新型合成-调控sRNA及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种降低原核生物中基因表达的新型的定制合成sRNA，其制备方法及其应用，尤其涉及一种合成sRNA，其包括源自MicC、SgrS和MicF中任何一种的sRNA的Hfq结合位点和与靶基因mRNA成碱基对的区域，还涉及该合成sRNA的制备方法及其应用。本发明的合成sRNA的优点在于，可通过调控合成sRNA与靶基因mRNA的结合能力来控制靶基因的抑制程度。利用调控靶基因表达的合成sRNA，能够无需传统的基因缺失方法而有效构建重组微生物并能够降低靶基因的表达，因而合成sRNA对重组微生物的生产很有用。此外，合成sRNA可快速应用至各种菌株，因而非常适合测定菌株的代谢能力以及选择最适菌株。此外，通过利用合成sRNA操控代谢通量得到的并高效生产酪氨酸或尸胺的重组微生物在医药和工业领域非常有用。换句话说，利用本发明的sRNA可使选择表达将被抑制以用于高效生产代谢产物的靶基因变得容易。因此，合成sRNA可用于构建有效生产各种代谢产物的重组菌株以及用于建立生产各种代谢产物的有效方法，因而非常有用。
【专利说明】新型合成-调控sRNA及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种降低原核生物中基因表达的新型的定制sRNA，其制备方法及其应 用，尤其涉及一种合成的sRNA及其制备方法与应用，所述合成的sRNA包括源自MicC、SgrS 和MicF中的任何一种的sRNA的Hfq结合位点以及与靶基因 mRNA碱基配对的区域。
【背景技术】
[0002] 近年来，全球对于环境问题和有限资源损耗的关注日益增加。作为解决此类问题 的可选方法，基于环境友好型和可再生的有机体生产体系的构建日益引起人们的兴趣。可 通过调控有机体的代谢途径，优化所需代谢产物的代谢通量来构建这些体系，并且在该调 控代谢途径的过程中需要多种分子生物学技术。
[0003] 调控代谢途径的方法包括增加生物合成过程所需的酶的表达以提高代谢通量 的方法，以及阻止用于细胞生长和生产其它代谢产物的代谢通量以及缺失基因以生产 所需代谢产物的方法。目前广泛应用的基因缺失方法是这样一种方法，其中利用重组 酶将待删除的基因置换为任何与其同源的序列，从而导致基因功能丧失（Datsenko et al，PNAS，97 (12) : 6640-6645, 2000)。然而，这种基因缺失方法存在以下问题。
[0004] 首先，基因缺失所需时间相对较长。考虑到用同源序列置换染色体基因所需的时 间以及从染色体中移除抗生素抗性基因（用于筛选其中正常移除了基因缺失的细胞）所需 的时间，通常需要一周或更长的时间来移除一个基因。与近年来快速发展的分子生物学技 术相比，这种长的基因缺失时间与关注于通过调控代谢途径来高效生产代谢产物的代谢工 程的发展相冲突。
[0005] 其次，基因缺失导致基因功能的完全丧失。这表明基因的表达水平不能被调控至 所需水平。为了在细胞内代谢途径中有效生产所需代谢产物，尝试基因缺失来阻断进入代 谢途径的代谢通量。然而，如果受阻的代谢通量产生细胞生长所必需的物质，则基因缺失的 细胞的生长将会被显著抑制或不会发生。为了使所需代谢物的生产效率最大化，生产所需 代谢产物的细胞应该很容易生长，同时所需代谢物的代谢通量也应被最优化。因此，需要一 种能够通过调控基因表达水平来生产所需物质同时维持细胞生长的方法，而不是简单地为 了调节代谢通量而删除基因。
[0006] 第三，通过传统的基因缺失方法从染色体删除的基因难以修复。此外，如果尝试删 除其它菌株中的相同基因，则所有的过程都需要重新尝试，因此需要大量的时间和精力。
[0007] 因此，为了克服传统基因缺失方法的局限性，应该可以无需改变菌株的染色体序 列而降低目的基因的表达水平。此外，应该可以调控基因的表达水平并很容易地将对相同 基因的表达调控应用于其它菌株。进一步，需要以快速便捷的方式构建并应用基因调控体 系。
[0008] 因此，本发明人尝试利用满足上述要求的方法来构建短的定制合成的sRNA。
[0009] 目前已知总共有 101 种大肠杆菌 sRNA (Pichon et al.，Nucleic Acids Research, DOI: 10. 1093/nar/gkrll41，2011)，其机制目前正在研究中。目前已报道，大量 sRNA即使具有不同的序列也会形成特定的二级结构，Hfq蛋白识别并结合到这些sRNA。Hfq 的功能是增加 sRNA的半衰期，这样即使仅有少量sRNA也能有效地起作用，并且Hfq协助 sRNA结合到靶mRNA，以使靶mRNA能迅速起作用，并使RNase结合到靶mRNA，以促进靶mRNA 的降解，从而更有效地降低基因的表达。
[0010] -直在不断研究大肠杆菌sRNA的基本功能，但是关于利用上述机制来构建合 成sRNA的报道很少或没有。根据最近有关构建大肠杆菌sRNA的报道，已经通过随机 诱变和筛选构建了有效的 sRNA(Sharma et al, ACS Synthetic Biology，D0I:10. 1021/ sb200001q, 2011)〇
[0011] 因此，为了克服传统基因缺失方法的局限性，本发明人已经做了大量努力来构建 一种新型的、短的定制合成sRNA,结果构建了一种合成sRNA,其包括源自MicC、SgrS和/ 或 MicF 的 Hfq 结合位点以及与诸如 DsRed2mRNA、AraC mRNA、KanR mRNA 或 LuxR mRNA 的 靶mRNA同源的区域，并发现对靶mRNA表达的测试结果显示，可不依赖传统的随机方法而构 建有效的sRNA。此外，本发明人构建了一种抑制tyrR(酪氨酸调控因子）、csrA(碳储存调 控因子）、pgi (葡萄糖-6-磷酸异构酶）、ppc (磷酸烯醇丙酮酸羧化酶）等的表达的合成 sRNA，并发现这些合成sRNA显示的效果类似于实际的基因缺失的效果，这些合成sRNA可用 于调控所需代谢产物的生产，从而完成了本发明。
[0012]
【背景技术】部分中描述的信息仅仅是为了加强对本发明背景的理解，可能并不含有 形成了本发明所属【技术领域】的普通技术人员已知的现有技术的信息。
【发明内容】
[0013] 本发明的一个目的是提供一种新型的、短的定制合成SRNA，其制备方法及其应用， 所述合成sRNA克服了传统的基因缺失方法的局限性，并且可用于高效调控各种靶基因的 mRNA表达。
[0014] 为了实现上述目的，本发明提供一种用于抑制原核生物中基因表达的sRNA(小分 子调控RNA)，所述sRNA包括：源自MicC、SgrS和MicF中的任何一个的sRNA的Hfq结合位 点以及与靶基因 mRNA成碱基配对的区域。
[0015] 本发明还提供一种编码sRNA的分离的核酸。
[0016] 本发明还提供一种包括编码sRNA的分离的核酸的表达载体。
[0017] 本发明还提供一种导入了 sRNA的重组微生物。
[0018] 本发明还提供一种用所述表达载体转化的重组微生物。
[0019] 本发明还提供一种制备sRNA的方法，所述方法包括将编码与靶基因 mRNA成碱基 配对的区域的核酸连接到编码源自MicC、SgrS和MicF中的任何一种的sRNA的Hfq结合位 点的核酸。
[0020] 本发明还提供一种抑制靶基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：在原核生物 中导入或表达sRNA ;以及抑制靶基因的mRNA的表达。
[0021] 本发明还提供一种用于抑制原核生物中基因表达的组合物，所述组合物包括 sRNA。
[0022] 本发明还提供一种用于筛选需要被缺失的基因以生产有用物质的方法，所述方法 包括以下步骤：
[0023] (a)对存在于用于生产有用物质的菌株并参与有用物质的生物合成途径的基因中 的至少一种基因，利用靶向所述基因的sRNA，抑制基因表达；以及
[0024] (b)如果有用物质的产量通过抑制基因的表达而增加，则选择表达被抑制的基因 作为需要删除的基因，以生产有用物质。
[0025] 本发明还提供一种改良用于生产有用物质的菌株的方法，所述方法包括以下步 骤：
[0026] (a)对存在于用于生产有用物质的菌株并参与有用物质的生物合成途径的基因中 的至少一种基因，利用靶向所述基因的sRNA，抑制基因表达；
[0027] (b)如果有用物质的产量通过抑制基因的表达而增加，则选择表达被抑制的基因 作为需要删除的基因，以生产有用物质；以及
[0028] (c)构建缺失了选定基因或选定基因的组合的重组菌株。
[0029] 本发明还提供一种具有增强的生产酪氨酸能力的重组微生物，所述重组微生物是 通过使具有酪氨酸生物合成途径的宿主细胞中的tyrR和csrA基因的功能失活而获得的。
[0030] 本发明还提供一种能够生产苯酚/酚类的重组微生物，所述重组微生物是通过在 上述重组微生物中导入或扩增tpl基因而获得的。
[0031] 本发明还提供一种生产具有增强的生产酪氨酸的能力的重组微生物的方法，所述 方法包括使具有酪氨酸生物合成途径的宿主细胞中的tyrR和csrA基因的功能失活。
[0032] 本发明还提供一种具有增强的生产尸胺能力的重组微生物，所述重组微生物是 通过使具有尸胺生物合成途径的宿主细胞中的选自以下基因中的至少一种基因的功能失 活而获得的：murE(UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酰-2, 6-二氨基庚二酸连接酶）、 metB (胱硫醚γ -合酶）、thrL(thr操纵子前导肽）、ackA (丙酸激酶/乙酸激酶活性）、 pdhR(丙酮酸脱氢酶复合物调控因子）、ilvG_l (乙酰乳酸合酶II、大亚基、N-ter片段 (假基因））、carB (氨甲酰磷酸合成酶）、serC(磷酸羟基苏氨酸转氨酶/3-磷酸丝氨酸 转氨酶）、ilvN(乙酰羟基丁酸乙酯合成酶/乙酰乳酸合成酶）、Crp (CRP转录双向调控因 子）、ilvD(二羟酸脱水酶）、ilvY(IlvY DNA-结合转录双向调控因子）、glpK(甘油激酶）、 glpF (甘油MIP通道）、pta (磷酸乙酰转移酶）、tktA (转酮醇酶I)、hflD(溶原化调控因 子）、deoA(胸苷磷酸化酶/尿啼陡磷酸化酶）、gadE(GadE控制参与谷氨酸依赖体系的基 因转录）、rbsK(核糖激酶）、ilvL(ilvGEDA操纵子前导肽）、ilvC(乙酰轻酸还原异构酶）、 accA(乙酰辅酶A羧基转移酶，α -亚基）、ilvM(乙酰羟基丁酸酯合酶/乙酰乳酸合酶）、 argB (乙酰谷氨酸激酶）、thrA (天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶）、carA (氨甲酰磷酸合 酶）、fbp (果糖-1，6-二磷酸酶）、rbsD (核糖批喃酶）、panD (天冬氨酸脱氢酶）、aspA (天 冬氨酸脱氨酶）、rcsB(RCSB-BglJ DNA结合转录激活因子）、ivbL(ilvB操纵子前导肽）、 leXA(LeXA抑制参与细胞DNA损伤应答的几种基因的转录）、rbsA(核糖ABC转运蛋白）、 murF (D-丙氨酰-D-丙氨酸加合酶）和thrC (苏氨酸合酶）。
[0033] 本发明还提供一种生产具有增强的生产尸胺能力的重组微生物的方法，所述方法 包括使具有尸胺生物合成途径的宿主细胞中的选自以下基因中的至少一种基因的功能失 活：murE (UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酰-2, 6-二氨基庚二酸连接酶）、metB (胱硫 醚Y -合酶）、thrL(thr操纵子前导肽）、ackA (丙酸激酶/乙酸激酶活性）、pdhR(丙酮 酸脱氢酶复合物调控因子）、ilvG_l (乙酰乳酸合酶II、大亚基、N-ter片段（假基因））、 carB(氨甲酰磷酸合成酶）、serC(磷酸羟基苏氨酸转氨酶/3-磷酸丝氨酸转氨酶）、 ilvN(乙酰羟基丁酸乙酯合成酶/乙酰乳酸合成酶）、Crp(CRP转录双调控因子）、ilvD (二 羟酸脱水酶）、ilvY(IlvY DNA-结合转录双调控因子）、glpK(甘油激酶）、glpF(甘油MIP 通道）、pta (磷酸乙酰转移酶）、tktA (转酮醇酶I)、hf 1D (溶原化调控因子）、deoA (胸苷 磷酸化酶/尿啼陡磷酸化酶）、gadE (GadE控制参与谷氨酸依赖体系的基因转录）、rbsK (核 糖激酶）、ilvL(ilvGEDA操纵子前导肽）、ilvC(乙酰羟酸还原异构酶）、accA(乙酰辅酶 A羧基转移酶，α-亚基）、ilvM(乙酰羟基丁酸酯合酶/乙酰乳酸合酶）、argB(乙酰谷 氨酸激酶）、thrA(天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶）、carA (氨甲酰磷酸合酶）、fbp (果 糖-1，6-二磷酸酶）、rbsD (核糖批喃酶）、panD (天冬氨酸脱氢酶）、aspA (天冬氨酸脱氨 酶）、rcsB(RcsB-BglJ DNA结合转录激活因子）、ivbL(ilvB操纵子前导肽）、lexA(LexA抑 制参与细胞DNA损伤应答的几种基因的转录）、rbsA(核糖ABC转运蛋白）、murF(D-丙氨 酰-D-丙氨酸加合酶）和thrC (苏氨酸合酶）。
