专利名称：癌症标记的鉴定方法及其在癌症诊断中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症诊断，更具体地是涉及用质谱(MS)，尤其是基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱(下称“MALDI-TOF MS”)或电喷射质谱来进行癌症诊断的方法。本发明的方法可用于探测任何人或动物被试者体内一个或多个癌细胞或肿瘤的存在，以及任选地用于鉴定癌症或恶性肿瘤的类型，其实施方式是分析所述被试者的血液或血清中一种或多种分子(尤其是糖脂、神经节苷脂或寡糖)水平的升高和/或降低。
一般性说明在整个说明书中，除非上下文要求，否则“包含(comprise)”一词及其语法变体(“comprises”或“comprising”)应理解为意在指包括陈述的步骤或元件或实体或者陈述的步骤组或元件组或实体组，但不排除任何其它的步骤或元件或实体或者元件组或实体组。
本领域的技术人员将理解，可以容易地对本文所述发明进行非本文具体描述的那些改变和修饰。应当理解，本发明包括所有这些改变和修饰。本发明也包括在本说明书中单个或集中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤、特征、组合物和化合物的任何两个或更多个的任意和所有组合。
本发明的范围并不受本文中描述的具体实施方案的限制，这些实施方案只起举例说明的作用。如这里所述，功能上等价的产品、组合物和方法显然都属于本发明的范围。
本说明书中提及任何现有技术文献只是为了进一步描述本发明的目的，并不是用来指出或承认所述文献是澳大利亚或其他地方的技术人员的一部分一般常识。
本文中所用的词“来自”或“属于”和术语“来源于”应理解为是指，所指定的产物，尤其是分子，例如多肽、蛋白质、基因或核酸分子、抗体分子、Ig片段或其他分子或者包括所述分子的生物样品可以从特定的来源、生物体、组织、器官或细胞获得，但并不一定是直接从该来源、生物体、组织、器官或细胞获得的。
本文中所用的“癌症(cancer)”应理解为是指范围广泛的良性或恶性肿瘤中的任一种或多种，包括能够通过人体或动物体或其部分，例如，淋巴系统和/或血流进行扩散性生长和转移的肿瘤。本文所用术语“肿瘤”包括良性和恶性肿瘤或实体生长，但本发明尤其涉及的是恶性肿瘤和实体癌的诊断和检测。典型的癌症包括，但不限于，人的上皮组织恶性肿瘤(cancinomas)、淋巴瘤或肉瘤，例如，卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、急性淋巴细胞白血病、何杰金氏病、肺小细胞癌、黑素瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和软组织肉瘤；和动物的淋巴瘤(几种)、黑素瘤、肉瘤和腺瘤。
在如本文所述和权利要求书所限定的本发明的上下文中，术语“癌症标记”应理解为是指，在人或动物被试者的血液级分中可以检测到的能指示被试者体内癌症的任何分子，尤其是，由被试者的癌细胞或正常细胞产生或者存在于它们上面并且其在患有癌症的被试者的循环系统中的水平与其在健康被试者的循环系统中的水平相比发生了改变的分子。术语“癌症标记”也应包括(i)由癌细胞或在癌细胞上特异表达的分子，或者癌细胞与正常细胞相比时其在癌细胞上的表达或癌细胞对其的表达发生增强的分子，或(ii)由正常细胞或在正常细胞上表达但不在癌细胞上表达或从癌细胞上脱落的分子，或者癌细胞与正常细胞相比时，其在癌细胞上的表达减弱或癌细胞对其的表达减弱的分子。
本领域的技术人员可以把术语“癌细胞标记”理解为是指，在癌细胞上特异表达的，或者癌细胞与正常细胞相比时在癌细胞上的表达发生加强的任何分子。
典型的癌症标记或癌细胞标记包括，尤其是例如，蛋白质、核酸、脂类、糖脂、糖蛋白、糖类(单糖、双糖、寡糖等)，唯一的必要条件是它们与特定疾病、表型或者细胞类型相关并可以通过试验进行检测。
在本文中，“糖脂”是有一个或多个糖部分的脂类或脂肪酸分子，包括神经节苷脂。
本领域技术人员知道，“神经节苷脂”是含有唾液酸的鞘糖脂(即，其中脂肪酸取代的鞘氨醇与含有D-葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰半乳糖胺和/或N-乙酰神经氨酸的寡糖相连的糖脂)，其在大多数哺乳动物细胞膜中表达。神经节苷脂是单-、双-、三-、或多-唾液酸神经节苷脂，这取决于与唾液酸的糖基化作用的程度。根据标准命名法，使用术语“GMn”“GDn”“GTn”，其中“G”表示神经节苷脂、“M”表示单唾液酸神经节苷脂、“D”表示双唾液酸神经节苷脂、“T”表示三唾液酸神经节苷脂；并且其中“n”是数字标识符、其值最小为1，或是混合符号标识符、其值最小为1a(例如1a、1b、1c等)，用于指示就该分子而言所观察到的结合式样[Lehninger，Biochemistry，第294-296页(Worth Publishers，1981)；Wiegandt，GlycolipidsNew Comprehensive Biochemistry，第199-260页(Neuberger等编，Elsevier，1985)]。
