基于jcv-病毒样颗粒的新型药物递送系统的制作方法

基于jcv-病毒样颗粒的新型药物递送系统的制作方法
【专利摘要】本发明涉及装载药物(负荷物)的、衍化自人多瘤病毒的病毒样颗粒VLP，其作为药物递送系统用于转运所述药物到中枢神经系统，特别是活人的中枢神经系统。
【专利说明】基于JCV-病毒样颗粒的新型药物递送系统

【技术领域】
[0001] 本发明涉及人多瘤病毒类病毒样颗粒（VL巧用作药物递送系统的用途。 技术背景
[0002] 现代药物领域的一个巨大挑战是药物递送。将药物递送至所选的作用位点（例 女口，所选器官、组织、细胞类型或细胞的微室，等）被称为药物祀向。即使全身用药，通过药 物祀向增加该特定位点的药物浓度也成为可能。另外，相对于普通的全身用药，身体的其它 部位并不或者仅较低程度地暴露于药物。该导致不良副作用的风险降低和允许更高剂量的 药物。进一步地，极毒性药物（例如，用于癌症治疗的细胞毒素剂）可能第一次可用于人类， 原因是它们的毒副作用被药物递送系统最小化。在某些情况下，由于药物被递送方式所保 护，药物祀向另外的优点是防止药物过早失活（代谢）、不希望的吸收、排泄或不希望的修 饰。
[0003] 由于活性成分首先必须通过血脑屏障，之后必须到达祀细胞，将药物递送至中枢 神经系统（CN巧，尤其是大脑，是一项巨大挑战。
[0004] 血脑屏障由毛细血管的内皮形成。该些内皮细胞通过所谓"紧密连接"相互紧紧 连接在一起，从而防止特定分子量W上的物质进入中枢神经系统。血脑屏障因此提供有效 的保护屏障。血脑屏障一方面保证向中枢神经系统供给营养，另一方面能够从中枢神经系 统清除新陈代谢产物。
[0005] 转运亲水物质通过血脑屏障是主要的关注点。接近95%的所有体外有效的药物候 选物不能W药理活性浓度通过血脑屏障。因此，为了在中枢神经系统内达到药物的足够药 理浓度，许多中枢神经系统疾病如脑肿瘤或中枢神经系统感染的治疗，要求药物的高血浆 浓度。该包括了不良副作用的风险。因此在药物学研究中寻找提高转运药物（尤其是亲水 物质）通过血脑屏障进入中枢神经系统的方式。
[0006] 一些方法使用亲脂颗粒，其允许受体介导转运通过血脑屏障。出于该样的目的，例 女口，特别已经开发了纳米颗粒转运系统。纳米颗粒通常由聚合物组成，大小为10-1000纳 米。通常，它们是表面修饰的。
[0007] 该些纳米颗粒经常面临该样的问题，它们被血脑屏障中表达的外排粟排出中枢神 经系统。并且，纳米颗粒被证明其影响血脑屏障的完整性化empe等，Biochem Bioph Res Comm 2011,406(1) ;64-69)。于是，血脑屏障的防御功能被置于危险中，包括不希望的物质 体或感染性物质体进入中枢神经系统引起副作用的危险。该显著的缺点对于纳米颗粒作为 药物递送系统的临床应用是关键的。
[0008] 其它可能的药物传递系统在讨论中。例如，已知与编码目-半乳糖巧酶的DNA相结 合的、来自小鼠多瘤病毒VP1蛋白的假衣壳能够用于在静脉施用后递送该DNA到大脑，导致 在大脑内表达目-半乳糖巧酶（Krauzewicz等，Gene "Therapy 2000, 7,1094-1102;也可W 参见WO 98/48841 A1)。但是，该些发现没有提供对病毒样颗粒的适合性的充分观察，尤其 是对来自人多瘤病毒并装载负荷物、作为药物递送系统用于中枢神经系统的病毒样颗粒。
[0009] 因此，本发明的目的是提供允许药物转运至中枢神经系统细胞的药物递送系统， 目P，通过血脑屏障的药物递送。
[0010] 发明概述
[0011] 发明人发现在基于原代猪内皮细胞的血脑屏障模型中，装载编码报告蛋白的核酸 的人JC病毒来源的病毒样颗粒能够通过血脑屏障，递送核酸到中枢神经系统细胞，在此核 酸被表达。该模型被认为代表体内生理完整的血脑屏障。因此，证明了病毒样颗粒，而不仅 仅是单独的活性物质，通过血脑屏障并进入中枢神经系统。因此，来自人多瘤病毒并装载有 负荷物的病毒样颗粒适于作为药物递送系统进入中枢神经系统，特别是进入大脑。