[0034] 从下面的详细描述和所附的权利要求中，本发明的其他特征和实施方式将是显而 易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0035] 图1示出了筛选针对合成sRNA的有效功能的基本结构的过程。
[0036] 图2示出了 SgrS、MicF和MicF的序列、报告子DsRed2mRNA的序列及其与RBS结 合的互补序列。
[0037] 图3是示出在組(^、]\^〇?或586与〇81^(121?5互补结合之后，对〇81^(12的表达 抑制图表。
[0038] 图4示出了与DsRed2结合的多种互补序列。
[0039] 图5是示出在MicC的Hfq结合位点与结合到DsRed2的多种互补序列结合之后， 对DsRed2的抑制程度的图表。
[0040] 图6示出了 AraC、LuxR和KanR mRNA序列以及与连接到合成sRNA以与其结合的 RBS互补的序列。
[0041] 图7是示出AraC、LuxR或KanR与抑制AraC、LuxR或KanR的合成sRNA之间的交 叉反应性的图表。
[0042] 图8示出了利用mfold软件计算AraC、LuxR或KanR与构建成与AraC、LuxR或 KanR结合的合成sRNA之间的结合能的结果。
[0043] 图9示出了在微生物中的酪氨酸生物合成途径。在图9中，绿色方框表示过表达 的基因，红色方框表示通过合成sRNA沉默的基因，以及Θ表示除去反馈抑制。
[0044] 图10是构建用于酪氨酸生产的质粒的示意图。
[0045] 图11是示出通过扩增用于酪氨酸生产的与酪氨酸生物合成途径相关的基因的表 达，用合成sRNA抑制tyrR、ppc、csrA和pgi的表达，然后比较在各种大肠 杆菌菌株中酪 氨酸的产量而获得的结果图表（pgi还包括表达被调控的额外的合成sRNA(抗-pgi-Dl、 抗-pgi-D2))。
[0046] 图12示出了 S17-1和T0P10菌株根据抗-pgi、抗-pgi-Dl和抗-pgi-D2合成sRNA 的生长曲线。
[0047] 图13示出了抗-pgi、抗-pgi-Dl和抗-pgi_D2结合序列。
[0048] 图 14 是示出通过抗-tyrR、抗-csrA、抗-ppc、抗-pgi、抗-pgi-Dl 和抗-pgi_D2 对S17-1和T0P10中靶基因的表达抑制的图表。
[0049] 图15是示出S17-1 (pTyr-a (抗-csrA)、pTyr_b (抗-tyrR))重组微生物的发酵结 果的图表。
[0050] 图16是示出在各种大肠杆菌菌株中产生的苯酚的浓度的图表。
[0051] 图17示出了在大肠杆菌中的尸胺生物合成途径。红色方框表示通过合成sRNA沉 默的靶基因。
[0052] 图18是示出待转化以增加尸胺产量的质粒的示意图。
[0053] 图19是示出在导入了合成sRNA之后尸胺的产量变化的图表（对照在XQ56菌株 中包含pl5CadA质粒但不包含合成sRNA。对照中尸胺的浓度为1. 3g/L)。
[0054] 图20是pWA载体的示意图。
[0055] 图21是pR15CA载体的示意图。
[0056] 图22示出了合成sRNA的作用原理。
[0057] 图23示出了通过制备具有不同结合能的抑制DsRed2和LacZ基因表达的合成 sRNA，并检测使用合成sRNA是否将基因的表达调控至不同水平而获得的实验结果。
[0058] 图24示出了检测合成sRNA的导入是否抑制了微生物中的蛋白质表达和细胞生长 的实验结果。
[0059] 图25示出了利用具有不同结合能的抗-csrA的酪氨酸产量的检测结果。
[0060] 图26示出了在导入了抑制参与细胞主要代谢途径的基因的合成sRNA之后，酪氨 酸产量的测量结果。
[0061] 图27示出了大肠杆菌中的尸胺生物合成途径以及被合成sRNA抑制时所生产的尸 胺的浓度。
[0062] 图28示出了具有不同结合能的抗-murE合成sRNA对尸胺产量的影响的测量结 果。
[0063] 图29示出了检测不同抗-murE合成sRNA是否影响MurE蛋白质的实际产量的实 验结果。
[0064] 图30示出了含抗-murE的终菌株的发酵结果。
[0065] 用于实施本发明的最佳实施方式
[0066] 除非另有规定，否则本文使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属技 术领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。通常，本文使用的术语是本领域众所周知 并普遍使用的。
[0067] 以下是在本发明的具体描述中使用的主要术语的定义。
[0068] 如在此使用的，术语"sRNA(小分子RNA) "是指短的RNA，通常长度为200个或更少 个核苷酸，不翻译成蛋白质且通过互补结合有效抑制特定mRNA的翻译。
[0069] 如在此使用的，术语"核糖体结合位点（RBS) "是指核糖体与mRNA结合以转录mRNA 的位点。
[0070] 如在此使用的，术语"基因"意在具有最广泛的含义，基因可编码结构蛋白或调控 蛋白。在这里，调控蛋白包括转录因子、热休克蛋白或参与DNA/RNA复制、转录和/或翻译 的蛋白。此外，表达将被抑制的靶基因可呈现为染色体外元件。
[0071] 一方面，本发明涉及一种新型的、短的合成调控SRNA。就是说，本发明涉及一种用 于抑制原核生物中的基因表达的sRNA (小分子调控RNA)，所述sRNA包括：源自MicC、SgrS 和MieF中的任何一种的sRNA的Hfq结合位点；以及与靶基因 mRNA成碱基配对的区域。
[0072] 在本发明中，选择保证合成sRNA的稳定功能的结构，然后选择更有效抑制靶mRNA 表达的结合位点。此外，检测是否可以制备用于抑制除DsRed2mRNA之外的其它靶mRNA的 合成sRNA。进一步，进行交叉反应试验，以检测所构建的sRNA能否抑制除靶mRNA之外的其 它mRNA的表达。因此，开发了一种根据本发明的新型的合成sRNA结构及其制备方法。
[0073] 首先，考虑到合成sRNA的稳定功能并有效抑制靶基因的表达，建立与Hfq结合的 结构序列，从存在于大肠杆菌中的101个sRNA中选择一组符合要求的sRNA结构候选物，进 行连续筛选操作，从而最终选择三种sRNA (图1)。
[0074] 选定的三种sRNA为MicC、SgrS和MieF。MicC与帮助离子或亲水性物质通过大肠 杆菌细胞膜的QmpC的mRNA结合。SgrS与存在于细胞膜中且用来转移葡萄糖的PtsG蛋白的 mRNA结合，并且MieF与膜蛋白QmpF的mRNA结合并抑制膜蛋白QmpF的mRNA的表达，氨基酸、 离子、糖等穿过膜蛋白QmpF，且膜蛋白QmpF具有600Da或更小的分子量（Wadler et al，PNAS ,104(51):20254-20459, 2007 ；Chen et al, J. Bacteriology, 186(20) :6689, 2004) 〇
[0075] 在本发明的一个实施例中，除去所述三种sRNA与靶mRNA结合的位点，并将sRNA 构建成与DsRed2mRNA的RBS结合，以便测定sRNA抑制表达的能力（图2)。在图2中，将 各候选sRNA的靶mRNA结合序列用下划线画出并用红色表示，并将其置换为由抗-DsRed2 表示的序列。如在此使用的，术语"DsRed2的RBS"是指被核糖体生理上覆盖的实际结合位 点，该位点结合到mRNA，使得其他蛋白质无法识别该位点。RBS被定义为在3'端方向上从 Shine-Dalgarno序列起点开始的36bp的区域。这可利用先前的研究报道的结果预测出（Na et al·，BMC Systems Biology, 4⑴：71,2010)。当利用 SgrS 的 Hfq 结合位点时，所构建的 合成sRNA对DsRed2的表达抑制86%，当利用MieF的Hfq结合位点时，所构建的合成sRNA 对DsRed2的表达抑制85%，当利用MicC的Hfq结合位点时，所构建的合成sRNA对DsRed2 的表达抑制90% (图3)。因此，在本发明中，优选利用MicC的Hfq结合位点。
[0076] 在本发明的另一个实施例中，通过实验检测位于靶基因的mRNA序列的RBS周围 的各个序列是否适合作为结合位点。具体地，从与靶mRNA的RBS结合的合成sRNA，构建与 RBS、RBS的一部分或与除RBS之外的区域结合的合成sRNA，这些结合位点具有19至37个核 苷酸的不同长度（图4)。结果表明，与RBS的至少一部分结合的合成sRNA显示出至少90% 的抑制效果，而未与RBS结合的合成sRNA也具有47-90 %的抑制效果（图5)。换句话说， 与RBS的至少一部分结合的sRNA显示出优异的表达抑制效果。因此，在本发明中，与靶基 因 mRNA成碱基配对的区域可与靶基因 mRNA的所有RBS或部分RBS成碱基配对。如在此使 用的，表述"与一部分成碱基配对"是指以-30kcal/mol或更高的结合能与靶基因 mRNA(约 20个核苷酸或更多）的RBS成碱基配对，也指与靶基因 mRNA的一部分RBS或位于RBS周 围的区域成碱基配对，如图4所示。在这里，与RBS成碱基配对的区域包括一个或多个核苷 酸，优选为9个或更多个核苷酸。在本发明中，当合成sRNA与除RBS之外的其他区域结合 时，其效果会相对较低，但该合成sRNA也可用于调控表达水平。同时，即使与靶基因 mRNA 成碱基配对的区域具有19-37个核苷酸的不同长度时，根据本发明的sRNA也显示出表达抑 制效果。因此，与靶基因 mRNA成碱基配对的区域可具有能够与靶基因成碱基配对的最小尺 寸。例如，所述区域可具有20-50个核苷酸的长度，优选为19-37个核苷酸。
[0077] 在本发明的另一个实施例中，发现当通过从与靶基因的mRNA成碱基配对的区域 缺失一个或两个核苷酸而形成不与靶基因的mRNA结合的位点时，可调控对表达的抑制程 度。因此，在本发明中，可通过在与靶基因的mRNA成碱基配对的区域中缺失或置换一个或 多个核苷酸而形成不与靶基因的mRNA结合的位点。此外，还可通过在与靶基因的mRNA成碱 基配对的区域中插入或缺失一个或多个核苷酸而形成不与靶基因的mRNA结合的位点。在 这里，为了与靶基因的mRNA成碱基配对，应缺失、置换或插入1-10个核苷酸，优选为1-5个 核苷酸，以使结合能在 _30kcal/mol与-13kcal/mol之间。
[0078] 在本发明的另一个实施例中，进行实验以检测合成sRNA是否不仅简单地抑制靶 mRNA的表达，而且还将表达调控至不同水平以将蛋白质的产量调控至不同水平，从而更精 确地调控细胞代谢途径。具体地，构建抑制DsRed2基因表达的合成sRNA以及抑制lacZ基 因表达的合成sRNA。此外，合成sRNA被构建为以从0至-60kcal/mol范围内的结合能结 合到各mRNA，并测定各合成sRNA对靶mRNA表达的抑制程度（图23)。结果可以看出，在 约-10kcal/mol至_40kcal/mol的范围内，革E mRNA的表达线性下降，在_40kcal/mol或更 低处，表达未出现额外下降。这表明，当根据本发明的合成sRNA被构建为以-10kcal/mol 至-40kcal/mol范围内的结合能结合到靶mRNA时，它可抑制靶mRNA的表达至期望水平。因 此，在本发明中，与靶基因 mRNA成碱基配对的区域优选被构建为使得与靶基因 mRNA的结合 能在-l〇kcal/mol至_40kcal/mol范围内。更优选地，与祀基因 mRNA成碱基配对的区域优 选被构建为使得与祀基因 mRNA的结合能在_20kcal/mol至_40kcal/mol范围内。
[0079] 同时，当合成sRNA被额外导入质粒以调控靶基因的表达并在细胞中生成时，sRNA 会通过利用细胞的能量源来干扰细胞的生长。因此，在本发明的另一个实施例中，检测额外 导入的合成sRNA是否对细胞生长和细胞内蛋白表达有任何影响（图24)。将0个、1个、2 个、3个和4个合成sRNA导入具有ColEl复制起点的质粒，测定在质粒中DsRed2基因表达 水平的变化。结果可以看出，导入多达三个合成sRNA也不会影响DsRed2的表达（图24b)。 此外，测定导入〇个、1个、2个、3个和4个合成sRNA是否对细胞的生长速率有任何影响。 在这种情况下，测定细胞的对数生长期的光密度^ΟΟηπι)，并将其拟合到以下细胞生长曲线 方程，以计算单位时间的细胞生长常数（k) :y = y^expOi · t)，其中是初始0. D. 600值， t是时间。结果可以看出，导入多达三个合成sRNA时，k值略有下降，但下降不显著。这表 明，导入多达三个合成sRNA不会显著影响细胞的生长（图24c)。
[0080] 在本发明的另一个实施例中，进行实验以检测能否基于上述构建合成sRNA的方 法来构建抑制其它靶mRNA的其它合成sRNA，以及其它合成sRNA的抑制效果是否足够。例 如，构建用于除DsRed2之外，抑制AraC、KanR和LuxR mRNA的合成sRNA (图6)。将所构建 的三个sRNA和三种基因进行组合，检测各组合的表达抑制作用。对于该检测，将DsRed2蛋 白融合到各基因以发出红色荧光。实验结果表明，sRNA对靶mRNA的表达抑制率是均匀的 (80-86% )，且其它mRNA的表达与未使用合成sRNA的情况没有差别。