与大家所接受的命名法相一致，在本文中提及的分子的分子质量以道尔顿为单位，并以缩写＂Da＂表示。
背景技术：
尽管医学研究有了极大的进步，癌症仍然是世界范围内造成死亡的一个主要原因，有必要建立用于癌症早期诊断的快速而简便的方法，以利于通过外科手术切除、放疗、化疗或其他已知治疗方法来进行适当的治疗。能够拥有良好的癌症诊断方法对于评估患者对治疗的反应，或评估由在原始位置的再生长或转移引起的复发也是重要的。
对癌症标记(例如癌基因产物、生长因子和生长因子受体、血管生成因子、蛋白酶、粘着因子和肿瘤抑制基因产物等)的表征可以提供有关人或动物被试者体内癌症的危险性、存在、状态或将来行为的重要信息。对一个或多个癌症标记的存在或表达水平或活性的测定可以例如通过区分恶性与良性异常，有助于对具有不确定的临床异常的患者进行区别诊断。而且，对于有确定恶性肿瘤的患者，癌症标记可以有助于预测将来复发的危险性或特定患者对选定的治疗路线产生反应的可能性。通过分析高度特异的癌症标记或标记组合可以获得甚至更特异的信息，这些信息可以预测患者对特定药物或选择的治疗方案的反应性。
检测被试者体内癌细胞的大多数已知方法依赖于对患者样本中一个或多个有高分子重量或高分子质量的分子种类的探测。免疫学测定方法包括将样品与能够特异结合样品中的特定癌细胞标记的抗体分子，尤其是单克隆抗体一起温育。作为可选择方案，遗传学试验涉及核酸探针与样品中编码蛋白质性癌细胞标记的核酸的结合，这些标记有例如癌蛋白质。在免疫学和遗传学测定方法到来之前，许多癌细胞标记只能用常规的生化分析方法来探测或测定，这通常需要大量试验样品，因此不适合大多数的临床应用。与之相比，现代免疫测定和遗传测定技术能在相对少得多的样品(包括活检组织或血清)中探测和测定癌细胞标记。
尽管现有的鉴定高分子重量/质量癌细胞标记的测定技术有优点，但这些方法需要预先鉴定标记、预先分离适当探针以利于后来的标记探测，而且测定程序本身需要一个耗时的结合步骤。这就显然需要一个能够探测高和低分子重量/质量癌症标记(和癌细胞标记)并有利于样品处理和分析的快速高通量方法(例如，不需要探针分离或利用这种探针的结合反应的方法)。
另外，免疫测定和遗传测定方法通常被用于确定样品中特定癌细胞标记的存在，这可能是因为探测的抗原和核酸是肿瘤特异性的。这就需要能检测任何特定癌症标记的水平加强或减弱的通用方法。
另外，尽管已经发展了许多依赖于探测循环系统中肿瘤特异性抗原的癌症特异性血液试验(Catalona等.，New England J Med第324卷，第1156-1161页，1991；Barrenetxea等，Oncology第55卷，第447-449页，1998；Cairns等.，Biochim.Biophys.Acta第1423卷，第C11-C18页，1999)，但将血清样品广泛地用于癌症标记测定方法的努力却仅取得了有限的成功。造成此有限成功的原因可能是特定标记无法使用免疫测定或遗传筛选技术在血清中探测到，或者无法对血清中特定标记的水平变化实施监测。显然，对于探测血清样品中癌症标记的存在，这需要一个可重复和可靠的方法。
发明概述在导致本发明的工作中，本发明人试图开发一种鉴定人或动物被试者血液中高和低分子重量/质量癌症标记的通用方法；并试图开发探测恶性肿瘤的相关高通量诊断方法，此方法不限于在探测癌细胞标记或肿瘤特异性标记(即，与正常细胞相比时，在肿瘤细胞中加强的癌症标记)中应用、和/或不依赖于分子探针(例如抗体或核酸探针)的分离、和/或不需要使用这些分子探针的耗时结合步骤。
本发明人发现，质谱(MS)特别适合于鉴定被试者血液或血清中的多种癌症标记，尤其是糖脂或寡糖，与健康被试者相比，其在患有癌症的被试者的循环系统中的丰度发生改变(即，升高或降低)。
本领域技术人员知道，质谱(例如电喷射MS或MALDI-TOF MS)用于分析任何质量的化合物时的适当性必须以经验为依据来确定。这是因为质谱仪的性能只部分由质量分辨率定义。其他重要的属性有质量准确度、灵敏度、信噪比和动态范围。定义总体性能的各种因素的相对重要性取决于样品类型和分析目的，但在具体应用时为了获得满意的性能，通常必须对几个参数进行明确规定和同时优化。目前，本发明人证实了质谱可用于鉴定血液或血清级分中的癌症标记，并且通过分析癌细胞标记的改变其可帮助快速而准确地诊断癌症。
因此，本发明一方面提供了鉴定癌症标记的方法，包括(I)用质谱分析法分离来自患有癌症的人或动物被试者的血液级分；(II)用质谱分析法分离来自健康的人或动物被试者的血液级分；(III)对比(I)和(II)中得到的分子种类分布图，并鉴定那些(I)与(II)相比时在(I)中有改变水平的分子种类，其中所述分子种类的升高或降低的水平表明这些分子种类是癌症标记。
对于本领域技术人员来说，显然，按照本发明的这个方面鉴定出的癌症标记可以指示人或动物被试者的特定类型癌症，因此将有助于诊断或探测这类癌症。因此，本发明的第二方面提供了鉴定指示特定癌症的癌症标记的方法，所述方法包括(I)用质谱分析法分离来自患有癌症的人或动物被试者的血液级分；(II)用质谱分析法分离来自患有的癌症不同于(I)的癌症的人或动物被试者的血液级分；(III)用质谱分析法分离来自健康的人或动物被试者的血液级分；(IV)对比(I)和(II)和(III)中得到的分子种类分布图，并鉴定那些与(III)相比在(I)或(II)中有改变水平的分子种类，其中所述改变水平表明该分子种类是指示特定癌症的癌症标记。