[0012] 发明人进一步发现载药的病毒样颗粒的通过不要求，也不会导致血脑屏障完整性 的丧失或增加的渗透性。因此，病毒样颗粒不实质影响血脑屏障的完整性。因此病毒样颗 粒能够用作进入中枢神经系统的药物递送系统，而不存在由于不希望的物质体或感染性物 质体进入中枢神经系统引起不良副作用的巨大危险。
[0013] 根据本发明，来自人多瘤病毒并装载负荷物的病毒样颗粒用于与负荷物一起通过 血脑屏障。重要地是，病毒样颗粒通过血脑屏障能够使病毒样颗粒展示其祀向大脑中特定 细胞群的功能，即，递送负荷物到祀细胞。在本发明的上下文中，所述递送包括递送到祀细 胞、递送到祀细胞内部，或递送进入祀细胞。因此根据本发明，功能性病毒样颗粒与负荷物 一起通过血脑屏障。
[0014] 负荷物，优选活性物质，优选完全封装在病毒样颗粒的衣壳中。但该不排除病毒样 颗粒可额外与活性物质结合，例如，通过将活性物质结合于衣壳的外部结构的方式。一些活 性物质分子甚至可W不完全地封装在衣壳内。但是，至少活性物质的一部分分子完全封装 在衣壳内。
[0015] 因此根据本发明，来自人多瘤病毒的病毒样颗粒和活性物质的组合物被提供用作 药物递送系统，其中活性物质（负荷物）总量的至少1 %，至少2%，至少3%，至少5%，至 少7 %，至少10 %，至少15 %，至少20 %，至少25 %，至少30 %，至少40 %，至少50 %，至少 60%，更优选至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%， 至少98%，至少99 %或100 %被封装在病毒样颗粒的衣壳内。
[0016] 在本发明最优选实施方式中，组合物的病毒样颗粒是非聚集的。非聚集意味着当 息浮于水中时，病毒样颗粒能够形成分散的颗粒。
[0017] 因此本发明的一个方面，提供了允许共转运病毒样颗粒和活性物质的用于中枢神 经系统的药物递送系统。转运可W是主动的或被动的。有趣的是，发明人进一步发现病毒 样颗粒不被或基本上不被血脑屏障的外排转运体清除出中枢神经系统。
[0018] 本发明的病毒样颗粒不需要表面处理或使用辅助剂，W有效通过血脑屏障和进入 中枢神经系统。因此，本发明的一个方面，药物递送系统具有微粒结构，不需要任何进一步 的表面处理或修饰，也不需要使用辅助剂。该药物系递送统优选是无细胞的。
[0019] 如上所述，根据本发明，病毒样颗粒用于进入中枢神经系统，特别是进入大脑的药 物递送。该进入大脑的递送使药物能够祀向特定细胞，例如，利用人多瘤病毒（特别是JC 病毒）的天然趋化性。
[0020] 发明详述
[0021] 衍化自人多瘤病毒，特别是JC病毒的病毒样颗粒（VLP)，根据本发明，用于优选含 有至少一种VPl的药物递送。VLP优选由装配成五聚体结构的VPl构建的衣壳组成。优选 地，VLP由几种VP1组成，特别是几种VP1五聚体，尤其是72 VP1五聚体。但是，VLP可选地 含有插入到衣壳的其它分子。装配成VLP的结构分子既可W与天然多瘤病毒蛋白相同，也 可W被修饰W优化VLP的特征。
[0022] 进一步地，根据本发明的VLP还含有装载负荷物。在本发明特别优选的实施方式 中，负荷物总量的大部分完全封装在衣壳内。为了描述负荷物分子被VLP完全封装，使用术 语"装载"。因此，"装载VLP"指有完全封装负荷物的VLP。
[0023] 所述装载负荷物可W是装在衣壳包围的空间内的任何分子或组合物。优选的，装 载负荷物是细胞毒素剂、可检测试剂如放射性核素、蛋白、肤或核酸，尤其是选自编码所需 蛋白的核酸如mRNA、cDNA、质粒或载体、抑制性核酸如siRNA或miRNA，和具有催化活性的 核酸如核酶组成的组。装载负荷物在下文中有时称为"活性物质"、"药物物质"或"活性成 分"，除非另有明确指出，该些术语作为同义词使用。