[0081] 对三个合成sRNA与各靶mRNA的之间的结合能进行评估。结果，与想要的靶标的结 合能在-53. 7至-59. 5kcal/mol的范围内，而与其它mRNA的结合能在-12. 2至-13. 5kcal/ mol的范围内。该分析结果表明，当与祀mRNA的结合能在约-50kcal/mol或更低且与其它 mRNA的结合能在-13kcal/mol或更高时，sRNA能足以仅抑制期望祀标，而无交叉反应。换 句话说，根据本发明的方法构建的合成sRNA的特征在于，充分抑制靶mRNA的表达，而不抑 制其它mRNA的表达。
[0082] 应该理解的是，能够从先前的研究报道的结果足以预测出转录的mRNA的RBS，并 且可从MicC (必要时，SgrS或MicF)构建合成sRNA以结合到任何mRNA。
[0083] 此外，对本领域普通技术人员显而易见的是，根据本发明的用于制备sRNA合成 的方法可以相同方式应用至除DsRed2、AraC、kanR和LuxR之外的其它基因，这些基因 包括在本发明的实施例内，因而本发明的范围并不限于这些基因。此外，从上述研究结 果表明的，可以以相同方式预测原核生物中的RBS位点，且sRNA在原核生物中的进化是 保守的，可以看出用于制备合成sRNA的方法除大肠杆菌之外也可应用至其它原核生物， 包括根瘤菌（Rhizobium)、双歧杆菌（Bifidobacterium)、红球菌（Rhodococcus)、念珠菌 属（Candida)、欧文氏菌（Erwinia)、肠杆菌（Enterobacter)、巴氏杆菌（Pasteurella)、 曼氏杆菌（Mannheimia)、放线杆菌（Actinobacillus)、伴放线菌（Aggregatibacter)、黄 杆菌（Xanthomonas)、弧菌（Vibrio)、假单胞菌（Pseudomonas)、固氮菌（Azotobacter)、 不动杆菌（Acinetobacter)、劳尔氏菌（Ralstonia)、农杆菌（Agrobacterium)、根瘤菌 (Rhizobium)、红杆菌（Rhodobacter)、单胞发酵菌（Zymomonas)、芽抱杆菌（Bacillus)、 葡萄球菌（Staphylococcus)、乳球菌（Lactococcus)、链球菌（Streptococcus)、乳 杆菌（Lactobacillus)、梭菌（Clostridium)、棒状杆菌（Corynebacterium)、链霉菌 (Streptomyces)、双歧杆菌（Bifidobacterium)和圆杆菌（Cyclobacterium)。
[0084] 在本发明中，源自MicC、SgrS和MicF中的任何一种的sRNA的Hfq结合位点可依 次位于与靶基因 mRNA成碱基配对的区域，或可通过接头（如核酸片段）连接到所述区域。 如在此使用的，"成碱基配对"指在核酸序列之间成碱基配对。与靶基因 mRNA成碱基配对的 区域可具有与靶基因 mRNA为约70-80 %或更多，优选为约80-90 %或更多，且甚至更优选为 95-99 %或更多的序列互补性。
[0085] 此外，本发明的sRNA可按照一般方法来合成，但不限于此。换句话说，可经化学合 成或酶促合成sRNA。
[0086] 根据本发明的sRNA可包括化学修饰。化学修饰可以是在sRNA中的至 少一种核苷酸的核糖的2'位置的羟基被氢原子、氟原子、-0-烃基、-0-酰基和 氨基中的任何一种取代。此外，为提高递送sRNA的能力，化学修饰还可以是羟基 被-81*、-(：1、-1?、-1? /(?、-5!1、-51?、43和-0以1?=烃基、酰基或亚烃基）中的任何一种取 代。此外，化学修饰可以是至少一种核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯形式、二硫代磷酸酯形 式、磷酸烷基酯形式、氨基磷酸酯形式和磷酸硼键形式中的任何一种取代。此外，化学修饰 可以是包括在siRNA中的至少一种核苷酸被LNA (锁核酸）、UNA (解锁核酸）、吗啉和PNA (肽 核酸）中的任何一种取代。
[0087] 在另一方面，本发明涉及一种编码sRNA的分离的核酸，以及一种包括所述编码 sRNA的分离的核酸的表达载体。
[0088] 在本发明中，"核酸"可以是RNA、DNA、稳定的RNA或稳定的DNA。如在此使用的， 术语"编码"是指编码sRNA以及与sRNA互补的核酸序列。
[0089] 如在此使用的，术语"载体"是指这样的DNA结构，其包含有效地连接到能够影响 DNA在合适的宿主中表达的合适的控制序列的DNA序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或 仅仅是潜在的基因组插入物。一旦整合到合适的宿主中，载体就会复制并独立于宿主基因 组起作用，或在某些情况下，整合到基因组本身。在本说明书中，"质粒"和"载体"有时可以 交替使用，因为质粒是最常用的载体形式。为了本发明的目的，优选使用质粒载体。可用于 这一目的的典型的质粒载体包括：(a)复制起点，通过这一复制起点复制有效地发生，使得 每个宿主细胞中生成数百个质粒载体；(b)抗生素抗性基因，通过这一基因可筛选转化有 质粒载体的宿主细胞；以及（c)可插入外源DNA片段的限制性酶切位点。即使载体中不存 在合适的限制性酶切位点，也可利用传统的合成的寡核苷酸适体或接头，使载体与外源DNA 片段易于连接。连接之后，载体应转化到合适的宿主细胞中。可通过氯化钙法或电穿孔容 易地实现转化（Neumann, et al.，EMBO J.，1:841，1982)。作为根据本发明的用于表达sRNA 的载体，可使用本领域已知的表达载体。
[0090] 当一个核苷酸序列与另一个核苷酸序列被布置成功能关系时，该核苷酸序列被有 效地连接。核苷酸序列可以是被连接成当它与控制序列结合时能够表达基因（例如，转录 激活蛋白）的基因和对照序列。例如，前序列或分泌前导物的DNA在表达为参与多肽分泌 的前蛋白时被有效地连接至DNA编码多肽；启动子或增强子在影响序列的转录时有效地连 接至编码序列；RBS在影响序列的转录时有效地连接至编码序列，或者在布置成促进翻译 时有效地连接至编码序列。通常，术语"有效地连接"是指DNA连接的序列是连续的，以及 在分泌前导物的情形中是连续的且存在于读码框中。然而，增强子不一定是连续的。这些 序列之间的连接是通过在方便的限制性酶切位点处进行连接来执行的。然而，当不存在该 位点时，根据传统的方法使用合成寡核苷酸适体或接头。
[0091] 在又一方面，本发明涉及一种包括编码SRNA的分离的核酸的表达载体转化的重 组微生物。如在此使用的，术语"转化"是指DNA可作为染色体之外的因子被复制或通过将 DNA导入宿主内完成整个染色体而被复制。
[0092] 当然，应理解的是，所有载体并不是发挥相同作用来表达本发明的DNA序列。类 似地，所有宿主并不是相对于相同的表达体系发挥相同作用。然而，在不背离本发明的范 围或承担过度的实验负担的情况下，本领域的普通技术人员可从各种载体、表达控制序列 和宿主中适当地选择。例如，载体的选择必须考虑到宿主，因为载体必须在宿主中复制。特 别地，还应考虑载体的拷贝数、调控拷贝数的能力以及由相应载体编码的其它蛋白的表达 (例如，抗生素标记的表达）。
[0093] 在又一方面，本发明涉及无需缺失基因来改变代谢途径的通量而有效地抑制细胞 内表达，从而增加了所需代谢产物的产量。在本发明的一个实施例中，发现可通过利用合成 sRNA抑制细胞内靶基因的表达来人工调控代谢途径的通量，由此可在大肠杆菌中高效率地 生产酪氨酸和酚类/苯酚。在本发明的另一实施例中，发现利用相同的原理可在大肠杆菌 中高效率地生产尸胺。因此，本发明涉及一种抑制靶基因表达的方法，所述方法包括以下步 骤：在原核生物中导入或表达sRNA ;以及抑制靶基因的mRNA表达。
[0094] 优选地，可通过按照诱导物（如阿拉伯糖）结合而工作的启动子来诱导sRNA的表 达，或可通过温度敏感型转录因子（如cl)来抑制sRNA的表达。具体地，为了正确表达合 成sRNA，可利用外源诱导物和温度敏感型转录因子对sRNA的表达进行双重调控。具体地， 可通过噬菌体λ启动子PR来表达合成 SRNA，并且其表达无疑可通过从pBAD启动子表达温 度敏感型蛋白cl (ts2)而利用温度和阿拉伯糖浓度来控制。
[0095] 根据本发明的sRNA可用于筛选需要缺失的基因以生产有用物质。用于筛选需要 缺失的基因以生产有用物质的方法包括以下步骤：(a)对存在于用于生产有用物质的菌株 中并参与有用物质的生物合成途径的基因中的至少一种基因，利用靶向所述基因的sRNA， 抑制基因表达；以及（b)如果有用物质的产量通过抑制基因的表达而增加，则选择表达被 抑制的基因作为需要缺失的基因，以生产有用物质。如在此使用的，术语"缺失"旨在包括 使目的基因的一部分突变、置换或缺失，或向基因中导入一个或多个核苷酸，或导入抑制目 的酶的表达或活性的化学物质、基因或酶，从而抑制酶的活性。此外，选定的待缺失的基因 也可用于改良生产有用物质的菌株。在进一步的方面，本发明涉及一种改良生产有用物质 的菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
[0096] (a)对存在于用于生产有用物质的菌株中并参与有用物质的生物合成途径的基因 中的至少一种基因，利用靶向所述基因的sRNA，抑制基因表达；
[0097] (b)如果有用物质的产量通过抑制基因的表达而增加，则选择表达被抑制的基因 作为需要缺失的基因，以生产有用物质；以及
[0098] (c)构建缺失了选定基因或选定基因的组合的重组菌株。
[0099] 在本发明的一个实施例中，发现当利用根据本发明的sRNA抑制tyrR和csrA在具 有酪氨酸生物合成途径的宿主细胞中的表达时，细胞中酪氨酸的产量增加。在又一方面，本 发明涉及一种具有增强的生产酪氨酸能力的重组微生物，所述重组微生物是通过使具有酪 氨酸生物合成途径的宿主细胞中的tyrR和csrA基因的功能失活得到的。
[0100] 如在此使用的，术语"功能失活"旨在包括使目的基因的一部分突变、置换或缺失， 或向基因中导入一个或多个核苷酸，或导入抑制目的酶表达或活性的化学物质、基因或酶， 从而抑制酶的活性。因此，使特定基因的功能失活的方法不限于任何特定的方法，只需目的 特定基因的活性和由基因编码的酶的活性被常规方法抑制，所述方法包括通过反义RNA抑 制表达、同源重组、各种重组酶（λ重组酶等）表达的同源重组、以及利用逆转录酶和RNA 插入特测序列。
[0101] 此外，在本发明的一个实施例中，构建重组质粒，所述重组质粒过表达参与酪氨酸 生物合成途径的以下基因（图10) :PPsA，编码phenolpthiocerol合成I型聚酮合成酶A ; tktA，编码转酮醇酶；aroG和aroF，编码3-脱氧-7-磷酸庚酮合成酶；aroK，编码莽草酸激 酶I ;tyrA，编码分支酸变位酶；以及tyrC，编码源自运动发酵单胞菌的预苯酸脱氢酶。特别 地，本发明提供一种通过对反馈抗性基因 aroG和tyrA中的一个或多个氨基酸残基进行定 点诱变而构建的重组质粒，以增加酪氨酸代谢途径的激活（aroG A146N and tyrA A354V/ M53I, LutkeEversloh et al, Applied Microbiology and Biotechnology, 75:103, 1999)〇
[0102] 将上述构建的重组质粒转化到14种不同的大肠杆菌菌株中，包括 K-12 菌株（C600、DH5a、ER2925、JM110、MG1655、S17-l、TlR(0ne shot(R)ccdB SurvivalTM2TlR，Invitrogen)、TGI、T0P10、W3110、XLl-Blue)、B 菌株（BL21 (DE3)、W 菌株 以及K-12菌株和B菌株杂交菌株（HB101)，然后测定在各转化的菌株中的酪氨酸产量（图 11)。
[0103] 虽然本发明阐明了属于埃希氏菌属的14种微生物菌株，但是本发明的范围不限 于这14种微生物菌株，因为显而易见的是，本发明的合成sRNA和重组质粒在以下菌株中同 样起作用：大肠杆菌、芽孢杆菌、根瘤菌、双歧杆菌、红球菌、念珠菌属、欧文氏菌、肠杆菌、巴 氏杆菌、曼氏杆菌、放线杆菌、伴放线菌、黄杆菌、弧菌、假单胞菌、固氮菌、不动杆菌、劳尔氏 菌、农杆菌、根瘤菌、红杆菌、单胞发酵菌、芽孢杆菌、葡萄球菌、乳球菌、链球菌、乳杆菌、梭 菌、棒状杆菌、链霉菌、双歧杆菌和圆杆菌。
[0104] 可以看出，即使酪氨酸生物合成途径被相同的生物合成途径激活，各菌株也会显 示出不同的生产酪氨酸的能力。这表明，即使属于大肠杆菌物种的菌株也具有不同的细胞 内活性。因此，这表明，对于代谢工程，应检测所有不同菌株中所需化合物的产量，以达到所 需化合物的最大产量。相应地，可以看出，难以按照传统的耗时的缺失方法通过修饰染色体 序列来进行检测。这样看来，以类似于基因缺失方法而无需修饰染色体序列的方式来降低 靶基因的表达的技术（即，根据本发明的合成SRNA技术）非常有用。
[0105] 在本发明中，将祀向tyrR mRNA的抗-tyrR合成sRNA克隆到上述构建的重组质粒 中，以相同的方式检测合成sRNA在14种不同菌株中的作用。将剩余的三个调控其他代谢 通量的合成sRNA各克隆到相同的重组质粒中，结合检测其作用（图11)。结果可以看出，当 tyrR被抑制时，酪氨酸在大多数菌株中的产量增加。然而，当额外导入抑制ppc或pgi表 达的合成sRNA时，酪氨酸的产量降低而不是增加。特别地，可以看出，当pgi的表达被抑制 时，大肠杆菌菌株的生长速率下降，因此，菌株中酪氨酸的总产量下降。