在一个备选实施方案中，本发明的这方面提供了鉴定指示特定癌症的癌症标记的方法，所述方法包括(I)用质谱分析法分离来自人或动物被试者的一组血液级分，其中所述组中的每一个成员都来自患有不同癌症的被试者；(II)用质谱分析法分离来自健康人或动物被试者的血液级分；(III)将(I)中来自所述血液级分组的各成员的分子种类分布图进行相互比较，并与来自(II)的血液级分的分子种类分布图进行比较；(IV)从(III)鉴定出当与(II)的血液级分的分子种类分布图比较时在(I)的所述组的一个成员中有改变水平的分子种类，其中所述改变水平表明该分子种类是指示特定癌症的癌症标记。
本发明的第三方面指向人或动物被试者中癌症的诊断或探测，所述方法使用至少一个质谱分析步骤。
在该方面的一个实施方案中，本发明提供了诊断或探测人或动物被试者中癌症的方法，包括(I)用质谱分析法分离包含来自怀疑患有癌症的人或动物被试者的血液级分的测试样品；(II)用质谱分析法分离包含来自健康被试者的血液级分的对照样品；(III)对比(I)和(II)中得到的癌症标记的水平，其中与对照样品相比，测试样品中所述癌症标记水平的升高或降低指示(I)中的被试者患有癌症。
从本文的描述中显然可以看到，一旦依照本发明使用质谱分析法鉴定出癌症标记，即可以应用本领域公知的任何方法来测定被试者体内癌症标记的水平是否发生改变，所述改变水平可以用于诊断癌症。因此，如果在鉴定癌症标记时应用了质谱分析法，那么在实际诊断中就用不着应用该方法。
因此，本发明的一个备选实施方案提供了诊断和探测人或动物被试者体内癌症的方法，包括；(I)依据本文所描述的一个或多个实施方案，用质谱分析法鉴定癌症标记；和(II)测定来自怀疑患有癌症的人或动物被试者的血液级分中所述癌症标记的水平，其中将所述血液级分与健康血液级分相比时，所述癌症标记的水平改变指示被试者患有癌症。
本发明的第四方面提供了选自下组的分离的癌症标记(I)分子质量在1439到1459Da之间(平均质量1454Da)的糖脂；(II)分子质量在1587到1597Da之间(平均质量1592Da)的糖脂；(III)分子质量在1616到1626Da之间(平均质量1621Da)的糖脂；(IV)分子质量在1671到1681Da之间(平均质量1676Da)的糖脂；(V)分子质量在1681到1691Da之间(平均质量1686Da)的糖脂；(VI)分子质量在809到819Da之间(平均质量814Da)的糖脂或寡糖；和(VII)分子质量在1016到1026Da之间(平均质量1021Da)的糖脂或寡糖。
附图简述
图1是MALDI-TOF质谱层析图的复制图，它是通过分离来自注射了硫酸葡聚糖的BALB/c小鼠的血清的硫酸铵/吡啶级分得到的。在脉冲电压832伏下，通过MALDI-TOF MS，分析未吸附在C18Seppak柱体上的血清级分。X轴表示分子质量(m/z)，纵坐标用与最高丰度分子种类(即，m/z＝839.9Da±5Da)的丰度百分比来表示每个分子种类的相对丰度。每个峰上面的数字表示这个峰的分子质量，单位是Da。箭头指示其水平在硫酸葡聚糖处理后升高的、分子质量(m/z)约为1022 Da±5Da的化合物的位置。
图2是MALDI-TOF质谱层析图的复制图，它是通过分离来自正常BALB/c小鼠的血清的硫酸铵/吡啶级分得到的。在脉冲电压835伏下，通过MALDI-TOF MS分析未吸附在C18Seppak柱体上的血清级分。X轴表示分子质量(m/z)，纵坐标用与最高丰度分子种类(即，m/z＝840Da±5Da)的丰度百分比来表示每个分子种类的相对丰度。每个峰上面的数字表示这个峰的分子质量，单位是Da。箭头指示分子质量(m/z)约为1022Da±5Da的化合物(图1)的位置。
图3是MALDI-TOF质谱层析图的复制图，它是通过分离来自裸鼠的血清的硫酸铵/吡啶级分而得到的。在脉冲电压910伏下，通过MALDI-TOFMS分析未吸附在C18Seppak柱体上的血清级分。X轴表示分子质量(m/z)，纵坐标用与最高丰度分子种类(即，m/z＝839.8Da±5Da)的丰度百分比来表示每个分子种类的相对丰度。每个峰上面的数字表示这个峰的分子质量，单位是Da。在这些条件下，在裸鼠的血清级分中未能探测到1022Da种类(图1、图2)。
图4A是MALDI-TOF质谱层析图的复制图，它是通过分离来自正常大鼠的血清的硫酸铵/吡啶级分而得到的。在脉冲电压850伏下，通过MALDI-TOF MS分析未吸附在C18Seppak柱体上的血清级分。X轴表示分子质量(m/z)，纵坐标用与最高丰度分子种类(即，m/z＝865Da±5Da)的丰度百分比来表示每个分子种类的相对丰度。每个峰上面的数字表示这个峰的分子质量，单位是Da。箭头指示其水平在患有腺癌的被试者体内降低(图4B)的、分子质量(m/z)约为813.7Da±5Da和1021.2Da±5Da的两种化合物的位置。后一分子质量相应于图1、图2、图3中提及的1022Da种类。