[0024] 通过提供在溶液中的希望的组分，尤其是VP1、任选的VP2、任选的VP3或它们的组 合和任选的装载负荷物并允许该些组分装配成VLP，来制备VLP。例如，在没有或只有有限 VLP装配发生的条件下混合该些组分，例如在低Ca"浓度和/或还原条件下，加入所有需要 的组分之后，条件转变为有助于VLP装配，例如高Ca2+浓度和/或氧化条件。但是，VLP的 产生也发生于体内。尤其是，VLP的组分可W共表达于宿主细胞，且VLP装配发生于宿主细 胞内或者在裂解或破坏宿主细胞时。
[00巧]术语"人多瘤病毒"指人多瘤病毒家族，包含JC病毒，服和SV40。在特别优选的 实施方式中，人多瘤病毒是JC病毒。
[0026] 根据本发明，"VP1"或"病毒蛋白1"指相同于或衍生自具有SEQ ID NO ;1所示氨 基酸序列的JC病毒的天然VP1的蛋白。衍生自JC病毒的天然VP1的蛋白，在至少100个 连续氨基酸、优选至少150、至少200、至少250或至少300个连续氨基酸的序列上，优选与 SEQ ID NO; 1所示的氨基酸序列具有至少60 %、更优选至少70 %、至少75 %、至少80 %、至 少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、或至少99 %的氨基酸序列同源性或同 一性。更优选的，氨基酸同源性或同一性可W在天然JC病毒-VP1的全长上计算。术语"衍 生自JC病毒的天然VP1的VP1"和"衍生自JC病毒的VP1"，特别地，也包括与JC病毒的天 然VP1同一的VP1。
[0027] 根据本发明，术语"VP1"也包含能装配成VLP的天然VP1的片段和衍生物。优选 的，所述VP1的片段和衍生物至少包含SEQ ID N0;1所示氨基酸序列的第32到316位氨基 酸，或其在至少100个连续氨基酸，优选至少150、至少200、至少250或至少300个连续氨 基酸的序列上，优选在全长序列上，与SEQ ID NO; 1的第32到316位氨基酸位点上的氨基 酸序列具有至少60%、更优选至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 95%、至少97%、至少98%、或至少99%的同源性或同一性的衍生物。
[002引根据本发明，VP1也可W包括异源的核定位信号（化巧。优选的，该化S被引入到 NP1的N-末端的前面或者内部，特别是VP1最开始的30个、最开始的25个、最开始的20个， 最开始的15个或最开始的10个氨基酸的内部。例如，W02009/036933(例如第10页，第4 到第 13 行和图 4A)或化ishido-Hara 等（Shishid0-Hara，Y.，Hara，Y.，Larson，T.，Yasui, K.，Nagashima，K. feStoner，G.L.Analysis of Capsid Formation of Human Polyomavirus JC(Tokyo-lStrain)by a Eukaryot ic Express ion System ：Splicing of Late RNAs， Trans lat ion and Nuclear Transport of Major Caps id Protein VPl， and Caps id Assembly. Journal of Virology 74,1840-1853 口000)中描述的化So
[0029] 根据一个实施方式，SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列被引入到VPl的N-末端部分 内，特别是沈Q ID NO: 1所示的第9个和第10个氨基酸么间。
