括基于嘌呤的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代物的C2、Nl和C6位置，和基于嘧啶 的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代物的C2、N3、C4位置。
[0184] Hoogsteen相互作用是在核苷酸或核苷酸类似物的Hoogsteen端面上发生的相互 作用，所述端面暴露于双链DNA的大沟中。Hoogsteen端面包括噪呤核苷酸的C6位置处的 N7位置和反应性基团（NH2或0)。
[0185] 杂交/选择性杂交
[0186] 术语杂交通常意指至少两个核酸分子如引物或探针与基因之间的序列驱动的相 互作用。序列驱动的相互作用意指以核苷酸特异性方式在两个核苷酸或核苷酸类似物或核 苷酸衍生物之间发生的相互作用。例如，G与C相互作用或A与T相互作用是序列驱动的相 互作用。通常序列驱动的相互作用在核苷酸的Watson-Crick端面或Hoogsteen端面上发 生。两种核酸的杂交受本领域技术人员已知的多个条件和参数影响。例如，盐浓度、pH以 及反应温度都影响两个核酸分子是否将会杂交。
[0187] 用于两个核酸分子之间的选择性杂交的参数是本领域技术人员熟知的。例如，在 一些实施方案中，选择性杂交条件可以被定义为严格杂交条件。例如，杂交的严格度受杂交 步骤和洗涤步骤中的任一者或两者的温度和盐浓度两者控制。例如，用于实现选择性杂交 的杂交条件可涉及在低于Tm(-半分子从其杂交配偶体解离的解链温度）约12°C至25°C 的温度下在高离子强度溶液SSC或6X SSPE)中杂交，接着在所选择的温度和盐浓度的 组合下洗涤，以使得洗涤温度是低于Tm约5°C至20°C。温度和盐条件可凭初步实验中的经 验容易地确定，在初步实验中，使固定在滤膜上的参考DNA的样品与标记的目标核酸杂交， 并且然后在不同的严格度条件下洗涤。对于DNA-RNA和RNA-RNA杂交来说，杂交温度通常 较高。所述条件可如以上所描述来使用以实现严格度，或如本领域所已知。用于DNA=DNA 杂交的优选严格杂交条件可以是在约68°C下（在水溶液中）在6X SSC或6X SSPE中，接着 在68°C下洗涤。如果需要，杂交和洗涤的严格度可随着减少所需的互补性程度而相应地降 低，并且进一步取决于其中搜索变异性的任何区域的G-C或A-T丰度。同样，如果需要，杂 交和洗涤的严格度可随着所需的同源性增加而相应地增加，并且进一步取决于其中需要高 同源性的任何区域的G-C或A-T丰度，均如本领域所已知。
[0188] 用于定义选择性杂交的另一种方式是通过查看所述核酸中的一种与另一种核酸 结合的量（百分比）。例如，在一些实施方案中，选择性杂交条件将是当至少约60、65、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99、100百分比的限制性核酸与非限制性核酸结合时。通常，非限制性引物是呈例 如10或100或1000倍过量。这种类型的测定可在以下条件下进行，其中限制性和非限制 性引物两者均是例如低于其k d10倍或100倍或1000倍，或其中所述核酸分子中的仅一个 是10倍或100倍或1000倍或其中一个或两个核酸分子高于其k d。
[0189] 用于定义选择性杂交的另一种方式是通过查看在杂交被要求促进所需的酶操作 的条件下得到酶操作的引物的百分比。例如，在一些实施方案中，选择性杂交条件将是当至 少约 60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99、100百分比的引物在促进酶操作的条件下进行酶操作时，例如 如果酶操作是DNA延伸，那么选择性杂交条件将是当至少约60、65、70、71、72、73、74、75、 76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100 百 分比的引物分子被延伸时。条件还包括由制造商建议的或本领域中所指示的如对于进行操 作的酶来说适当的那些。