图4B是MALDI-TOF质谱层析图的复制图，它是通过分离来自携带有高度转移性大鼠乳腺癌13762MAT的大鼠的血清的硫酸铵/吡啶级分而得到的。在脉冲电压850伏下，通过MALDI-TOF MS分析未吸附在C18Seppak柱体上的血清级分。X轴表示分子质量(m/z)，纵坐标用与最高丰度分子种类的丰度百分比来表示每个分子种类的相对丰度。每个峰上面的数字表示这个峰的分子质量，单位是Da。未能探测到图4A中箭头所指的两种化合物(m/z值约为813.7Da±5Da和1021.2Da±5Da)。
图5A是MALDI-TOF质谱层析图的复制图，它是通过分离来自正常大鼠的血清的氯仿/甲醇抽提物而得到的。在脉冲电压900伏下，通过MALDI-TOF MS分析氯仿/甲醇处理后从C18Seppak柱体上洗脱下来的血清级分。X轴表示分子质量(m/z)，纵坐标用与最高丰度分子种类的丰度百分比来表示每个分子种类的相对丰度。每个峰上面的数字表示这个峰的分子质量，单位是Da。
图5B是MALDI-TOF质谱层析图的复制图，它是通过分离来自携带有高度转移性大鼠乳腺癌13762MAT的大鼠的血清的氯仿/甲醇抽提物而得到的。在脉冲电压900伏下，通过MALDI-TOF MS分析氯仿/甲醇处理后从C18Seppak柱体上洗脱下来的血清级分。X轴表示分子质量(m/z)，纵坐标用与最高丰度分子种类(即，m/z＝1621.1Da±5Da)的丰度百分比来表示每个分子种类的相对丰度。每个峰上面的数字表示这个峰的分子质量，单位是Da。箭头所指的四种化合物(m/z值约为1454Da±5Da、1592Da±5Da、1621±Da 5Da和1687Da±5Da)在正常大鼠血清中未能以增强的水平被探测到。
图6A是MALDI-TOF质谱层析图的复制图，它是通过分离来自正常大鼠的血清的氯仿/甲醇抽提物而得到的。在脉冲电压900伏下，通过MALDI-TOF MS分析氯仿/甲醇处理后从C18Seppak柱体上洗脱下来的血清级分。X轴表示分子质量(m/z)，纵坐标用与最高丰度分子种类的丰度百分比来表示每个分子种类的相对丰度。每个峰上面的数字表示这个峰的分子质量，单位是Da。箭头指示两种化合物(m/z值约为1185Da±5Da和1676Da±5Da)。
图6B是MALDI-TOF质谱层析图的复制图，它是通过分离来自携带有高度转移性大鼠乳腺癌13762MAT的大鼠的血清的氯仿/甲醇抽提物而得到的。在脉冲电压900伏下，通过MALDI-TOF MS分析氯仿/甲醇处理后从C18Seppak柱体上洗脱下来的血清级分。X轴表示分子质量(m/z)，纵坐标用与最高丰度分子种类(即，m/z＝1676Da±5Da)的丰度百分比来表示每个分子种类的相对丰度。每个峰上面的数字表示这个峰的分子质量，单位是Da。箭头指示两种化合物(m/z值约为1185Da±5Da和1676Da±5Da)，当相对于1185Da种类的水平进行标准化后，1676Da种类在患有癌症的大鼠的血清中的水平相对于其在正常大鼠血清中的水平升高。
优选实施方案详述本发明一方面提供了鉴定癌症标记的方法，包括(I)用质谱分析法分离来自患有癌症的人或动物被试者的血液级分；(II)用质谱分析法分离来自健康的人或动物被试者的血液级分；和(III)对比在(I)和(II)中得到的分子种类分布图，并鉴定那些与(II)相比在(I)中有改变水平的分子种类，其中所述分子种类的升高或降低的水平指出这些分子种类是癌症标记。
本发明优选涉及鉴定与选自下组的癌症有关的癌症标记人的上皮组织恶性肿瘤、淋巴瘤或肉瘤，例如，卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、急性淋巴细胞白血病、何杰金氏病、肺小细胞癌、黑素瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和软组织肉瘤；以及动物的淋巴瘤(几种)、黑素瘤、肉瘤和腺瘤。在本发明的一个特别优选的实施方案中，癌症是上皮组织恶性肿瘤，更优选是腺癌。
本领域技术人员知道，质谱分析法是用于分子重量精确测定、化学结构鉴定、混合物组成测定和定性元素分析的分析方法。在运行中，质谱仪产生所研究样品分子的离子，并根据质荷比分离这些离子，和测量每种离子的相对丰度。
在实施本发明时，优选使用MALDI-TOF MS或电喷射MS质谱分析系统。
实施质谱分析的一般步骤如下(I)从样品产生气相离子；(II)基于它们的质荷比在时间或空间上分离这些离子；(III)测量具有各选定质荷比的各种离子的量。
本文中，术语“通过质谱分析法分离血液级分”或类似术语应理解为包括所述步骤中的任一个或多个。
飞行时间(TOF)质谱仪(例如在USSN5,045,694和USSN5,160,840中所描述的那些)产生所研究样品材料的离子，并通过测量产生的离子飞行到探测器所花费的时间，根据它们的质荷比来分离这些离子。因为具有实际上无限制的质荷比范围且是相对简单并仅相对昂贵的仪器，所以TOF质谱仪具有优势。由于能记录从每个电离事件产生的所有离子，所以TOF质谱仪比扫描仪有潜在的更高灵敏性。在传统磁场质谱仪缺乏灵敏度的有机大分子质荷比测量中TOF质谱仪特别有用。