[0106] 在本发明中，对基因 pgi的表达的抑制程度更加多样化，以在宿主细胞的生长与 酪氨酸的代谢通量之间取得平衡，从而增加酪氨酸的总产量。为此，合成调控基因 pgi的一 部分结合序列被缺失，以降低结合能力。具体地，如图13所示，将结合序列的一个或两个核 苷酸缺失，然后观察细胞生长和酪氨酸产量的变化。结果从图11可以看出，随着基因的抑 制程度降低，酪氨酸的产量增加，同时宿主细胞的生长速率也增加。对此，图12示出了生产 酪氨酸能力最高的S17-1菌株以及生产酪氨酸能力最低的T0P10菌株。
[0107] 通过本发明中进行的上述过程，发现基因 tyrR和csrA的表达被抑制的大肠杆菌 菌株S17-1显示出最高的生产酪氨酸能力（2g/L)。
[0108] 利用本发明构建的重组S17-1菌株进行发酵，结果表明，酪氨酸的产量可高达 21. 9g/L (图 15)。
[0109] 为了验证所需化合物酪氨酸的产量即使对于相同的代谢工程也会随细胞的代谢 能力而变化，以及为了证明所构建的合成sRNA有效表达它的靶RNA，对靶RNA在S17-1和 T0P10菌株中表达的抑制程度进行测定（图14)。结果表明，靶RNA在两种菌株中的表达被 有效抑制约80-90%。这表明，合成sRNA不管对何种菌株都显示出类似的抑制活性。
[0110] 在本发明中，发现合成sRNA可用于调控代谢通量，由于它的优点在于它不需要修 饰染色体序列，同时可有效确定由抑制各种大肠杆菌菌株中靶基因的表达引起的酪氨酸的 产量。
[0111] 在本发明中，将酪氨酸酚裂解酶（TPL)额外克隆到所构建的质粒中，以使酪氨酸 变为苯酚并生产苯酚。此外，将构建的质粒导入上述试验的14种不同的大肠杆菌菌株中， 然后测定大肠杆菌菌株中苯酚的产量。结果表明，在W3110菌株中苯酚的产量为357. 6mg/ L，在显示出最高的生产酪氨酸能力的S17-1菌株中苯酚的产量为68.8mg/L。这是首次在大 肠杆菌中成功生产苯酚。在更进一步的方面中，本发明涉及一种能够生产苯酚的重组微生 物，所述重组微生物是通过在上述重组微生物中导入或扩增tpl基因而获得的。
[0112] 在本发明的另一个实施例中，检测合成sRNA是否可以调控代谢通量以增加尸胺 的产量。为此，将据报道通过赖氨酸生物合成途径生产尸胺的W3110重组菌株（XQ56)作为 基本菌株（图 17) (Qian et al, Biotechnology and Bioengineering, 108(1) :93-103,201 1)。基本菌株已经包括P15CadA重组质粒，将合成sRNA克隆到分离的质粒pWAS中并转化到 菌株中（图18)。
[0113] 为了增加生产尸胺所需的代谢产物的量，选定以下八个将被抑制的候选基因： gltA (朽1檬酸合成酶）、thrA(天冬氨酸激酶I)、thrB(高丝氨酸激酶）、thrC (苏氨酸合 酶）、thrL(thr操纵子前导肽）、metB(胱硫醚γ-合酶）、murE(UDP-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨 酰-D-谷氨酰-L-赖氨酸连接酶）和murF (UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酰-2, 6-二 氨基庚二酸-D-丙氨酰-D-丙氨酸连接酶）。
[0114] 在包含所构建的合成sRNA的重组质粒转化之后，测定尸胺的产量。基本菌株中尸 胺的产量为1. 4±0. 05g/L，将它作为100%时，八个候选基因中的murE、metB和thrL各自 表达被抑制的菌株显示出尸胺产量增加为：对于murE，增加55% (2. 15g/L)，对于metB，增 加 24% (1. 73g/L)，以及对于 thrL，增加 34% (1. 87g/L)(图 19)。
[0115] 在本发明的另一个实施例中，对130种候选基因进行相同的实验，结果如图27所 示，发现表5中列出的总共37种基因表达的抑制导致尸胺产量的增加。基本菌株中尸胺的 产量为1.4±0. 05g/L，将它作为100%时，murE和ack基因的表达被抑制的菌株显示出尸 胺产量增加为：对于murE，增加55% (2. 15g/L)，对于ack，增加40% (1. 96g/L)(图27)。
[0116] 因此，在另一进一步的方面中，本发明涉及一种具有增强的生产尸胺的能力的 重组微生物以及用于生产所述重组微生物的方法，所述重组微生物是通过使具有尸胺 生物合成途径的宿主细胞中的选自以下基因中的至少一种基因的功能失活而获得的： murE (UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酰-2, 6-二氨基庚二酸连接酶）、metB (胱硫醚 Y -合酶）、thrL (thr操纵子前导肽）、ackA (丙酸激酶/乙酸激酶活性）、pdhR (丙酮酸脱氢 酶复合物调控因子）、ilvG_l (乙酰乳酸合酶II、大亚基、N-ter片段（假基因 ））、carB (氨 甲酰磷酸合成酶）、serC(磷酸羟基苏氨酸转氨酶/3-磷酸丝氨酸转氨酶）、ilvN(乙酰羟 基丁酸乙酯合成酶/乙酰乳酸合成酶）、Crp(CRP转录双调控因子）、ilvD(二羟酸脱水 酶）、ilvY(IlvY DNA-结合转录双调控因子）、glpK(甘油激酶）、glpF(甘油MIP通道）、 pta(磷酸乙酰转移酶）、tktA(转酮醇酶I)、hflD(溶原化调控因子）、deoA(胸苷磷酸 化酶/尿嘧啶磷酸化酶）、gadE(GadE控制参与谷氨酸依赖体系的基因转录）、rbsK(核 糖激酶）、ilvL(ilvGEDA操纵子前导肽）、ilvC(乙酰羟酸还原异构酶）、accA(乙酰辅酶 A羧基转移酶，α-亚基）、ilvM(乙酰羟基丁酸酯合酶/乙酰乳酸合酶）、argB(乙酰谷 氨酸激酶）、thrA(天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶）、carA (氨甲酰磷酸合酶）、fbp (果 糖-1，6-二磷酸酶）、rbsD (核糖批喃酶）、panD (天冬氨酸脱氢酶）、aspA (天冬氨酸脱氨 酶）、rcsB(RcsB-BglJ DNA结合转录激活因子）、ivbL(ilvB操纵子前导肽）、lexA(LexA抑 制参与细胞DNA损伤应答的几种基因的转录）、rbsA(核糖ABC转运蛋白）、murF(D-丙氨 酰-D-丙氨酸加合酶）和thrC (苏氨酸合酶）。优选地，所述重组微生物是通过使选自以下 基因中的至少一种基因的功能失活而获得的：murE、metB、thrL和ackA。具有尸胺生物合 成途径的宿主细胞的实例包括大肠杆菌、根瘤菌、双歧杆菌、红球菌、念珠菌属、欧文氏菌、 肠杆菌、巴氏杆菌、曼氏杆菌、放线杆菌、伴放线菌、黄杆菌、弧菌、假单胞菌、固氮菌、不动杆 菌、劳尔氏菌、农杆菌、根瘤菌、红杆菌、单胞发酵菌、芽孢杆菌、葡萄球菌、乳球菌、链球菌、 乳杆菌、梭菌、棒状杆菌、链霉菌、双歧杆菌和圆杆菌。
[0117] 以下，将参照实施例更详细地描述本发明。对于本领域的普通技术人员将显而易 见的是，这些实施例仅是解释性的目的，而不被理解为限制本发明的范围。
[0118] 实施例1 :合成sRNA的件能检测
[0119] 1-1 :合成sRNA的构律以及用于调控表汰的dWAS质粒的构律
[0120] 构建图18中所示的基本质粒，其中合成sRNA的表达被抑制，但如果需要的话能有 效地表达。在图18的pWAS质粒中，可通过定点诱变将靶基因 mRNA结合区域插入启动子 (Ρκ)和MicC Hfq结合区域中来构建合成sRNA。
[0121] 该实施例以及以下实施例中使用的限制性酶均购自New England Labs(USA)，PCR 聚合酶购自Invitrogen(USA)。其它试剂分别注明。
[0122] 首先，利用 pKD46 质粒（GenBank AY048746 · 1 (Dat senko e t al,PNAS, 97 (12) :6640-6645, 2000))作为模板以及 SEQ ID NO: 2 和 SEQ ID NO: 3 的引物进 行PCR，并利用SacI/EcoRI将araC-PBAD启动子克隆到pWA质粒（图20, SEQ ID NO: 1)中。 此外，利用来自噬菌体λ染色体（Bioneer，韩国；GenBank NC_001416.1)的SEQ ID N0:4 和SEQIDN0:5的引物进行PCR，通过PacI/EcoRIand裂解，然后连接得到cI基因。此外， 在进行PCR之后，将Tl/TE序列作为转录终止序列额外克隆到质粒中。在这里，Tl/TE序列 是利用SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7的引物无需模板进行PCR得到的，它被EcoRI/Xbal裂 解然后连接到导入有araC-pBAD-cI的载体，使得cl的末端可以终止。将以上的构建载体作 为模板，利用SEQ ID N0:8和SEQ ID勵:9的引物通过？0?扩增11"^之后用乂11〇1/邱111 裂解并连接到以上的构建载体，使得sRNA的转录可独立终止。利用构建载体作为模板以及 SEQ ID N0:10和SEQ ID N0:11的引物进行定点诱变，由此将野生型cl基因修饰为温度敏 感型突变基因 cl(ts2)。
[0123] 所用引物序列
[0124] [SEQ ID NO:2]5'-AAGCTGGAGC TCAATACTAG TCGATTTATTATGACAACTT GACGGCTACA TC-3，
[0125] [SEQ ID N0:3]5'-GAATTCAATT AATTAATTAA AATTCCCAAAAAAACGGGTA TGGAGAA-3'
[0126] [SEQ ID N0:4]5,-GGGAATTTTA ATTAAAAGGA GACCCGGGATATGAGCACAA AAAAGAAACC ATTAACA-3'
[0127] [SEQ ID N0:5]5'-AATTATGAAT TCTTAGCCAA ACGTCTCTTCAGG-3'
[0128] [SEQ ID N0:6]5，-AATAT GAATTCCCAG GCATCAAATAAAACGAAAGG CTCAGTCGAA AGACTGGGCC TTTCGTTTTATCTGTTGTTT GTCGGTGAAC GCTCTCTACT AGAGTC-3'
[0129] [SEQ ID N0:7]5,-AATAT TCTAGATATA AACGCAGAAAGGCCCACCCG AAGGTGAGCC AGTGTGACTC TAGTAGAGAGCGTTCACCGA CAAACAACAG ATAAAACGAA AG-3'
[0130] [SEQ ID N0:8]5,-TTTTTTCTCG AGCCAGGCAT CAAATAAAACGAA-3'
[0131] [SEQ ID N0:9]5'-GAATTGGGTA CCTATAAACG CAGAAAGGCCCACC-3'
[0132] [SEQ ID N0:10]5'-gAAGTTAT CGCTAGTCAG TGGCC-3'
[0133] [SEQ ID N0:11]5'-CCCCACAACG GAACAACTCT-3'
[0134] 接下来，按以下方式通过PCR构建作为基于合成sRNA的结构的序列和PR启动子。 对于MicC结构，利用大肠杆菌W3110染色体（GenBank AP009048)为模板以及SEQ ID N0:12 和SEQ ID N0:13的引物进行PCR，利用TOPO克隆试剂盒（Invitrogen)将PCR产物克隆、测 序，然后利用Pstl/Xhol连接到以上的构建载体。对于SgrS结构，利用上述相同的模板以 及SEQIDN0 :14和SEQIDN0:15的引物进行PCR，利用T0P0克隆试剂盒将PCR产物克隆、 测序，然后利用Pstl/Xhol克隆到以上的构建载体中。对于MicF结构，利用SEQ ID N0:16 和SEQ ID NO: 17的引物无需模板进行PCR，利用Τ0Ρ0克隆试剂盒将PCR产物克隆、测序， 然后利用Pstl/Xhol克隆到载体中。以这种方式，可构建具有不同的基本结构的三个载体。 图2中示出了各sRNA结构。利用SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19的引物进行用于使克隆 与该质粒一致的PCR或测序。
[0135] 所用引物序列
[0136] [SEQ ID NO:12]5'-CTGCAGGAAT TCTAACACCG TGCGTGTTGACTATTTTACC TCTGGCGGTG ATAATGGTTG CTTTCTGTTGGGCCATTGCA TTGC-3'
[0137] [SEQ ID N0:13]5，-CTCGAGAAAA AAAGCCCGGA CGACTGTTC-3'
[0138] [SEQ ID NO:14]5'-CTGCAGGAAT TCTAACACCG TGCGTGTTGACTATTTTACC TCTGGCGGTG ATAATGGTTG CGATGAAGCAAGGGGGTGC-3'
[0139] [SEQ ID N0:15]5'-CTCGAGAAAA AAAACCAGCA GGTATAATCTGCTG-3'
[0140] [SEQ ID NO: 16]