[0030] 根据本发明，"VP2"或"病毒蛋白2"指的是相同于或衍生自具有沈Q ID N0:3所 示氨基酸序列的JC病毒的天然VP2的蛋白。衍生自JC病毒的天然VP2的蛋白，在至少100 个连续氨基酸、优选至少150、至少200、至少250或至少300个连续氨基酸的序列上，优选 与SEQ ID NO; 3所示的氨基酸序列具有至少60 %、更优选至少70 %、至少75 %、至少80 %、 至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、或至少99 %的氨基酸序列同源性或 同一性。更优选的，氨基酸同源性或同一性在天然JC病毒-VP2的全长上计算。术语"衍生 自JC病毒的天然VP2的VP2"和"衍生自JC病毒的VP2"，特别地，也包括与JC病毒的天然 VP2 同一的 VP2。
[0031] 根据本发明，术语"VP2"也包含能与VP1 -起装配成VLP的天然VP2的片段和衍 生物。优选的，所述VP2的片段至少包含SEQ ID NO ;3所示氨基酸序列的第214到318位 氨基酸，或其在至少100个连续氨基酸、优选至少150、至少200、至少250或至少300个连 续氨基酸的序列上，优选在全长序列上，与SEQ ID NO ;3的第214到318位氨基酸位点上的 氨基酸序列具有至少60%、更优选至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、 至少95%、至少97%、至少98%、或至少99%的同源性或同一性的衍生物。
[0032] 根据本发明，"肤"可W由任何数量的任何种类的氨基酸组成，优选天然生成的氨 基酸，其优选通过肤键连接。尤其是，肤含有至少3个氨基酸，优选至少5个，至少7个，至 少9个，至少12个或至少15个氨基酸。进一步地，没有关于肤长度的上限。但是，本发明 的肤优选不超过500个、优选300、250、200、150或120个氨基酸的长度。
[0033] 此处使用的"包含"的表达方式，除了其文字含义，还包括，特别指"基本组成"和 "组成"的语义。因此，"包含"的表达方式既指特定包含列出成分的主题不含有其它成分的 实施方式，也指特定包含列出成分的主题可W和/或实际含有其它成分的实施方式。同样 地，"具有"的表达方式应被理解为"包含"的语义，也包括，特别指"基本组成"和"组成"的 语义。
[0034] 施用方法
[00巧]本发明的VLP可W通过各种途径施用。特别优选的是允许活性物质全身效应的剂 型。最优选的是口服或胃肠外施用，尤其是静脉施用的剂型。
[0036] 制备方法
[0037] 制备病毒样颗粒
[0038] 另一方面，本发明提供了根据本发明制备病毒样颗粒的方法。该方法尤其包含W 下步骤：
[0039] (a)提供衍生自JC病毒的病毒蛋白VP1 ;
[0040] 化）可选地提供衍生自JC病毒的病毒蛋白VP2和/或VP3,优选VP2,并混合VP1 和 VP2 (和 / 或 VP3);
[0041] (C)允许VP1和任选的VP2 (和/或VP3)装配成病毒样颗粒。
[0042] 优选的，该方法还包含提供装载负荷物，W及将VPl和任选的VP2和/或VP3与装 载负荷物混合的步骤。优选的是VP1和VP2的混合。
[0043] VLP装配时，装载负荷物优选封装在VLP的内部。优选的，至少一个VLP携带装载 负荷物，更优选的，至少1 %、至少2%、至少3%、至少5%、至少7%、至少10%、至少15%、 至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至 少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、或至少99 %或100 %的装配的VLP携带装载负荷 物。
[0044] 病毒样颗粒的装配优选发生于溶液中，更优选在水溶液中。允许VLP装配优选包 括调整溶液中的Ca"离子浓度到VLP装配能够发生的水平。所述Ca 2+离子浓度尤其在0. ImM 至Ij 5mM的范围内，优选从0. 2mM到3mM,更优选从0. 5mM到2mM或0. 8mM到1. 2mM，最优选约 ImM。进一步地，允许VLP装配发生于氧化条件下，尤其是不存在明显浓度的还原剂如DTT、 DTE或琉基己醇的条件下。