被给定电势加速的离子的飞行时间与它的质荷比成比例。因此离子飞行时间是其质荷比的函数，大约与质荷比的平方根成比例。假定仅存在单电荷离子，那么最轻的离子组最先到达探测器，其后是质量相继渐重的组。
因此，TOF质谱仪提供了对所研究分子种类的分子质量的极其精确的估计，并且误差通常不超过±5Da且大部分是由于相同质量和电荷的离子没有精确地同时到达探测器而造成的。误差产生的主要原因是所产生离子的初始时间、空间和动能分布，它们将引起质谱峰变宽，由此限制TOF分光计的分辨率。初始时间分布是由于离子形成时间的不确定性造成的。
使用脉冲电离技术可以提高离子形成时间的确定性，例如，等离子体解吸和激光解吸，这些技术在很短的时间内产生离子并导致最小的初始空间分布，原因是离子产生自样品表面上充分限定的区域，离子形成的初始空间不确定性可忽略不计。
脉冲电离(例如等离子体解吸(PD)电离和激光解吸(LD)电离)产生的离子具有最小的空间和时间不确定性，但有相对宽的初始能量分布。因为长脉冲持继时间能严重限制质量分辨率，所以常规LD典型地应用充分短的脉冲(经常少于10纳秒)以最小化时间不确定性。
通过在样品材料中加入在激光波长下有高吸收的有机基质小分子，可以提高LD的性能(即，基质辅助激光解吸附电离，以下简称“MALDI”)。基质有利于样品的解吸和电离。MALDI在生物学应用方面特别有用，因为它有利于分子质量超过100,000Da的生物大分子解吸和电离而不发生碎裂。实施本发明的优选基质包括2-(4-羟基苯基偶氮)苯甲酸(HABA)，也称4-羟基苯-2-甲酸。
在MALDI中，样品通常放置在光滑金属表面，通过脉冲激光束照射样品表面，样品解吸进入气相。因此，离子在很短时间(大约相当于激光脉冲持续时间)和非常小的空间区域(相当于从激光中吸收足够能量而发生蒸发的那部分固体基质和样品)内产生。MALDI为飞行时间(TOF)质谱分析提供了近乎理想的离子来源，尤其是当初始离子速度很小时。在MALDI离子源中使用脉冲离子萃取可以使质量分辨率得到相当大程度的提高。离子反射镜(也称离子镜和反射器，由一个或多个均匀减速静电场组成)也已知可以用于补偿分析物离子的初始动态能量分布的影响，尤其是将其置于自由飞行区域的末端时。就从表面产生离子而言，通过提高分辨率、提高质量准确度，增加信号强度和降低背景噪声对MALDI进行的其它改进是本领域内已知的，例如在USSN6,057,543中描述的那些改进。
本发明包括使用所有修饰的MALDI-TOF MS系统来测定血液级分中的癌症标记，和/或帮助癌症诊断。
电喷射MS或电喷射离子化MS，用于从液相样品基质产生气相离子以容许将样品引入质谱仪。因此，电喷射MS尤其可用于在液相层析仪和质谱仪之间提供一个界面。在电喷射MS中，液体分析物被泵过毛细管(以下简称“针”)，而在针尖和对面壁、毛细管入口或类似结构之间建立有电势差(例如三到四千伏)。从针尖流出的液体流被电场扩散成带高电荷的小液滴，形成电喷射。也可以引导惰性干气(例如干氮气)通过周围毛细管以加强液体流的雾化。电喷射小液滴在电场中运输然后被注入质谱仪中，在此处维持着高度的真空。通过干气和真空的共同作用，小液滴中的载体液体逐渐蒸发，产生更小且逐渐不稳定的小液滴，表面离子从这些小液滴释放出来进入真空接受分析。去溶剂化的离子通过样品锥(samplecone)和除渣透镜(skimmer lens)，经RF透镜聚焦之后进入质谱仪的高真空区域，在此处将根据质量对它们进行分离，并用适当探测器(例如光电倍增管)进行探测。液体流速优选使用20到30微升/分钟，这取决于溶剂的组成。更高的液体流速可导致溶解的样品不能稳定和充分地电离，在这种情况下，可以使用气动辅助电喷射针。
本领域的技术人员也知道，有必要制备用于分析的血液级分，以便引入MS环境。优选地，至少对样品进行脱盐，方法基本上如实施例1所述。更优选地，使用至少一个标准层析分离或纯化步骤，在分析之前把样品进行分级分离。在应用MALDI-TOF MS的情况下，样品与适当的基质混合并干燥；而在应用电喷射MS时，样品以在适当的载体溶液中的液体样品的形式直接进行注射。
术语“患有癌症的被试者”应理解为是指在获得其血液级分用作本发明方法的测试样品时已显示出与癌症有关的一个或多个症状的被试者、或者是先已被诊断为患有癌症的被试者。
如本文所用，术语“健康被试者”应理解为是指在采集血液级分时没有显示出与癌症有关的任何症状的被试者、或者采集血液级分时与癌症有关的症状正处于消退期的被试者、或者采集血液级分时血液或血清中没有表现出以前诊断的肿瘤有任何转移的被试者。因此，不必区分“健康被试者”和怀疑患有癌症的被试者。例如，一个特定的个体(例如有患癌症危险的个体)可以在不同时间提供血液级分，在这种情况下，在任何症状发生前采集的早期血液级分可以用作进行测试的后期血液级分的对照样品。作为一种选择，采集自处于症状减轻或治疗之后阶段的被试者的血液级分可用作较前或较后采集自同一被试者的血液级分的对照样品，例如以监测疾病的进展。
“对照样品”是指具有特定实体的已知组成或具有已知含量的特定实体(此是与测试样品进行比较的基础)的样品。作为对照样品的来源的唯一条件是它不含有经检测与疾病相符的癌症标记水平。