[0141] 5'-CTGCAGGAAT TCTAACACCG TGCGTGTTGA CTATTTTACCTCTGGCGGTG ATAATGGTTG CTCATTTCTG AATG-3'
[0142] [SEQ ID NO: 17]5'-TCGAGMAAA AAACCGAATG CGAGGCATCCGGTTGAAATA GGGGTAAACA GACATTCAGA AATGAGCAACCATTATCAC-3'
[0143] [SEQ ID N0:18]5'-AGTGGGAACC TAGACACTAA-3'
[0144] [SEQ ID N0:19]5，-CTAGGTAAAC CCAGGAGG-3'
[0145] 于是，构建图20所示的pWAS质粒。PR启动子是噬菌体λ启动子，cl (ts2)是作 用为抑制PR启动子的噬菌体λ基因，且cl(ts2)是通常在25°C起作用而在37°C失去功能 的温度敏感型突变蛋白（Jana et al, Protein Engineering, 13 (3) :225-233, 1999)。当在 25°C条件下含1%阿拉伯糖的LB培养基（1%胰蛋白胨、l%NaCl、0. 5%酵母提取物）中培 养质粒时，cl (ts2)充分表达且它的功能保持完整，因此它抑制PR启动子，从而不表达合成 sRNA。然而，当在37°C、不含阿拉伯糖的条件下培养质粒时，cl(ts2)不能充分表达且由于 它在该温度下的不稳定性而丧失功能，因此它不能抑制PR启动子，从而表达合成sRNA。
[0146] 1-2 :用于测试合成sRNA的件能的报告质粒的构律
[0147] 构建用于检测合成sRNA的功能的报告质粒。用于克隆报告质粒的基本质粒为 PR15CA。基本质粒的结构在图21中示出，且其序列为SEQ ID N0:20。
[0148] T1/TE是报告基因的转录终止序列，通过利用（实施例1-2中构建的）pWAS质粒作 为模板以及SEQIDN0:21和SEQIDN0 :22的引物进行PCR扩增Tl/TE，用XhoI/KpnI裂 解PCR产物，然后克隆到pR15CA质粒中。通过利用pBluescript SK+(Stratagene)作为模 板以及SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24的引物扩增表达DsRed2基因的lac启动子，并利用 EcoRI/XhoI将PCR产物克隆到质粒中。最后，利用pDSRed2-Nl(Cl〇nt ech)作为模板以及 SEQIDN0:25和SEQIDN0:26的引物扩增DsRed2基因，并利用PacI/XhoI将PCR产物克 隆到PR15CA载体中，由此构建报告质粒。
[0149] 所用引物序列
[0150] [SEQ ID N0:21]5,-ATAATTCTCG AGCCAGGCAT CAAATAAAACGAAAGGCT-3'
[0151] [SEQ ID N0:22]5'-AATTAGGTAC CTATAAACGC AGAAAGGCCCACC-3'
[0152] [SEQ ID NO:23]5'-AATTAGAATTCGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTG-3'
[0153] [SEQ ID N0:24]5'-AATTACTCGA GAATTATTTA ATTMTAAAGTTAATTTTTT TTTTTTGTGT GAAATTGTTA TCCGCTC-3'
[0154] [SEQ ID N0:25]5'-AATTATTAAT TAAAAGGAGG ACAAATATATGGCGAGC-3'
[0155] [SEQ ID NO :26]5'-AATTACTCGA GTTACGCCAC CAGGGCATAGTTTTCATCAT TTGCCGCCAG GAACAGGTGG TGGCGGCCCT CGGT-3，
[0156] 1-3 :用于诜择某于合成sRNA的结构的sRNA的构律及其件能检测
[0157] 为了将靶向DsRed2mRNA的核糖体结合位点（RBS)的序列分别插入到实施例1-1 中构建的包含基于sRNA的结构（MicC、SgrS和MicF)的三个pWAS质粒的每个中，利用以下 引物进行PCR。DsRed2的RBS及其结合的序列在图2中示出。
[0158] 首先，利用实施例1-1的质粒（pWAS中包含基于MicC的结构）以及SEQ ID N0:27 和SEQ ID NO: 28的引物通过PCR进行定点诱变，以在基于MicC的结构前面插入靶向DsRed2 的互补结合序列，由此构建具有靶向DsRed2的MicC结构的合成sRNA。将定点诱变的PCR 产物在DNA凝胶上纯化，用Dpnl处理1小时，然后用T4多核苷酸激酶和T4DNA连接酶处 理4小时，接着转化到DH5-a。按照与上述相同的过程，利用包含基于pWAS-SgrS的结构 的载体作为模板以及SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30的引物进行定点诱变，由此构建具 有基于SgrS的结构的合成sRNA。此外，利用包含基于pWAS-MieF的结构的载体作为模板 以及SEQ ID N0:31和SEQ ID N0:32的引物进行定点诱变，由此构建具有基于MicF的结 构的合成sRNA。将上述构建的三个不同的合成sRNA各转化到报告质粒转化的大肠杆菌 DH5-a (Invitrogen，USA)中，然后在37?条件下含35yg/ml氯霉素和50yg/ml氨节青 霉素的LB培养基中培养大肠杆菌细胞至静止期，然后在FACSCalibur流式细胞仪（Becton Dickinson)中进行突光测定。
[0159] 所用引物序列
[0160] [SEQ ID NO:27]5' -GCGAGCAGTGAGAACGTCATAAGTCAACTTTCAGAATTGCGGTCATCCC A-3，
[0161] [SEQ ID NO:28]5'-CATATATTTGTCCTCCTTAAATCACCCGCCAGCAGATTATACCTG-3'
[0162] [SEQ ID N0:295'-GCGAGCAGTGAGAACGTCATGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'
[0163] [SEQ ID NO:30]5'-CATATATTTGTCCTCCTTTCATTTCTGAATGTCTGTTTACCCCTA-3'
[0164] [SEQ ID NO:31]5,-GCGAGCAGTGAGAACGTCATGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'
[0165] [SEQ ID NO:32]5'-CATATATTTGTCCTCCTTTCATTTCTGAATGTCTGTTTACCCC-3'
[0166] 结果如图3所不，通过将祀向DsRed2mRNA的RBS的序列插入SgrS的Hfq结合位 点而得到的合成sRNA对DsRed2的表达抑制85 %，通过将靶向DsRed2mRNA的RBS的序列插 入MicC的Hfq结合位点而得到的合成sRNA对DsRed2的表达抑制90 %。换句话说，结果表 明选定的三个结构均有助于有效抑制表达，特别地，包括MicC的Hfq结合位点的sRNA结构 的效果更好。
[0167] 实施例2 :对合成sRNA的功能有效的mRNA位置的筛诜
[0168] 为了确定对合成sRNA的稳定功能有效的mRNA的结合位置，利用pWAS质粒作为模 板构建合成rRNA，以便结合到DsRed2的各个位点。
[0169] 按照与实施例1-3中所述相同的方式，利用以下引物通过PCR扩增被导入各合成 sRNA的区域以及与DsRed2mRNA成碱基配对的区域，所述区域被导入包括MicC的Hfq结合 位点的pWAS质粒中。
[0170] 在图4中，序列A是利用SEQ ID N0:27和SEQ ID N0:28的引物得到的；序列B1 是利用SEQIDN0:33和SEQIDN0:34的引物得到的；序列B2是利用SEQIDN0:35和SEQ ID N0:36的引物得到的；序列C1是利用SEQ ID N0:37和SEQ ID N0:38的引物得到的； 序列C2是利用SEQ ID N0:39和SEQ ID N0:40的引物得到的；D1是利用SEQ ID N0:41和 SEQ ID N0:42的引物得到的；D2是利用SEQ ID N0:43和SEQ ID N0:44的引物得到的；El 是利用SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物得到的；E2是利用SEQ ID NO:47和SEQ ID N0:48的引物得到的；FI是利用SEQ ID N0:49和SEQ ID N0:50的引物得到的；F2是利用 SEQ ID N0:51 和 SEQ ID N0:52 的引物得到的；G1 是利用 SEQ ID N0:53 和 SEQ ID N0:54 的引物得到的；以及G2是利用SEQ ID N0:55和SEQ ID N0:56的引物得到的。
[0171] 所用引物序列
[0172] [SEQ ID NO:33]5'-GACAAATATATGGCGAGCAGTGAGAA-3'
[0173] [SEQ ID NO:34]5,-TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGC-3'
[0174] [SEQ ID NO:35]5'-CACCGAGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'
[0175] [SEQ ID NO:36]5,-ATGACGTTCTCACTGCTCGCCA-3'
[0176] [SEQ ID NO:37]5'-GCGAGCAGTGAGAACGTCAT-3'
[0177] [SEQ ID NO:38]5'-TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGC-3'
[0178] [SEQ ID NO:39]5,-CACCGAGTTCATGCGCTTGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'
[0179] [SEQ ID NO:40]5,-ATGACGTTCTCACTGCTCGCCA-3'
[0180] [SEQ ID N0:41]5,-TGTTCACCGGGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'
[0181] [SEQ ID N0:42]5,-GCTCCTCGCTTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3，
[0182] [SEQ ID N0:43]5,-CATCCTGGTGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'
[0183] [SEQ ID N0:44]5,-GGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCTTTCT-3'
[0184] [SEQ ID N0:45]5,-GGGTGGTGCCGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'
[0185] [SEQ ID N0:46]5'-CGGTGAACATTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3'
[0186] [SEQ ID N0:47]5'-CGAGCTGGAGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'
[0187] [SEQ ID N0:48]5,-ACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACATTTCT-3，
[0188] [SEQ ID N0:49]5,-CATCCTGGTCGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'
[0189] [SEQ ID NO:50]5'-GGCACCACCTTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3'
[0190] [SEQ ID N0:51]5'-GGCGACGTAGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'
[0191] [SEQ ID NO:52]5'-GTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCTTT-3'
[0192] [SEQ ID NO:53]5,-ACTACAAGAAGCGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'
[0193] [SEQ ID NO:54]5'-CGGGGATGTCGGTTTCTGTTGGGCCATTGCATTGC-3'
[0194] [SEQ ID NO:55]5,-CAAGAAGCTGTCGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'