[0045] 提供病毒蛋白和允许VLP装配可W同时进行。尤其是，在VLP装配能够发生的条 件下供应病毒蛋白。在优选的实施方式中，提供病毒蛋白和VLP装配在体内进行。尤其是， VLP在表达病毒蛋白的宿主细胞内部或裂解或破坏宿主细胞时被装配。
[0046] 例如，可W如EP 0 862 633描述的那样进行VLP的装配，EP 0 862 633公开的内 容W引用方式并入本文。
[0047] 递送方法
[0048] 本发明进一步提供了使用本发明的病毒样颗粒递送物质或组合物到中枢神经系 统内的祀细胞的方法。该方法优选包含W下步骤：
[0049] (a)提供本发明的病毒样颗粒，其包含物质或组合物作为装载负荷物；和
[0050] 化）将所述病毒样颗粒施用到活体内，优选到人体内。
[0051] 所述祀细胞可W是JC病毒的天然祀细胞。
[0052] 活性物质或组合物可W是任何种类或性质。在一个优选的实施方式中，活性物质 是核酸，尤其是编码蛋白或肤的核酸，或抑制性核酸如siRNA或miRNA。在另外一个优选的 实施方式中，活性物质是蛋白或肤。在本发明又另一个实施方式中，活性物质是小分子，尤 其是带负电荷的小分子。活性物质也可W是各种活性物质的混合物。
[0053] 活性物质优选是细胞毒素剂。
[0054] 进一步地，本发明一般性涉及VLP，其能够用作药物递送系统，用于神经性的、神经 元的或神经退化性疾病例如特别是多发性硬化、帕金森病或阿尔茨海默病的治疗和诊断。 [00巧]在优选的实施方式中，VLP被转运到少突胶质细胞内部，或转运至或转运进入少突 胶质细胞。 实施例
[0056] 1.体外血脑屏障炬BB)模型中的VP1-病毒样颗粒
[0057] 该体外实验在与人类血脑屏障的组织和性质匹配的模型系统中证明了 VLP穿过 血脑屏障的能力。在该模型系统中，使用能够在体外形成血脑屏障的猪原代脑血管内皮细 胞（PBCEC)(Angelow S，Zeni P 和 Galla 町 "Usefulness and limitation of primary cultured porine horoid plexus epithel cells as an in vitro model to study drug transport at the blood-CSF barrier", Adv Drug Del ivery 2004 ;56 (12) ; 1859-73)。
[0058] 按照 Rempe 等，BBRC, 2011 ;Transpo;rt of Pol}f-(n-but5d巧an〇-ac;rylate) nanoparticles across the blood-brain-barrier in vitro and their influence on barrier integrity中的描述进行PBCEC的制备和培养。
[0059] 借助于相对跨内皮电阻测量（T邸R)研究含有负载物的VLP在Transwell滤过系 统上的效果化empe等，2011)。为建立递送的定量证据，我们使用质粒DNA作为负载物。在 任何环境和浓度下，VP1-病毒样颗粒不影响血脑屏障的完整性。
[0060] 为了确证负载物在体外转运通过血脑屏障，按照Gol血ann等，1999G〇urnal of Virology ：Molecular cloning and express ion of major structural protein VPl of the human polyoma virus ：formation of virus like particles useful for immunological and therapeutic studies and measured quant itat ively by speci円c qPCR)所述，将质粒DM装载入VLP。定量体外模型的血脑屏障中顶侧和基底侧的质粒DM 的拷贝数。所述顶侧是VLP被加入的位置（体内血管腔内），所述基底侧指大脑。基底层质 粒DNA的定量证据分别代表VLP介导通行的分子穿过大脑内皮细胞，和负载物递送通过血 脑屏障。