从以上描述中显而易见，通常并不使用质谱分析对整个血液或整个细胞进行分级分离。代替的是，把含有待分析的分子种类的级分，尤其是含有糖脂或寡糖的级分，更优选的是含有神经节苷脂的血液级分加载入质谱仪中。利用本领域技术人员已知的标准方法，或者根据本文中描述的方法不用过多的实验就能制备出这些血液级分。
“血液级分”是指血液的任何衍生物，应理解为包括血液的上清液或沉淀、血清级分或血浆级分、白细胞层级分、T-细胞富集级分、血小板富集级分、血小板红细胞富集级分、嗜碱性粒细胞富集级分、嗜酸性粒细胞富集级分、淋巴细胞富集级分、单核细胞富集级分、嗜中性粒细胞富集级分或者任何部分纯化的或纯化的血液成分(无论其是否与其他血液成分形成混合物)。可以通过例如用沉淀剂(例如低温、酸、碱、硫酸铵、聚乙二醇等)处理血液、或用层析(例如大小排阻层析、离子交换层析、疏水作用层析、反相层析、质谱等)进行分级分离，获得血液级分。
在实施本发明时应用的血液级分特别优选是血清级分。在本文中，术语“血清级分”指来自血清的样品。血清级分的例子包括血浆蛋白级分(例如白蛋白级分、纤维蛋白原(因子I)级分、血清球蛋白级分、因子V级分、因子VIII级分、或包括因子VII、IX和X的凝血酶原复合物级分)、血浆的低温上清液或低温沉淀物、新鲜冷冻血浆的低温上清液或低温沉淀物、血浆级分的低温上清液或低温沉淀物、或者任何部分纯化的或纯化的血清成分(无论其是否与其他血清成分形成混合物)。可以通过例如用沉淀剂(例如低温、酸、碱、硫酸铵、聚乙二醇等)处理血清、或用层析(例如大小排阻层析、离子交换层析、疏水作用层析、反相层析、质谱等)进行分级分离，获得血清级分。
优选地，本发明此方面还包括将获得血液级分作为第一步骤，所述血液级分优选是血清沉淀物形式，和/或优选是脱盐后的形式，和/或优选是经疏水作用层析(例如用聚碳(polycarbon)基质)被分级分离后的形式。显然此处可以考虑根据本领域技术人员已知的步骤获得血液级分的其他方式。
由于本发明的方法在血液或血清上进行，所以它易于实施且无侵害性。
按照本发明鉴定的“分子种类”是糖脂，尤其是神经节苷脂或寡糖化合物。优选地但不是必需地，这类分子是免疫系统依赖性的，这是就其表达需要有活性或有功能的免疫系统存在而言的。如本文中所举的例子，1021Da的癌症标记(分子质量的范围1016-1026Da)可以在用硫酸葡聚糖处理过的小鼠的血清级分中探测到，但在裸鼠的血清级分中却探测不到，这暗示此标记的表达是免疫系统强依赖性的，并且肿瘤发生会降低它的表达或者引起它从细胞表面脱落。
本文中术语“免疫系统依赖性”包括需要T-细胞功能以保证癌症标记被表达；或存在如下迹象，即特定癌症标记正常地在T-细胞上表达或者在肿瘤发生的任一个阶段(优选转移之前)从T-细胞上脱落。
“对比分子种类的分布图”是指将来自癌症样品的血液级分的分子质量谱与来自癌症样品的血液级分的分子质量谱进行比较或比对，并指出其差别。本领域技术人员知道，可以对样品质谱分析的条件进行控制，以保证特定分子种类的峰高度或特定峰的面积与样品中此分子种类的丰度成比例。因此，不严格需要对收集的峰样品进行进一步分析以测定其中此分子种类的丰度，因为可以重叠两个样品的分子质谱来确定峰高度的差别。
尽管这可能是事实，但本发明显然包括步骤测定所鉴定的任一候选分子种类在患有癌症的被试者的血液级分中或健康被试者的血液级分中的丰度；和/或测定在所述血液级分中分子种类的相对丰度。这包括测定此分子种类在产生该血液级分的血液或血清中的丰度或相对丰度。这可以通过用于测定样品中神经节苷脂或寡糖的水平的标准测定方法来进行，例如，通过对峰级分实施免疫化学分析来进行。
优选地，依据本发明此方面的方法还包括对癌症标记作进一步表征，尤其是根据其分子质量来表征。与分子质量已知的标准化合物对照，通过质谱分析可以容易地确定出癌症标记的分子质量(Da)，其中所估计的分子质量的最大误差为±5Da，更优选±4Da，甚至更优选±3Da、再更优选±2Da、进而更优选±1Da。
使用本领域技术人员已知的其它技术，例如通过ESI/MS/MS/QTOF或者通过酶促消化糖基或脂部分进行片段化研究，还可以进一步从结构上表征癌症标记。
本发明人已经鉴定到在患有癌症的被试者的血清中丰度升高的许多癌症标记，见如下(I)分子质量在1439到1459Da之间(平均质量1454Da)的糖脂；(II)分子质量在1587到1597Da之间(平均质量1592Da)的糖脂；(III)分子质量在1616到1626Da之间(平均质量1621Da)的糖脂；(IV)分子质量在1671到1681Da之间(平均质量1676Da)的糖脂；(V)分子质量在1681到1691Da之间(平均质量1686Da)的糖脂。
对于这五个癌症标记，用标准MALDI-TOFMS时，在健康被试者的血清级分中也可以探测到种类(IV)，尽管水平很低；但不能探测到其余的标记。
本发明人还鉴定到在患有癌症的被试者的血清中丰度降低的两个癌症标记，见如下(VI)分子质量在809到819Da之间(平均质量814Da)的糖脂或寡糖；和(VII)分子质量在1016到1026Da之间(平均质量1021Da)的糖脂或寡糖。