[0195] [SEQ ID NO:56]5'-TAGTCGGGGATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTGC-3'
[0196] 将构建的合成sRNA各转化到实施例1-2中构建的转化有报告质粒的DH5- α菌株 中，并测定各菌株中DsRed2荧光的减少。
[0197] 结果如图5所示，当sRNA结合到DsRed2mRNA的RBS的一部分或全部时， DsRed2mRNA的表达被抑制90-99%。当sRNA结合到除RBS之外的区域时，对DsRed2mRNA 表达的抑制是不规律的（47-90%)。这样的结果表明，当sRNA包括可互补地结合到靶基因 的mRNA的RBS的区域时，对靶基因的mRNA表达的抑制更有效。
[0198] 实施例3 :针对其它靶mRNA的sRNA的构律以及夺叉反应件测定
[0199] 为了检测根据本发明的sRNA是否能够抑制除DsRed2之外的其它基因的mRNA的 表达，通过定点诱变将与LuxR、AraC和KanR基因的各mRNA的RBS互补的序列插入MicC结 构，以便结合到RBS。在图6中，将与各靶基因的RBS互补的序列用下划线画出并用红色表 /_J、1 〇
[0200] 合成sRNA抗-LuxR是通过利用（包含基于MicC的结构的）pWAS质粒作为模板以 及SEQIDN0 :57和SEQIDN0:58的引物通过定点诱变而构建的，抗-AraC是利用SEQID N0:59和SEQIDN0:60的引物构建的，抗-KanR是利用SEQIDN0:61和SEQIDN0:62的 引物构建的。为了检测各基因的表达水平，构建各基因与DsRed2的融合蛋白。为此，利用实 施例1-2的包含DsRed编码序列的报告质粒作为模板以及SEQ ID N0:64和SEQ ID N0:26 的引物进行PCR扩增，将PCR产物用Pacl/Xhol限制性酶裂解，然后将其导入实施例1-2的 报告质粒中。
[0201] 利用费氏弧菌ES114染色体（GenBank CP000020.2，CP000021.2)作为模板以及 SEQ ID N0:65和SEQ ID N0:66的引物通过PCR扩增LuxR基因，用Pacl/Clal处理PCR产 物，然后克隆到实施例1-2中构建的新的报告质粒中，由此构建LuxR-DsRed2融合蛋白。利 用 SEQ ID N0:67 和 SEQ ID N0:68 的引物对以及 SEQ ID N0:69 和 SEQ ID N0:70 的引物对 分别扩增AraC和KanR基因，然后按照上述相同的方式进行克隆。
[0202] 所用引物序列
[0203] [SEQ ID NO:57]5' -TTAATTAAAATCTACTCTAGAGGTGCAGGGGCAGGCGCTGGTGCGGGTGCCA TGGCGAGCAGTGAGAACGTCAT-3，
[0204] [SEQ ID N0:58]5'-AATACTCCGCGGTATAAACGCAGAAAGGCCCACC-3'
[0205] [SEQ ID N0:59]5'-TCATTTTGATTGCTCCTTTTTCTGTTGGGCCATTGCATTGC-3'
[0206] [SEQ ID N0:60]5'-CTGAAGCGCAAAATGATCGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'
[0207] [SEQ ID NO:61]5'-CCATCCGTTTTTCTCCTTTTTCTGTTGGGCCATTGCATTGC-3,
[0208] [SEQ ID N0:62]5'-GAACAAGATGGATTGCGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'
[0209] [SEQ ID N0:63]5'-AATCATGTAAACGACTCCTTTTTCTGTTGGGCCATTGCATTGC-3'
[0210] [SEQ ID NO :64]5' -AATTATTAATTAAAATCTACATCGATGGTGCAGGGGCAGGCGCTGGTGCGGG TGCCATGGCGAGCAGTGAGAACGTCAT-3，
[0211] [SEQ ID N0:65]5'-AATTATTAATTAAGGAGCAATCAAAATGAACATCAAGAACATCAACGCG-3，
[0212] [SEQ ID N0:66]5'-AATTAATCGATATTTTTAAGGTATGGACAATTAATGGCGC-3'
[0213] [SEQ ID N0:67]5'-AATTATTAATTAAAAGGAGAAAAACGGATGGCTG-3'
[0214] [SEQ ID NO:68]5'-AATTAATCGATTGACAACTTGACGGCTACATCATTCA-3'
[0215] [SEQ ID N0:69]5'-AATTATTAATTAAGGAGTCGTTTACATGATTGAACAAGATGGATTGCAC G-3，
[0216] [SEQ ID NO:70]5'-AATTAATCGATGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATA-3'
[0217] 接下来，如图7A所示，将构建的包含三个合成sRNA和三种靶基因的质粒各自分别 转化到DH5-a菌株，然后在图7B中示出了菌株中DsRed2的相对荧光以及测量结果。
[0218] 结果可以看出，通过本发明的方法构建的合成sRNA对靶基因显示出80-86%的表 达抑制效果。此外，非靶基因的表达水平与不包含sRNA的情况类似。
[0219] 这样的结果表明，根据本发明的制备方法的合成sRNA可仅仅有效抑制靶基因的 mRNA的表达。此外，如图8所示，当与祀mRNA的结合能为-53kcal/mol或更低且与其它 mRNA的结合能为-13kcal/mol或更高时，将不会发生交叉反应。
[0220] 实施例4 :利用合成sRNA的产牛酪氨酸的重纟目微牛物的牛产
[0221] 为了构建用于产生芳香化合物酪氨酸的重组微生物，通过以下步骤进行试验以选 择生产酪氨酸能力最高的菌株以及菌株中抑制的基因的组合：（1)构建过表达参与芳香化 合物（特别是酪氨酸）的生物合成途径的酶的质粒，以增强朝向化合物的代谢通量；（2)构 建对编码去向与酪氨酸生物合成途径相反的途径的酶和蛋白质的基因表达进行抑制的合 成sRNA，以将细胞内代谢通量导向酪氨酸生物合成途径；以及（3)将质粒转化到14个不同 的大肠杆菌菌株中，然后将合成sRNA的各种组合额外转化到菌株中。
[0222] 4-1 :用于增强芳呑化合物的牛物合成涂径的活件的某本质粒的构律
[0223] 首先，构建过表达增强芳香化合物的生物合成途径的活性所需的酶的质粒。
[0224] 该实施例中使用的革巴基因是：ppsA，编码phenolpthiocerol合成I型聚酮合成酶； tktA，编码转酮醇酶；aroG和aroF，编码3-脱氧-7-磷酸庚酮合成酶；aroK，编码莽草酸激 酶I ;tyrA，编码分支酸变位酶；以及tyrC，编码源自运动发酵单胞菌的预苯酸脱氢酶（图 9)。
[0225] 首先，如图10所示，构建不包含合成sRNA的pTyr-b质粒。具体地，利用pTacl5k 质粒（Hiszczynska-Sawicka et al.，Plasmid38:174，1997)作为基本质粒，利用大肠杆菌 W3110 染色体（GenBank AP009048)作为模板以及 SEQ ID N0:71 和 SEQ ID N0:72 的引物 通过PCR扩增aroF基因，然后利用EcoRI/SacI将其克隆到pTacl5k质粒中。接下来，利用 大肠杆菌W3110染色体作为模板以及SEQIDN0 :73和SEQIDN0:74的引物通过PCR扩 增tktA基因，然后利用Xbal/SphI将其克隆到质粒中。接下来，利用大肠杆菌W3110染色 体作为模板以及SEQIDN0 :75和SEQIDN0:76的引物通过PCR扩增ppSA基因，然后利用 Sacl/Spel裂解，之后将被裂解基因连接到用Sacl/Xbal裂解的质粒载体。以这种方式，构 建不包含合成sRNA的pTyr-b质粒。
[0226] 所用引物序列
[0227] [SEQ ID N0:71]5'-AATTATGAATTCATGCAAAAAGACGCGCTGAATAAC-3'
[0228] [SEQ ID N0:72]5'-TAATTGAGCTCTTAAGCCACGCGAGCCGTCA-3'
[0229] [SEQ ID N0:73]5,-ATCATATCTAGAAGGAGGTTATTCATGTCCTCACGTAAAGA-3'
[0230] [SEQ ID N0:74]5,-TTCGTTGCATGCTTACAGCAGTTCTTTTG-3'
[0231] [SEQ ID NO:75]5'-AATTAAGAGCTCTTAATTAACGGTTAAATATGCAAAGATAAATGCG-3 '
[0232] [SEQ ID N0:76]5'-AATTAAACTAGATTATTTCTTCAGTTCAGCCAGG-3'
[0233] 接下来，通过构建pTyr-a质粒克隆参与酪氨酸生物合成的剩余基因（图10)。这 些基因将被在 MIT Registry (http://partsregistry. org)注册的 BBa_J23113 启动子表 达。具体地，利用SEQ ID NO: 77和SEQ ID NO: 78的引物无需模板通过PCR构建目的启动 子。利用Τ0Ρ0克隆试剂盒克隆所构建的启动子，并进行测序以确认误差，之后用Sacl/Notl 裂解并将其连接到实施例1的PWA质粒。利用实施例1的pWAS质粒作为模板以及SEQ ID NO: 79和SEQ ID NO: 80的引物通过PCR扩增转录终止序列T1/TE，然后连接到启动子的下 游。以这种方式，构建PWA-J23113-T1/TE质粒，然后将剩余基因克隆到该质粒。然后，通过 PCR扩增从启动子到T1/TE范围的区域，并将其克隆到pWA质粒中，由此构建图10所示的 pTyr-a 质粒。
[0234] 所用引物序列
[0235] [SEQ ID NO:77]5' -GAGCTCCTGATGGCTAGCTCAGTCCTAGGGATTATGCTAGCCATATCGAAAG GATAGTCTTGATAACCATAAGTTTAATTAAGCGGCCGC-3 ,
[0236] [SEQ ID NO :78]5' -GCGGCCGCTTAATTAAACTTATGGTTATCAAGACTATCCTTTCGATATGGCT AGCATAATCCCTAGGACTGAGCTAGCCATCAGGAGCTC-3 ,
[0237] [SEQ ID N0:79]5'-ATAATTGAATTCCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGC-3'
[0238] [SEQ ID N0:80]5'-CGAATTGGGTACCTATAAACGCAGAAAGGCCCACCCG-3'
[0239] 具体地，利用大肠杆菌W3110染色体作为模板以及SEQ ID N0:81和SEQ ID N0:82 的引物通过PCR扩增tyrA基因，然后用PacI/EcoRI将它裂解并克隆到pWA-J23113-Tl/TE 质粒中，由此构建包括启动子-编码序列-转录终止序列的基因。tyrA对酪氨酸的反馈抑 制敏感，因此，为了消除反馈抑制，通过A354V/M53I定点诱变除去tyrA的两个氨基酸残基。 在这里，利用SEQIDN0:83和SEQIDN0:84的引物尝试A354V突变，并利用SEQIDN0:85 和SEQ ID N0:86的引物将得到的质粒进行M53I突变，由此消除反馈抑制（Lutke-Eversloh et al, Applied Microbiology and Biotechnology, 75:103, 1999)〇
[0240] [SEQ ID N0:81]5,-AATCATTTAATTAAACGGCTCGCGTGGCTTAAG-3，
[0241] [SEQ ID N0:82]5,-AATTAAGAATTCTTACTGGCGATTGTCATTCGCC-3'
[0242] [SEQ ID N0:83]5,-TTTGGCCTCGCGTCGTGCA-3'
[0243] [SEQ ID N0:84]5'-ATAGATGCCTCGCGCTCCG-3'
[0244] [SEQ ID N0:85]5,-TGCAGCGTTTTCAGAGTGAAAGCC-3'
[0245] [SEQ ID N0:86]5'-CGTAATCGCCGAACCAGTGCTC-3'
[0246] 按照与上述相同的方式，克隆aroG、aroK和tyrC。具体地，利用大肠杆菌W3110 染色体作为模板以及SEQIDN0 :87和SEQIDN0:88的引物通过PCR扩增aroG，利用SEQ IDN0:89和SEQIDN0 :90的引物通过PCR扩增aroK，利用运动发酵单胞菌染色体（ZM6菌 株，ATCC29191)作为模板以及SEQ ID N0:91和SEQ ID N0:92的引物通过PCR扩增tyrC。 用PacI/EcoRI裂解PCR产物然后将其克隆到pWA-J23113-Tl/TE中。在这些基因中，aroG 也对反馈抑制敏感，因而进行A146N氨基酸突变。利用SEQ ID N0:93和SEQ ID N0:94的 引物通过定点诱变进行这种突变，类似于tyrA的情形（Lutke-Eversloh et al, Applied Microbiology and Biotechnology, 75:103, 1999)〇