[0061] 2.体内报告基因的递送和表达
[0062] 设计报告基因递送实验来证明JC VP1病毒样颗粒在活的生物体内递送物质进入 细胞和组织的能力。在该实验中，报告基因表达是不仅证明递送，也证明被递送物质的功能 的最好方法之一化〇ffman，R.M. ,2005 ;T肥 MULTIPLE USES OF 化U0RESCENT PROTEINS TO VISUALIZE CANCER IN VIVO.化t. Rev. Cancer ;5 (10) ;796-806)。
[006引材料
[0064] 不同的VPl-VLP探针用于检测在体外装载和递送报告质粒进入Cos 7 (绿猴肾细 胞）细胞的能力，原因是该细胞系已知能够被JCV VLP转导。有9个盐沉淀的VP1-VLP探 针和15个色谱法纯化的VP1-VLP探针。体外的转导实验重复5次。在该实验中，检测递送 用于体内实验的英光素底物的最大发光信号的能力。
[0065] 盐沉淀的 VP1-VLP 被沉淀过夜并针对 Standard Buffer (150mM 的 NaCl，lOmM 的 Tris-肥 1，pH7. 5)渗析 24 小时。按照 Gol血ann 等，1999，Journal of Virology : Molecular cloning and expression of major structural protein VPl of the human polyoma virus ：formation of virus like particles useful for immunological and therapeutic s化dies中所述，通过化学分离和再组合的方法完成报告基因质粒的装载。 [006引实验设计
[0067] 异氣離麻醉下，尾静脉内实施静脉注射VLP给具有免疫能力的BALB/c小鼠。
[0068] 动物被分组如下：
[0069] -5 y g盐沉淀的VLP (4只动物）
[0070] -50 y g盐沉淀的VLP (4只动物）
[0071] -5 y g色谱法纯化的VLP (4只动物）
[007引 -DNA对照（仅报告基因质粒）（3只动物）
[0073] -VLP对照（仅VP1-VLP衣壳）（3只动物）
[0074] 在第2天、4天、7天、14和22天，腹膜内注射英光素底物12分钟后检测生物 发光。每组的结果合并计算平均值和标准差。W化Im-Sidak-Test作为事后检定，通过 Two-Way-ANOVA分析平均值。
[0075] 结果显示在图3和图4中。
[0076] 3.借助装载英光素酶质粒的JC VP1-VLP，和与英光素酶质粒混合的JCVP1-VLP， Cos7细胞（非洲绿猴肾细胞）的转导效率
[0077] 1.转导前18小时，将Cos7细胞放进24孔板。
[0078] 2. VP1-VLP与DTT和EGTA分离，与英光素酶质粒混合，并于再结合缓冲液中4°C渗 析过夜。
[0079] 3.第二天，装载后的VP1-VLP从渗析中取出。
[0080] 4.根据 Krauzewicz (Gene "Therapy (2000) 7,1094-1102)制备与英光素酶质粒混 合的 VP1-VLP。
[0081] a.VLP与英光素酶质粒的混合比例为30 : l(w/w)。
[0082] b.室温赔育混合物15分钟，
[0083] C.用DMEM细胞培养基稀释混合物，移液到24孔板中的Cos7细胞。
[0084] 5.将装载了英光素酶质粒的VP1-VLP移液到Cos 7细胞。对于与英光素酶质粒混 合的VP1-VLP执行同样操作。