对于本领域技术人员来说，显然，按照本发明的这个方面鉴定出的癌症标记可以作为人或动物被试者体内特定类型癌症的指针，因此有助于诊断或探测这类癌症。例如，体外研究显示不同的癌症类型分泌独特的神经节苷脂谱(Kong等，Biochim.Biophys.Acta第1394卷，第43-56页，1998)，这表明本文中描述的质谱分析方法也可以用于辅助诊断患者体内存在的癌症类型。
用质谱分析法鉴定癌症特异性癌症标记所需的唯一条件是，测试足够数量的血液级分以确定该特定的标记只限于特定类型的癌细胞而不属于所有的癌细胞类型。为了利于进行此确定，至少需要两个来自患有不同癌症的被试者的血液级分。优选应用几个血液级分。
因此，本发明的第二方面提供了鉴定指示特定癌症的癌症标记的方法，所述方法包括(I)用质谱分析法分离来自患有癌症的人或动物被试者的血液级分；(II)用质谱分析法分离来自所患癌症不同于(I)中的癌症的人或动物被试者的血液级分；(III)用质谱分析法分离来自健康的人或动物被试者的血液级分；(IV)对比(I)和(II)和(III)得到的分子种类分布图；和(V)鉴定那些与(III)相比时在(I)或(II)中水平改变的分子种类，其中所述水平改变表明这些分子种类是指示特定癌症的癌症标记。
根据这个实施方案，不要求在全部三个血液级分(即，两个样品来自患有癌症的被试者，一个对照样品来自健康被试者)中分子种类的水平都不同。这是因为根据定义指示特定癌症的癌症标记仅在一种癌症中数量发生改变，而在其余样品中均以正常水平存在。与之不同，在来自两种癌症的样品中以相同水平存在的那些分子种类不能指示特定癌症；但，如果与正常细胞中的水平相比它们的量有差别时，则它们是属于本文所述本发明范围中的癌症标记。在任何被分析样品中均以相同水平存在的那些分子种类不是癌症标记。
在一个备择实施方案中，本发明此方面提供了鉴定指示特定癌症的癌症标记的方法，所述方法包括(I)用质谱分析法分离来自人或动物被试者的一组血液级分，其中所述组中的每一个成员都来自患有不同癌症的被试者；(II)用质谱分析法分离来自健康人或动物被试者的血液级分；(III)将(I)中来自所述血液级分组的各成员的分子种类分布图作互相比较，并与来自(II)的血液级分的分子种类分布图作比较；和(IV)从(III)鉴定出与(II)的血液级分的分子种类分布图相比在(I)的所述组的一个成员中水平发生改变的那些分子种类，其中所述水平改变表明这些分子种类是指示特定癌症的癌症标记。
如文中所用，术语“不同癌症”应理解为不同类型的癌症。
与正常细胞相比，癌细胞上任何特定分子种类的水平改变，尤其是癌症标记的水平改变也可用于癌症诊断。因此，本发明的第三方面涉及人或动物被试者中癌症的诊断或探测。
在该方面的一个实施方案中，本发明提供了诊断或探测人或动物被试者体内癌症的方法，包括(I)用质谱分析法分离包含有来自怀疑患有癌症的人或动物被试者的血液级分的测试样品；(II)用质谱分析法分离包含有来自健康被试者的血液级分的对照样品；和(III)对比(I)和(II)中的癌症标记水平，其中与对照样品相比，测试样品中所述癌症标记水平的升高或降低将指示(I)中的被试者患有癌症。
在本文中，术语“怀疑患有癌症的被试者”应理解为仅仅是指接受试验的被试者；而不应以任何方式理解为是指，本发明要求该被试者表现出与特定癌症、肿瘤发生或转移有关的症状，或者，在实施此处所述的本发明诊断试验之前必须使用预先的诊断试验。事实上，由于本发明特别适用于癌症的早期诊断，所以实施本发明时没有预先进行试验或评价的必要；尽管为了证实诊断，可以使用这些附加试验。
所述癌症优选地选自上皮组织恶性肿瘤、淋巴瘤、肉瘤、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、急性淋巴细胞白血病、何杰金氏病、肺小细胞癌、黑素瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和软组织肉瘤，淋巴瘤(几种)、黑素瘤、肉瘤和腺癌。在本发明特定优选的实施方案中，癌症是上皮组织恶性肿瘤，更优选腺癌。
从先前的讨论中显而易见，此处描述的诊断方法并不限于癌症诊断，也可以通过对比不同时间上特定被试者体内一个或多个癌症标记的水平来监测该被试者体内疾病的进展。当患者处于症状减轻阶段时，可将采集自症状减轻阶段早期的样品作为标准用于和后期血液级分比较，以确定被试者的状态，原因是癌症标记水平的任何进一步改变都可指示症状减轻阶段已经结束。相似地，对于经过治疗成功地减轻了症状或治愈的患者、或者没有显示出任何转移的患者，可以将采集自治疗之后不久或转移之前的样品作为标准用于和后期血液级分比较以确定被试者是否出现肿瘤复发或肿瘤转移，因为癌症标记水平的任何改变都可指示复发或转移。
实施本癌症诊断方法时，用于质谱分析的样品制备方法与以上描述的用于鉴定癌症标记的样品制备方法基本相同。
也可以按关于用质谱分析法鉴定癌症标记的前述讨论中描述的方法实施上述方法(III)小段中的癌症标记比较。
优选地，本发明此方面还包括将获取血液级分作为第一步，所述血液级分优选为血清沉淀物形式，和/或优选为经脱盐后的形式，和/或优选为通过疏水作用层析(例如用聚碳基质)被分级分离后的形式。这里显然可考虑根据本领域技术人员已知的步骤获取该血液级分的其他方式。