[0190] 正如同源性一样，应了解存在多种本文所公开的方法用于确定两个核酸分子之间 的杂交水平。应了解这些方法和条件可提供两个核酸分子之间的不同百分比的杂交，但除 非另外指明，否则满足任何方法的参数将是足够的。例如，如果需要80%杂交并且只要杂交 在这些方法中的任一种中的所要求的参数内发生，那么它被认为是本文所公开的。
[0191] 应了解，本领域技术人员了解如果组合物或方法满足用于一起或单独地确定杂交 的这些标准中的任一个，那么它就是本文所公开的组合物或方法。
[0192] 试剂盒
[0193] 本文公开被抽入至可用于实践本文所公开的方法的试剂的试剂盒。具体地说，所 述试剂盒可包括本文所讨论的或将被理解为是实践所公开的方法中所要求的或有益的任 何试剂或试剂的组合。例如，所述试剂盒可包括一个或多个本文所公开的引物以便进行在 所述方法的某些实施方案中所讨论的延伸、复制和扩增反应；以及如所意图地使用所述引 物所需的缓冲液和酶。
[0194] 应了解为了检测ROSl相关融合，可使用与野生型ROSl杂交的反向引物。因此，本 文公开包括至少一个反向引物的试剂盒，其中所述反向引物与野生型ROSl的一部分如野 生型ROSl的激酶结构域杂交。另外，应了解本文所公开的试剂盒可包括与ROSl和/或野 生型ROSl的融合配偶体特异性地杂交的一个或多个正向引物。因此，例如，正向引物可与 野生型ROSl杂交，如ROSl融合的断裂点区域（即，融合断裂点的3'）、CD74、FIG、SLC34A2 或其它融合配偶体外部的ROSl序列。本领域技术人员能够理解适合的是具有包括多于单 个引物或引物对并且可包括例如单个反向引物如SEQ ID NO :5、8、12、14、15、18或21和多 个正向引物的试剂盒。或者，试剂盒可包括用于融合断裂点（即，融合断裂点的3'）外部 的野生型ROSl的引物对和用于ROSl激酶的引物对。试剂盒可进一步包括与野生型ROSl、 ⑶74、FIG、SLC34A2特异性地杂交的一个或多个正向引物和/或一个或多个反向引物。
[0195] 因此，一方面，本文公开用于诊断ROSl相关癌症或确定癌症对于治疗的易感性或 用于癌症的治疗的适合性的试剂盒，所述试剂盒包括（a)用第一检测试剂标记的第一引 物，其中所述第一引物是反向引物，其中所述反向引物是与编码SEQ ID NOl的氨基酸序列 的第一多核苷酸或其互补序列杂交的一个或多个多核苷酸；以及（b)至少一个第二引物， 其中所述第二引物是正向引物，其中所述正向引物是与编码野生型ROSl的第二多核苷酸 杂交的一个或多个多核苷酸。
[0196] 本文还公开包括与ROSl的E⑶（例如SEQ ID NO : 13和20)特异性地结合的一个 或多个正向引物的试剂盒。还公开包括与ROSl激酶结构域（例如SEQ ID NO :4、7、15或 17)特异性地结合的一个或多个正向引物的试剂盒。应了解试剂盒可包括对于ROSl的ECD 和激酶结构域具有特异性的一个或多个正向引物。还公开进一步包括对于ROSl的E⑶（例 如，SEQ ID NO :14和21)具有特异性的一个或多个反向引物的试剂盒。还公开包括与ROSl 激酶结构域（例如SEQ ID NO :5、8、12、16以及18)特异性地结合的一个或多个反向引物的 试剂盒。还公开包括对于ROSl的ECD和激酶结构域具有特异性的一个或多个反向引物的 组合的试剂盒。应进一步了解本文所公开的任何一个或多个正向引物可在试剂盒中与一个 或多个反向引物进行组合。因此，本文公开包括一个或多个正向引物例如像ROSl特异性正 向引物（SEQ ID NO :4、7、13、15、17或20)和/或一个或多个ROSl特异性反向引物（SEQ ID N0:5、8、12、14、16、18 以及 21)的试剂盒。
[0197] 本文还公开包括一个或多个多核苷酸探针的试剂盒，其中所述一个或多个探针的 是约20至约30个核苷酸长并且包括在其一端上的报道染料和在其另一端上的淬灭染料， 例如像 SEQ ID N0:6、9、19 或 22。