[0085] 6. 72小时后，裂解细胞，借助Promega的Luciferase Assay，H个一组检测英光素 酶活性。
[0086] 独立转导实验的结果显示在图5。
[0087] 4.静脉内施用装载英光素酶质粒的VLP后，免疫组化检测小鼠大脑中的英光素酶 和VP1蛋白
[0088] 如上所述，通过质粒DNA(通过定量PCR)或英光素酶活性的检测证明，JC VP1-VLP 能够在活的生物体内将物质递送入细胞和组织。脑内英光素酶蛋白和VP1蛋白的免疫组化 检测进一步支持该些实验结果。
[0089] 从静脉注射VLP的具有免疫能力的BALB/c小鼠（如上所述地处理）分离脑组织， 在 PFA 中固定并石蜡包埋，如 J. Jankowski 等，The Journal of comparative Neurology 472 ：87-99,2004："Engrailed-2 negat ively regulates the onset if prenatal Purkinje Cell differentiation"中所述。制备7到10微米的薄切片，并固定于Histobond plus载玻片上。切片再水化，灭活内源过氧化物酶，使切片具有渗透性。封闭步骤在3%的 牛血清白蛋白溶液中进行。英光素酶蛋白或VP1蛋白，分别用单克隆抗体检测。为增加信 号强度，使用 TSA 英光增强系统（TSA? Plus Fluorescein System,化rkin Elmer)。
[0090] 结果；如图6B的右图所示，使用抗-VPl抗体的免疫组化分析能够检测中枢神经系 统细胞内的VP1蛋白。脑切片显示不规则大小的散在斑点，其指示VP1在脑实质内的细胞定 位。使用抗-英光素酶抗体，英光素酶蛋白也能够在中枢神经系统的细胞内被检测。根据 VP1蛋白的结果，脑切片的英光素酶来源的染色也显示不规则大小的散在斑点，其指示英光 素酶在脑实质内的细胞定位。
[0091] 讨论；英光素酶和VP1蛋白在脑内细胞的呈现代表了对本发明基本概念的进一步 支持，因为其表明VLP，并不仅仅是单独的活性物质，通过了血脑屏障并进入中枢神经系统。
[0092] 5.共区域化分析显示了 VP1蛋白在少突胶质细胞中的存在
[0093] 基于上述VPl蛋白在中枢神经系统内的细胞检测，进行共区域化实验W识别各祀 细胞。为此目的，被检测的VP1蛋白与特异地定位于少突胶质细胞的标志物olig 2共定位 炬.Menn 等，"Origin of oligodentrocytes in the subventricular zone of the adult brain", Hie Journal of Neuroscience,2006,26(30) ;7907-7918)〇
[0094] 结果；如图8的左下图所示，通过使用01 ig2标志物，几个不规则斑点能够在脑切 片中被检测到，其在每个实例中也能够被核染DAPI染色（图8的左上图），因此指示少突胶 质细胞。如图8的右下图所示，每个所述少突胶质细胞也是VP1蛋白阳性的。01ig2和VP1 阳性的细胞使用白色箭头标记。因此，VP1蛋白定位于中枢神经系统的少突胶质细胞，其指 示该些细胞被静脉内施用的VLP感染。
[0095] 讨论；VP1蛋白在脑的少突胶质细胞内被检测到与JCV病毒的天然趋向性是一致 的。作为结果，本发明要求保护的VLP尤其适合治疗与少突胶质细胞相关的疾病例如多发 性硬化。

【专利附图】

【附图说明】
[009引图1 ;A，B- W每孔5*108到2*1012个颗粒的浓度加入VP1-VLP之后，相对跨内皮电 阻的变化情况（A和B) (n = 3)。
[0097] 图2 ;体外模型中，W使用特异性引物的定量PCR测量装载DNA的VP1-VLP通过血 脑屏障。加入的VLP-加入到血脑屏障模型的顶侧的VLP的数量，检测到的VLP-在血脑屏 障模型的顶侧和基底侧检测到的质粒数量（n = 3)。