[0247] [SEQ ID N0:87]5'-TTAATTAAAGGAGAAAAAATGAATTATCAGAACGACGATTTAC-3'
[0248] [SEQ ID N0:88]5'-GAATTCTTACCCGCGACGCGCTTTT-3'
[0249] [SEQ ID N0:89]5,-AATTAATTAATTAAGACTCTCGCAATATCTTATG-3，
[0250] [SEQ ID NO:90]5'-AATTAAGAATTCTTAGTTGCTTTCCAGCATGTG-3,
[0251] [SEQ ID N0:91]5,-TTAATTAAGGAGAAAAAAATGACCGTCTTTAAGCATATTGCCA-3'
[0252] [SEQ ID N0:92]5'-GAATTCTTAAGGGTGAATATCGTGGTCTGTTTTT-3'
[0253] [SEQ ID N0:93]5,-AATATGATCACCCCACAATATCTCG-3'
[0254] [SEQ ID N0:94]5,-GAGAAACTCACCTGCCGCT-3'
[0255] 使上述构建的 pWA-J23113-tyrA(A354V/M53I)(或 aroG(A146N)、aroK、tyrC)-Tl/ TE进行PCR以扩增从启动子到Tl/TE范围的总区域，用Spel/SacI裂解PCR产物并将其克 隆到用Xbal/SacI裂解的pWA中。Xbal和Spel的特征在于它们可以彼此互补地结合，但只 要裂解区域的一个序列结合不同，它们就会马上消失。因为SEQ ID N0:96的引物包括Xbal 和SacI，利用Spel/SacI可无限克隆PCR扩增的基因，且利用Xbal/SacI可无限克隆载体。
[0256] [SEQ ID N0:95]5'-AATTAAACTA GTCTGATGGC TAGCTCAGT-3'
[0257] [SEQ ID N0:96]5'-ATTAATGAGC TCATAATTTC TAGATATAAACGCAGAAAGG CC-3'
[0258] 以这种方式，将 tyrA (A354/M53I)、aroG (A146N)、tyrC 和 aroK 顺序克隆到 pWA 中。
[0259] 4-2 :#用质粒的14个不同的大肠杆菌菌株的酪氨酸牛产力的检测
[0260] 将上述构建的两个质粒转化到以下14种不包含合成sRNA的不同的大肠杆菌菌 株中：K-12 菌株（C600(ATCC23738)、DH5 a (Invitrogen)、ER2925 (New England Labs)、 JM110(Agilent Technologies)、MG1655(Invitrogen)、S17-1(ATCC 47055)、TlR(0ne shot (R) ccdB SurvivalTM2TlR, Invitrogen) > TGI (ZymoResearch) > T0P10 (Invitrogen) > W3110 (ATCC39936)、XL1-Blue (Agilent Technologies))、B 菌株（BL21 (DE3, Promega)、W 菌 株（ATCC9637)以及K-12菌株和B菌株的杂交菌株（HB101, Promega)。
[0261] 在含50/ml氨苄青霉素和50/ml卡那霉素的LB培养基中培养所得的重组微生物 至静止期，然后将其以1/100的体积比转移到含50ml培养基的摇瓶中。然后，在37°C条件 下培养微生物细胞达48小时，测定在培养期间酪氨酸的最大浓度。摇瓶中使用的培养基如 下表1、2所示。
[0262] Μ 1
[0263] [表 1]
[0264]
【权利要求】
1. 一种用于抑制原核生物中基因表达的sRNA，所述sRNA包括：源自MicC、SgrS和MicF 中的任何一种的sRNA的Hfq结合位点；以及与靶基因 mRNA成碱基配对的区域。
2. 如权利要求1所述的sRNA，其中与靶基因 mRNA成碱基配对的区域与所述靶基因 mRNA的核糖体结合位点的全部或部分成碱基配对。
3. 如权利要求1所述的sRNA，其中不与靶基因 mRNA结合的位点是通过在与所述靶基 因 mRNA成碱基配对的区域中缺失或置换一个或多个核苷酸而形成的。
4. 如权利要求1所述的sRNA，其中不与靶基因 mRNA结合的位点是通过在与所述靶基 因 mRNA成碱基配对的区域中插入或缺失一个或多个核苷酸而形成的。
5. 如权利要求1所述的sRNA，其中与靶基因 mRNA成碱基配对的区域被构建成与所述 革巴基因 mRNA的结合能在-10kcal/mol至_40kcal/mol的范围内。
6. 如权利要求5所述的sRNA，其中与靶基因 mRNA成碱基配对的区域被构建成与所述 革巴基因 mRNA的结合能在_20kcal/mol至_40kcal/mol的范围内。
7. 如权利要求1所述的sRNA，其中所述sRNA包括源自MicC的sRNA的Hfq结合位点。
8. 如权利要求1所述的sRNA，其中所述原核生物选自由大肠杆菌、根瘤菌、双歧杆菌、 红球菌、念珠菌属、欧文氏菌、肠杆菌、巴氏杆菌、曼氏杆菌、放线杆菌、伴放线菌、黄杆菌、弧 菌、假单胞菌、固氮菌、不动杆菌、劳尔氏菌、农杆菌、根瘤菌、红杆菌、单胞发酵菌、芽孢杆 菌、葡萄球菌、乳球菌、链球菌、乳杆菌、梭菌、棒状杆菌、链霉菌、双歧杆菌和圆杆菌构成的 组。
9. 如权利要求1所述的sRNA，其中靶基因 mRNA是选自以下基因的mRNA :DsRed2、 LuxR、AraC、KanR (卡那霉素抗性基因 ）、tyrR (酪氨酸调控因子）、ppc (磷酸烯醇式丙酮酸 羧化酶）、csrA (碳储存调控因子）、pgi (葡萄糖-6-磷酸异构酶）、git (朽1檬酸合成酶）、 accA(乙酰辅酶A羧基转移酶，α -亚基）、accB(生物素化的生物素-羧基载体蛋白）、 accC accC (乙酰辅酶A羧化酶）、accD (乙酰辅酶A羧基转移酶，β -亚基）、aceE (丙酮酸 脱氢酶复合体的Elp成分的亚基）、aceF(丙酮酸脱氢酶）、ackA (丙酸激酶/乙酸激酶活 性）、adiY(AdiY是调控精氨酸的正DNA结合转录调控因子）（脱羧酶（adi)体系）、argB (乙 酰谷氨酸激酶）、argC(N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶）、argG (精氨基琥珀酸合酶）、argH (精 氨基琥珀酸裂解酶）、asnC (激活asnA表达的转录调控因子，参与天冬氨酰合成的基因）、 aspA(天冬氨酸裂氨酶）、crp(CRP转录双向调控因子）、csiD(预测蛋白，CsiD是由碳饥饿 诱导的基因产物）、csiR(DNA结合转录抑制因子）、cytR(用于转运以及利用核糖核苷和脱 氧核糖核苷所需的转录因子）、dcuA(D CUA转运体是已知在厌氧条件下负责摄入C4 一二羧 化物（诸如延胡索酸盐）的三个转运体之一）、de〇B(戊磷酸变位酶）、de〇C(脱氧核苷一磷 酸醛缩酶）、de 〇R(转录抑制因子DeoR，即"脱氧核糖调控因子"，参与与脱氧核糖核苷酸转 运和分解相关的基因的阴性表达）、fabH(KASIII，β -酮乙酰-ACP合酶）、fadD (脂酰辅酶 A)、fadR(FadR脂肪酸降解调节子，是对脂肪酸降解调节子[Simons80，Simons80a]和乙酸 盐代谢施加负调控的多功能双向调控因子）、fbp (果糖-1，6-二磷酸酶）、fnr (FNR是介导 从有氧生长到无氧生长的过渡的主要转录调控因子）、fruR(FruR是通过不同能量代谢途 径调节碳流方向但独立于CRP调控因子的具有多效性作用的双向转录调控因子）、ftsL(细 胞分裂的必要蛋白FtsL)、ftsQ(细胞分裂的必要蛋白FtsQ)、ftsW(细胞分裂的必要蛋 白FtsW)、ftsZ(细胞分裂的必要蛋白FtsZ)、fur(Fur-Fe+2DNA结合转录双向调控因子）、 gabD(NADP+-依赖型琥拍酸半缩醒脱氢酶）、gabP(APC转运体）、gabT(4-氨基丁酸转氨 酶）、gadA (谷氨酸脱羧酶A亚基）、gadB (谷氨酸脱氢酶B亚基）、gadC (GABA APC转运体）、 glcC(GntR家族转录调控因子，glc操纵转录激活因子）、glpK(甘油激酶）、glpR(sn-甘 油-3-磷酸抑制剂）、glpX(果糖1，6-二磷酸酶II)、gltA(柠檬酸合成酶）、hfId(溶源 化调控因子）、ihfa(IHF，整合宿主因子，是球形调节蛋白）、ihfb (IHF，整合宿主因子，是球 形调节蛋白）、ilvB(乙酰羟丁酸酯合酶/乙酰乳酸合酶）、ilvC(乙酰羟酸还原异构酶）、 ilvD (二羟酸脱水酶）、ilvG_l (乙酰乳酸合酶II，大亚基，N端片段（假基因））、ilvG_2 (乙 酰乳酸合酶II，大亚基，C端片段（假基因 ））、i 1 vH(乙酰乳酸合酶/乙酰羟丁酸酯合酶）、 ilvL(ilvGEDA操纵子前导肽）、ilvM(乙酰羟丁酸酯合酶/乙酰乳酸合酶）、ilvN(乙酰羟丁 酸酯合酶/乙酰乳酸合酶）、ilvX(预测小分子蛋白）、lexA(LexA抑制参与对DNA损伤的细 胞应答的几种基因的转录）、lpxC(UDP-3-0-乙酰基-N-乙酰葡糖胺脱乙酰酶）、marA(MarA 参与调控与抗生素抗性、氧化应激、有机溶剂和重金属相关的基因）、metJ(MetJ转录抑制 子）、modE(ModE是控制与钥转运、钥酶合成以及与钥相关功能的操纵子的转录的主要调控 因子）、nadB (L-天冬氨酸氧化酶）、narL (硝酸盐/亚硝酸盐响应调控因子）、pck (磷酸烯 醇丙酮酸羧激酶）、PdhR(PdhR，调控与丙酮酸脱氢酶复合体有关的基因的"丙酮酸脱氢酶 复合体调控因子"）、phoP (PhoP-磷酸化DNA结合转录双向调控因子，是与适应低Mg2+环 境和控制抗酸性基因相关的双组分调节体系phOQ/phoP中的一员）、pnuC (PnuC NMN转运 体）、ppsA (磷酸烯醇丙酮酸合成酶）、pta (磷酸乙酰转移酶）、purA (腺苷酸琥珀酸合成 酶）、purB (腺苷酸琥珀酸裂解酶）、purR(PurR-次黄嘌呤DNA结合转录抑制因子，调控与嘌 呤核苷酸生物合成及其自身合成相关的几种基因的PurR二聚体）、puuE (4-氨基丁酸转氨 酶）、rbsA (核糖ABC转运体）、rbsB (核糖ABC转运体）、rbsD (核糖批喃酶）、rbsK (核糖 激酶）、rbsR(转录因子RbsR，负性自动调节并控制与核糖代谢和转运相关的操纵子的转录 的"核糖抑制因子"）、rcsB (RcsB-BglJ DNA结合转录激活因子，"调控荚膜合成B"的RcsB 蛋白，属于多组分Rc sF/Rc sC/Rc sD/Rc sA-Rc sB磷酸中继体系的反应调节蛋白且与调控荚 膜多糖可拉酸的合成、细胞分裂、周质蛋白、游动性和小分子RNA有关的响应调控因子）、 rutR(RutR直接或间接调控与复杂的嘧啶代谢途径相关的基因）、serA( α -酮戊二酸还原 酶/D-3-磷酸甘油脱氢酶）、serC (磷酸羟苏氨酸转氨酶/3-磷酸丝氨酸转氨酶）、soxS (参 与超氧化物和一氧化氮移除的双向转录激活因子）、sr〇D(Sr〇D小分子RNA)、zwf (葡萄糖 6_磷酸-1-脱氢酶）、asnA (天冬酰胺合成酶A)、asnB (天冬酰胺合成酶B)、carA (氨甲酰 磷酸合成酶）、carB (氨甲酰磷酸合成酶）、ddlB (D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶B)、deoA (胸 苷磷酸化酶/尿嘧啶磷酸化酶）、deoD (嘌呤核苷磷酸化酶deoD基因型）、dpiA (参与柠檬 酸厌氧分解代谢的双向转录调控因子）、fis (Fis，"倒位刺激因子"，主要作用是组织和保持 类核结构的小分子DNA-结合和弯曲蛋白）、gadE(GadE调控与谷氨酸依赖体系相关的基因 的转录）、gadW(GadW调控与谷氨酸依赖体系相关的基因的转录）、gadX(GadX调控与谷氨 酸依赖体系相关的基因的转录）、glpF(GlpF甘油MIP通道）、ilvY(IlvY DNA-结合转录双 向调控因子）、ivbL (ilvB操纵子前导肽（IvbL))、lhgO (L-2-羟基戊二酸氧化酶）、lpd (硫 辛酰胺脱氢酶）、lrp(Lrp是大肠杆菌中至少10%的基因的双向转录调控因子，这些基因参 与氨基酸生物合成和分解代谢、养分运输、菌毛合成以及包括单碳代谢在内的其它细胞功 能）、metB (0-琥珀酰高丝氨酸裂解酶/0-琥珀酰高丝氨酸（巯基）-裂解酶）、metL (天冬 氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶）、mraY (磷酸-N-乙酰胞壁酰-五肽转移酶）、mraZ (功能未 知）、murE (UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酸-D-谷氨酸2, 6-二氨基庚二酸连接酶）、murF (D-丙氨 酸-D-丙氨酸-加成酶）、murG(N-乙酰葡糖氨基转移酶）、nac (无需共同效应子、nac调控 与氮限制条件下的氮代谢相关的基因）、nadA(喹啉酸合成酶）、nsrR(NsrR，调控与对抗一 氧化氮（NO)的细胞相关的基因的"亚硝酸盐敏感抑制剂"）、panC (泛酸合成酶）、panD (天 冬氨酸1-脱羧酶）、pgl (6-磷酸葡糖酸内酯酶）、pyrB (天冬氨酸氨甲酰转移酶，pyrB亚 基）、pyrC (二氢乳清酸酶）、pyrL (天冬氨酸氨甲酰转移酶，PyrI亚基）、rob (Rob是转录 双向调控因子，它的N-端区域与MarA和SoxS具有49 %的同一性，这些蛋白激活一组约50 个常见基因、marA/soxS/rob调节子，与抗生素抗性、超氧化物抗性有关，且对有机溶剂和重 金属有耐受性）、rpe (核酮糖磷酸3-差向异构酶）、talA (转醛醇酶A)、thrA (天冬氨酸激 酶/高丝氨酸脱氢酶）、thrB (高丝氨酸激酶）、thrC (苏氨酸合酶）、thrL (thr操纵子前导 肽）、tktA (转酮醇酶I)、tktB (转酮醇酶II)、torR(双组分体系，OmpR家族，torCAD操纵 子响应调控因子TorR)。