[0198] 应了解所公开的试剂盒还可包括对照物以便确保本文所公开的方法是适当起作 用的并且以便标准化测定之间的结果。因此，例如，本文公开阳性cDNA对照物、阴性cDNA对 照物以及对照引物对。例如，所公开的试剂盒可包括用于检测以下各项的对照引物对：智人 ATP合酶、H+转运、线粒体的Fl复合物、O亚单位（ATP50)、编码线粒体蛋白mRNA的核基因； 智人NADH脱氢酶（泛醌）1 α亚复合物、2,8kDa (NDUFA2)、mRNA ;智人甘油醛-3-磷酸脱氢 酶（GAPDH)、mRNA ;智人H3组蛋白、家族3A(H3F3A)、mRNA ;智人蛋白酶体（前体，巨蛋白因 子）亚单位、β类型、4(PSMB4)、mRNA ;智人核糖体蛋白S27a(RPS27A)、转录物变体UmRNA ; 智人真核翻译起始因子4A、同种型2 (EIF4A2)、mRNA ;智人核糖体蛋白L18 (RPL18)、mRNA ;智 人腺苷脱氨酶、RNA-特异性（ADAR)、转录物变体1、mRNA ;或智人细胞色素 c氧化酶亚单位 Vb (C0X5B)、mRNA。引物对的实例包括但不限于表1中所找到的引物对。
[0199]表 1
【权利要求】
1. 一种诊断患有癌症的受试者中R0S1相关癌症的方法，所述方法包括从所述受试者 获得组织样品，从所述组织样品分离核酸，对所述核酸进行核酸扩增过程，以及检测所述组 织样品中与野生型R0S1和R0S1激酶结构域两者之一或两者的组合相关的核酸的存在或测 量所述核酸的量，其中扩增子相对于正常对照物的增加或扩增子的存在指示所述受试者患 有R0S1相关癌症。
2. 如权利要求1所述的方法，其中来自所述组织样品的所述核酸是RNA，其中所述方法 进一步包括从所述RNA样品合成cDNA，并且其中所述方法包括对所述cDNA进行PCR。
3. 如权利要求1所述的方法，其中所述核酸扩增过程是反转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)。
4. 如权利要求2所述的方法，其中所述RT-PCR是实时RT-PCR。
5. 如权利要求4所述的方法，其中所述实时RT-PCR采用与具有所述实时RT-PCR的产 物的序列互补的探针，并且其中所述探针具有在其一端上的报道染料和在其另一端上的淬 灭染料。
6. 如权利要求5所述的方法，其中所述探针选自由SEQ ID NO :6、9、19、或22组成的 组。
7. 如权利要求1所述的方法，其中所述核酸扩增过程是实时PCR。
8. 如权利要求2、3或7所述的方法，其中所述PCR、RT-PCR或实时PCR反应包括使用 与野生型R0S1序列特异性地杂交的正向和反向引物对以及与野生型R0S1激酶结构域序列 特异性地杂交的正向和反向引物对。
9. 如权利要求8所述的方法，其中至少一个反向引物SEQ ID NO. 5、8、12、14、15、18或 21。
10. 如权利要求9所述的方法，其中至少一个正向引物包含SEQ ID NO :4、7、13、15、17 或20。
11. 如权利要求8所述的方法，其中至少一个正向引物与野生型R0S1的细胞外区域杂 交。
12. 如权利要求12所述的方法，其中所述正向引物是SEQ ID NO :13或20。
13. 如权利要求8所述的方法，其中所述RT-PCR或实时PCR反应包括使用能够与R0S1 激酶结构域特异性地杂交的正向。
14. 如权利要求13所述的方法，其中所述正向引物是SEQ ID NO :4、7、15或17。
15. 如权利要求8所述的方法，其中所述反向引物或所述野生型R0S1和所述R0S1激酶 是同一引物。
16. 如权利要求8所述的方法，所述方法进一步包括确定野生型R0S1和野生型R0S1激 酶的循环阈值（Ct)值；其中野生型R0S1相对于R0S1激酶的高（Ct)值指示融合的存在。
17. 如权利要求1所述的方法，所述方法包括与所述融合断裂点的R0S1融合配偶体5' 结合的正向引物和与所述融合断裂点的R〇S 13 '结合的反向引物，其中所述引物延伸穿过所 述融合，其中检测到具有R0S1核酸和融合配偶体核酸两者的扩增子的存在指示融合的存 在。