[0098] 图3 ;静脉施用后小鼠身体的生物发光信号；5 y g盐沉淀的VLP ;50 y g盐沉淀的 VLP ;5 y g色谱法纯化的VLP ;DNA对照（仅报告基因质粒）；VLP对照（仅VP1-VLP衣壳）。 例如，每组的1只小鼠的腹侧和背侧情况。
[0099] 图4 ;静脉施用后小鼠头部的生物发光信号；5 y g盐沉淀的VLP ;50 y g盐沉淀的 VLP ;5 y g色谱法纯化的VLP ;DNA对照（仅报告基因质粒）。每组的平均值减去VLP对照 (作为背景信号）。
[0100] 图5 ;A，B ;使用负载了英光素酶质粒DNA的VP1-VLP转导Cos7细胞。RLU-相对光 单位；25 y g装载的VLP-装载英光素酶质粒的25 y g的JC VP1-VLP ;50 y g装载的VLP-装 载英光素酶质粒的50 y g的JC VP1-VLP ;50 y g VLP混合物-与英光素酶质粒混合的50 y g 的JC VPl-VLP ;DNA对照-英光素酶质粒对照。
[010。 图6 ;脑切片的免疫组化分析。左栏显示细胞核的DAPI染色，右栏英光标记蛋白： A-阴性对照；B - VP1蛋白的FITC英光染色；C-英光素酶蛋白的FITC英光染色。
[0102] 图7 ;VP1蛋白与少突胶质细胞标志物01ig2的共定位的阴性对照。左上图显示使 用染料DAPI进行的细胞核染色。右上图显示不使用抗VP1抗体的英光检测后的信号。左 下图显示不使用抗01ig2抗体的英光检测后的信号。右下图代表两个对照染色的融合图。
[0103] 图8 ;VP1蛋白与少突胶质细胞标志物01 ig2的共定位。左上图显示用染料DAPI 的细胞核染色。右上图显示VP1蛋白的定位（門TC-英光）。左下图显示用抗-01ig2抗体 染色（TRITC-英光）。右下图代表01ig2-标志物和VP1蛋白染色的融合图。
【权利要求】
1. 负载了药物的、衍化自人多瘤病毒的病毒样颗粒VLP，其在治疗或诊断过程中用作 药物递送系统用于将所述药物转运进入中枢神经系统，尤其是活人的中枢神经系统。
2. 根据权利要求1的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒衍化自JC病毒。
3. 根据权利要求1或2的病毒样颗粒，其中药物递送系统与病毒样颗粒封装的药物一 起通过血脑屏障进入中枢神经系统。
4. 根据至少一项前述权利要求的病毒样颗粒，其特征在于药物递送系统通过生理上完 整的血脑屏障。
5. 根据至少一项前述权利要求的病毒样颗粒，其特征在于所述病毒样颗粒由JC病毒 的VP1蛋白组成。
6. 根据至少一项前述权利要求的病毒样颗粒，其特征在于所述病毒样颗粒被制备用于 静脉施用。
7. 根据至少一项前述权利要求的病毒样颗粒，其特征在于VP1包含其全长与SEQ ID NO : 1所示的氨基酸序列至少80 %-致的氨基酸序列，和/或其中VP2包含其全长与SEQ ID NO : 3所示的氨基酸序列至少80 %-致的氨基酸序列。
8. 根据至少一项前述权利要求的病毒样颗粒，其特征在于所述药物选自由细胞毒素 齐U、可检测试剂如放射性核素、蛋白、肽和核酸组成的组，尤其选自由编码所需蛋白的核酸 如mRNA、cDNA，质粒或载体；抑制性核酸如siRNA或miRNA ;和具有催化活性的核酸如核酶 组成的组。
9. 含有任一项前述权利要求的病毒样颗粒的药物组合物，其中药物物质（负荷物）总 量的至少1 %、优选至少15%、更优选至少50%、特别优选至少95%被完全封装到VLP的衣 壳中。
10. 根据权利要求9所述的药物组合物，其中病毒样颗粒是非聚集的。
【文档编号】C12N15/86GK104395475SQ201380013112
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2013年3月6日 优先权日:2012年3月6日
【发明者】V·德米纳, H·梅宁格, A·格茨戈, A·格拉斯曼 申请人:生命科学孵化运作有限责任两合公司