10. -种分离的核酸，编码如权利要求1至9中任一项所述的sRNA。
11. 一种表达载体，包括编码如权利要求1至9中任一项所述的sRNA的分离的核酸。
12. -种重组微生物，导入有如权利要求1至9中任一项所述的sRNA。
13. -种重组微生物，转化有如权利要求11所述的表达载体。
14. 一种制备sRNA的方法，所述方法包括将编码与靶基因 mRNA成碱基配对的区域的核 酸连接到编码源自MicC、SgrS和MieF中的任何一种的所述sRNA的Hfq结合位点的核酸。
15. 如权利要求14所述的方法，其中所述方法包括除去MicC、SgrS和MieF中的任何 一种的所述sRNA的mRNA-结合序列，并导入编码与靶基因 mRNA成碱基配对的区域的核酸。
16. 如权利要求14所述的方法，其中与靶基因 mRNA成碱基配对的区域与所述靶基因 mRNA的核糖体结合位点的全部或部分成碱基配对。
17. 如权利要求14所述的方法，其中不与靶基因 mRNA结合的位点是通过在编码与所述 靶基因 mRNA成碱基配对的区域的核酸中缺失或置换一个或多个核苷酸而形成的。
18. 如权利要求14所述的方法，其中不与靶基因 mRNA结合的位点是通过在编码与所述 靶基因 mRNA成碱基配对的区域的核酸中插入一个或多个核苷酸而形成的。
19. 如权利要求14所述的方法，其中与靶基因 mRNA成碱基配对的区域被构建成与所述 革巴基因 mRNA的结合能在-10kcal/mol至_40kcal/mol的范围内。
20. 如权利要求19所述的方法，其中与靶基因 mRNA成碱基配对的区域被构建成与所述 革巴基因 mRNA的结合能在_20kcal/mol至_40kcal/mol的范围内。
21. -种抑制靶基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：在原核生物中导入或表达 如权利要求1至9中任一项所述的sRNA ;以及抑制靶基因 mRNA的表达。
22. 如权利要求21所述的方法，其中所述sRNA的表达是由按照诱导物结合而工作的启 动子来诱导的。
23. 如权利要求21所述的方法，其中所述sRNA的表达被温度敏感型转录因子抑制。
24. -种用于抑制原核生物中基因表达的组合物，所述组合物包括如权利要求1至9中 任一项所述的sRNA。
25. -种筛选需要被删除的基因以生产有用物质的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 对存在于用于生产所述有用物质的菌株中并参与所述有用物质的生物合成途径的 基因中的至少一种基因，利用靶向所述基因的sRNA，抑制基因表达；以及 (b) 在所述有用物质的产量通过抑制基因的表达而增加的情况下，选择表达被抑制的 基因作为需要被删除的基因，以生产有用物质。
26. -种改良用于生产有用物质的菌株的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 对存在于用于生产所述有用物质的菌株中并参与所述有用物质的生物合成途径的 基因中的至少一种基因，通过利用靶向所述基因的sRNA，抑制基因表达； (b) 如果所述有用物质的产量通过抑制基因的表达而增加，则选择表达被抑制的基因 作为需要被删除的基因，以生产有用物质；以及 (c) 构建缺失了所选定基因或所选定基因的组合的重组菌株。
27. -种具有增强的生产酪氨酸能力的重组微生物，所述重组微生物是通过使具有酪 氨酸生物合成途径的宿主细胞中的tyrR和csrA基因的功能失活得到的。
28. 如权利要求27所述的重组微生物，其中tyrR和csrA基因的功能是通过在具有酪 氨酸生物合成途径的宿主细胞中导入或表达合成sRNA以抑制tyrR和csrA基因的表达而 失活的，所述合成sRNA包括源自MicC、SgrS和MicF中的任何一种的sRNA的Hfq结合位点 以及与tyrR基因或csrA基因的mRNA成碱基配对的区域。
29. 如权利要求27所述的重组微生物，其中所述微生物具有被导入或扩增的选自以下 基因中的一种或多种基因：PPsA(phenolpthiocerol合成I型聚酮合成酶）、tktA(转酮醇 酶）、aroG/aroF(3-脱氧-7-磷酸庚酮合成酶）、aroK (莽草酸激酶I)和tyrC (预苯酸脱氢 酶）。
30. 如权利要求27所述的重组微生物，其中所述ppsA或tktA是由强启动子表达的，而 aroG/aroF、aroK或tyrC是由弱启动子表达的。
31. 如权利要求27所述的重组微生物，其中所述宿主细胞选自由大肠杆菌、根瘤菌、双 歧杆菌、红球菌、念珠菌属、欧文氏菌、肠杆菌、巴氏杆菌、曼氏杆菌、放线杆菌、伴放线菌、黄 杆菌、弧菌、假单胞菌、固氮菌、不动杆菌、劳尔氏菌、农杆菌、根瘤菌、红杆菌、单胞发酵菌、 芽孢杆菌、葡萄球菌、乳球菌、链球菌、乳杆菌、梭菌、棒状杆菌、链霉菌、双歧杆菌和圆杆菌 构成的组。
32. 如权利要求31所述的重组微生物，其中所述大肠杆菌是S17-1 (ATCC47055)。
33. -种具有生产苯酚能力的重组微生物，所述重组微生物是通过在权利要求27所述 的重组微生物中导入或扩增tpl基因而获得的。
34. 如权利要求33所述的重组微生物，其中所述大肠杆菌是W3110(ATCC39936)。
35. -种生产具有增强的生产酪氨酸能力的重组微生物的方法，所述方法包括使具有 酪氨酸生物合成途径的宿主细胞中的tyrR和csrA基因的功能失活。
36. 如权利要求35所述的方法，其中tyrR和csrA基因的功能是通过在具有酪氨酸生 物合成途径的宿主细胞中导入或表达合成sRNA以抑制tyrR和csrA基因的表达而失活的， 所述合成sRNA包括源自MicC、SgrS和MicF中的任何一种的sRNA的Hfq结合位点以及与 tyrR基因或csrA基因的mRNA成碱基配对的区域。
37. -种具有增强的生产尸胺能力的重组微生物，所述重组微生物是通过使具有尸 胺生物合成途径的宿主细胞中的选自以下基因中的至少一种基因的功能失活而获得的： murE (UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酰-2, 6-二氨基庚二酸连接酶）、metB (胱硫醚 Y -合酶）、thrL (thr操纵子前导肽）、ackA (丙酸激酶/乙酸激酶活性）、pdhR (丙酮酸脱氢 酶复合物调控因子）、ilvG_l (乙酰乳酸合酶II、大亚基、N-ter片段（假基因 ））、carB (氨 甲酰磷酸合成酶）、serC(磷酸羟基苏氨酸转氨酶/3-磷酸丝氨酸转氨酶）、ilvN(乙酰羟 基丁酸乙酯合成酶/乙酰乳酸合成酶）、Crp (CRP转录双向调控因子）、ilvD (二羟酸脱 水酶）、ilvY(IlvY DNA-结合转录双向调控因子）、glpK(甘油激酶）、glpF(甘油MIP通 道）、pta (磷酸乙酰转移酶）、tktA (转酮醇酶I)、hf 1D (溶原化调控因子）、deoA (胸苷磷 酸化酶/尿嘧啶磷酸化酶）、gadE(GadE控制参与谷氨酸依赖体系的基因转录）、rbsK(核 糖激酶）、ilvL(ilvGEDA操纵子前导肽）、ilvC(乙酰羟酸还原异构酶）、accA(乙酰辅酶 A羧基转移酶，α -亚基）、ilvM(乙酰羟基丁酸酯合酶/乙酰乳酸合酶）、argB(乙酰谷 氨酸激酶）、thrA(天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶）、carA (氨甲酰磷酸合酶）、fbp (果 糖-1，6-二磷酸酶）、rbsD (核糖批喃酶）、panD (天冬氨酸脱氢酶）、aspA (天冬氨酸脱氨 酶）、rcsB(RcsB-BglJ DNA结合转录激活因子）、ivbL(ilvB操纵子前导肽）、lexA(LexA抑 制参与细胞DNA损伤应答的几种基因的转录）、rbsA (核糖ABC转运蛋白）、murF (D-丙氨 酰-D-丙氨酸加合酶）和thrC (苏氨酸合酶）。
38. 如权利要求37所述的重组微生物，其中所述重组微生物是通过使选自由murE、 metB、thrL和ackA构成的组中的至少一种基因的功能失活而获得的。
39. 如权利要求38所述的重组微生物，其中选自由murE、metB、thrL和ackA构成的组 中的至少一种基因的功能是通过在具有尸胺生物合成途径的宿主细胞中导入或表达合成 sRNA以抑制murE、metB、thrL和ackA中的至少一种基因的表达而失活的，所述合成sRNA包 括源自MicC、SgrS和MicF中的任何一种的sRNA的Hfq结合位点以及与选自由murE、metB、 thrL和ackA构成的组中的至少一种基因的mRNA成碱基配对的区域。
40. 如权利要求37所述的重组微生物，其中所述宿主细胞选自由大肠杆菌、根瘤菌、双 歧杆菌、红球菌、念珠菌属、欧文氏菌、肠杆菌、巴氏杆菌、曼氏杆菌、放线杆菌、伴放线菌、黄 杆菌、弧菌、假单胞菌、固氮菌、不动杆菌、劳尔氏菌、农杆菌、根瘤菌、红杆菌、单胞发酵菌、 芽孢杆菌、葡萄球菌、乳球菌、链球菌、乳杆菌、梭菌、棒状杆菌、链霉菌、双歧杆菌和圆杆菌 构成的组。
41. 一种用于生产具有增强的生产尸胺的能力的重组微生物的方法，所述方法包括 使具有尸胺生物合成途径的宿主细胞中的选自以下基因中的至少一种基因的功能失活： murE (UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酰-2, 6-二氨基庚二酸连接酶）、metB (胱硫醚 Y -合酶）、thrL (thr操纵子前导肽）、ackA (丙酸激酶/乙酸激酶活性）、pdhR (丙酮酸脱氢 酶复合物调控因子）、ilvG_l (乙酰乳酸合酶II、大亚基、N-ter片段（假基因））、carB(氨 甲酰磷酸合成酶）、serC(磷酸羟基苏氨酸转氨酶/3-磷酸丝氨酸转氨酶）、ilvN(乙酰羟 基丁酸乙酯合成酶/乙酰乳酸合成酶）、Crp (CRP转录双向调控因子）、ilvD (二羟酸脱 水酶）、ilvY(IlvY DNA-结合转录双向调控因子）、glpK(甘油激酶）、glpF(甘油MIP通 道）、pta (磷酸乙酰转移酶）、tktA (转酮醇酶I)、hf 1D (溶原化调控因子）、deoA (胸苷磷 酸化酶/尿嘧啶磷酸化酶）、gadE(GadE控制参与谷氨酸依赖体系的基因转录）、rbsK (核 糖激酶）、ilvL(ilvGEDA操纵子前导肽）、ilvC(乙酰羟酸还原异构酶）、accA(乙酰辅酶 A羧基转移酶，α -亚基）、ilvM(乙酰羟基丁酸酯合酶/乙酰乳酸合酶）、argB(乙酰谷 氨酸激酶）、thrA(天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶）、carA (氨甲酰磷酸合酶）、fbp (果 糖-1，6-二磷酸酶）、rbsD (核糖批喃酶）、panD (天冬氨酸脱氢酶）、aspA (天冬氨酸脱氨 酶）、rcsB(RcsB-BglJ DNA结合转录激活因子）、ivbL(ilvB操纵子前导肽）、lexA(LexA抑 制参与细胞DNA损伤应答的几种基因的转录）、rbsA(核糖ABC转运蛋白）、murF(D-丙氨 酰-D-丙氨酸加合酶）和thrC (苏氨酸合酶）。
42. 如权利要求41所述的方法，其中所述重组微生物是通过使选自由murE、metB、thrL 和ackA构成的组中的至少一种基因的功能失活而获得的。
43. 如权利要求42所述的方法，其中选自由murE、metB、thrL和ackA构成的组中的至 少一种基因的功能是通过在具有尸胺生物合成途径的宿主细胞中导入或表达合成sRNA以 抑制murE、metB、thrL和ackA中的至少一种基因的表达而失活的，所述合成sRNA包括源自 MicC、SgrS和MicF中的任何一个的sRNA的Hfq结合位点以及与选自由murE、metB、thrL 和ackA构成的组中的至少一种基因的mRNA成碱基配对的区域。
【文档编号】C12N1/21GK104254606SQ201380012767
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年1月11日 优先权日:2012年1月11日
【发明者】李相烨, 罗度钧, 柳承珉 申请人:韩国科学技术院