18. 如权利要求1所述的方法，所述方法包括 a)使用与R0S1融合配偶体结合的正向引物的第一扩增反应；其中来自所述第一反应 的所述扩增子用作第二扩增反应的模板； b) 在所述第一反应之后的第二扩增反应，其中对于所述融合断裂点的R0S1序列3'具 有特异性的引物用于所述第二扩增反应中；以及 c) 检测来自所述第二反应的所述扩增子中R0S1的存在；其中在来自所述第二反应的 所述扩增子中检测到R0S1指示R0S1融合的存在。
19. 如权利要求1所述的方法，其中所述癌症选自由以下各项组成的组：成神经细胞 瘤、乳癌、卵巢癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、弥散性大B细胞淋巴瘤、食管鳞状细胞癌、间 变性大细胞淋巴瘤、成神经细胞瘤、炎性肌纤维母细胞瘤、恶性组织细胞增生症、胆管癌、肾 癌以及成胶质细胞瘤。
20. 如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括随后通过向被鉴别为患有R0S1相 关癌症的受试者施用ROS1抑制剂来治疗所述受试者。
21. -种诊断受试者中ROS1相关癌症的方法，所述方法包括将细胞中的核酸与和ROS1 激酶杂交的第一探针和与ROS1的所述融合断裂点的ROS1序列3'杂交的第二探针相接触； 其中所述探针被不同地标记；其中检测到由分离的探针所指示的破坏的基因座指示ROS1 融合的存在，所述ROS1融合的存在指示ROS1相关癌症的存在。
22. -种用于诊断ROS1相关癌症的试剂盒，所述试剂盒包括（a)用第一检测试剂标记 的第一引物，其中所述第一引物是反向引物，其中所述反向引物是与编码SEQ ID NO 1的氨 基酸序列的第一多核苷酸或其互补序列杂交的一个或多个多核苷酸；以及（b)至少一个第 二引物，其中所述第二引物是正向引物，其中所述正向引物是与编码野生型R〇S 1的第二多 核苷酸杂交的一个或多个多核苷酸。
23. 如权利要求22所述的试剂盒，其中所述正向引物与野生型R0S1的细胞外区域特异 性地杂交。
24. 如权利要求23所述的试剂盒，其中所述正向引物是SEQ ID NO :13或20。
25. 如权利要求22所述的试剂盒，其中所述正向引物与所述R0S1激酶结构域特异性地 杂父。
26. 如权利要求25所述的试剂盒，其中所述正向引物是SEQ ID NO :4、7、15或17。
27. 如权利要求22所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括第二正向引物和第二反向引 物。
28. 如权利要求22所述的试剂盒，其中所述反向引物是SEQ ID NO :5、8、12、14、16、18 或21。
29. 如权利要求22所述的试剂盒，其中所述第一正向引物和第一反向引物与野生型 R0S1的所述激酶结构域特异性地杂交并且所述第二正向引物和第二反向引物与野生型 R0S1特异性地杂交。
30. 如权利要求22所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括对照引物对。
31. 如权利要求30所述的试剂盒，其中所述对照引物对与C0X5B特异性地杂交。
32. 如权利要求22所述的试剂盒，其中所述第一引物和所述第二引物分别用第一检测 试剂和第二检测试剂标记。
33. 如权利要求22所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括多核苷酸探针，其中所述探 针是约20至约30个核苷酸长并且包含在其一端上的报道染料和在其另一端上的淬灭染 料。
34.如权利要求33所述的试剂盒，其中所述多核苷酸探针包含如SEQ ID NO :6、9、19或 22中所提出的序列。
【文档编号】C12Q1/68GK104364391SQ201380013401
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2013年2月8日 优先权日:2012年2月8日
【发明者】大卫·豪特, 约翰·汉德舒 申请人:因赛特遗传学公司