优选地，依据本发明此方面的方法还包括对癌症标记作进一步表征，尤其是根据其分子质量进行表征。与分子质量已知的标准化合物对照，通过质谱分析可以容易地测定癌症标记的分子质量(Da)，其中所估计的分子质量中的最大误差为±5Da，更优选±4Da，甚至更优选±3Da、再更优选±2Da、甚至再更优选±1Da。
优选地，根据本发明诊断方法进行比较的癌症标记选自(I)分子质量在1439到1459Da之间(平均质量1454Da)的糖脂；(II)分子质量在1587到1597Da之间(平均质量1592Da)的糖脂；
(III)分子质量在1616到1626Da之间(平均质量1621Da)的糖脂；(IV)分子质量在1671到1681Da之间(平均质量1676Da)的糖脂；(V)分子质量在1681到1691Da之间(平均质量1686Da)的糖脂；(VI)分子质量在809到819Da之间(平均质量814Da)的糖脂或寡糖；和(VII)分子质量在1016到1026Da之间(平均质量1021Da)的糖脂或寡糖。
从本文的描述中显然可以看到，一旦依照本发明使用质谱鉴定出癌症标记，即可以应用本领域公知的任何方法来测定被试者体内癌症标记的水平是否发生改变，所述改变水平可以用于诊断癌症。因此，如果在鉴定癌症标记时应用了质谱分析法，那么在实际诊断中就不必应用该方法。
因此，本发明的一个备选实施方案提供了诊断或探测人或动物被试者体内癌症的方法，包括；(I)依据本文所描述的一个或多个实施方案，用质谱分析法鉴定癌症标记；和(II)测定来自怀疑患有癌症的人或动物被试者的血液级分中所述癌症标记的水平，其中将所述血液级分与健康血液级分相比时，所述癌症标记的水平改变将指示被试者患有癌症。
进行鉴定和表征之后，可以用标准方法测定血液级分中癌症标记的水平，所述标准方法包括质谱分析、高压液相色谱(HPLC)-质谱分析、疏水作用层析、大小排阻层析、离子交换层析或本领域公知的其他方法。
例如，可以制备来自质谱分析并包含癌症标记(尤其是神经节苷脂)的峰级分的单克隆抗体，然后将其用于标准免疫测定技术中进行后续癌症诊断。
在实施本发明的这个实施方案时，可以用注射低剂量环磷酰胺(15mg/Kg动物体重)的方法，对小鼠或其他动物进行预处理以降低其抑制性细胞的活性，然后以短时间间隔(例如3-4天或一星期)用不同剂量的脂质体制品(包含神经节苷脂)进行免疫，方法基本如USSN5,817,513中的描述。免疫可以根据标准方法使用皮下、静脉内或腹膜内注射来完成。在免疫期间和之前，收集动物血液血清样品用于监测动物体内产生的抗神经节苷脂(用作抗原)抗体的效价；所述监测可通过任何已知用于探测抗原-抗体反应的免疫分析方法来进行。一般地，以短时间间隔施用大约5-9个累积剂量的脂质体制品将有利于产生抗神经节苷脂的抗体应答。在获得产生抗体的细胞之前大约三天，用脂质体制品对有抗神经节苷脂的血清抗体效价的小鼠进行新的免疫，然后分离抗体产生细胞，优选脾细胞。根据制备单克隆抗体的标准方法，将这些细胞与骨髓瘤细胞融合，以产生杂交瘤，然后用免疫测定方法检测杂交瘤产生的单克隆抗体的效价。优选地使用免疫-酶学分析，其中杂交瘤上清液与包含神经节苷脂抗原的试验样品结合，然后用与单克隆抗体结合的二级酶标抗体探测抗原-抗体结合作用。一旦筛选出想要的杂交瘤并用例如有限稀释的方法对其进行亚克隆后，可以在适当的时期内，在适宜培养基中对得到的单克隆抗体进行体外扩增，之后回收上清液中的此期望抗体。所选用的培养基和充足培养时间是本领域技术人员已知的，或者是容易确定的。
另一生产方法包括把杂交瘤注入动物(例如同基因小鼠)体内。这种情况下，杂交瘤导致非实体瘤的形成，该非实体瘤将在寄主动物的血流和腹膜渗出物(腹水)中产生高浓度的期望抗体。
然后可以用标准免疫测定方法分析怀疑患有癌症的被试者的血液级分中神经节苷脂抗原的存在。通过将试验结果与从健康被试者获得的血液级分进行比较，可以做出适当的诊断。
本发明的第四方面提供了选自下组的分离的癌症标记(I)分子质量在1439到1459Da之间(平均质量1454Da)的糖脂；(II)分子质量在1587到1597Da之间(平均质量1592Da)的糖脂；(III)分子质量在1616到1626Da之间(平均质量1621Da)的糖脂；(IV)分子质量在1671到1681Da之间(平均质量1676Da)的糖脂；(V)分子质量在1681到1691Da之间(平均质量1686Da)的糖脂；(VI)分子质量在809到819Da之间(平均质量814Da)的糖脂或寡糖；和(VII)分子质量在1016到1026Da之间(平均质量1021Da)的糖脂或寡糖。
“分离的”是指基本上不含有同种的(conspecific)神经节苷脂或寡糖，这可以通过例如在文中限定的条件下进行质谱分析来确定。由于MALDI-TOF MS的高分辨率，本领域技术人员将理解，此处作为例子的糖脂或寡糖峰相应于此处定义的分离的分子种类。
优选地，所述分离的癌症标记是免疫系统依赖性的神经节苷脂或寡糖，更优选地，是T-细胞依赖性的神经节苷脂或寡糖。
下面提供的实施例阐明了MALDI-TOF质谱分析可用于探测来源于免疫系统的分子种类、携带癌症的动物体内某些分子种类的消失和同一携带癌症的动物体内新分子种类(可能来源于癌症)的出现。尽管这些初始研究是在动物体内进行的，但其结果被认为可以指示使用来自人类患者的样品时可得到的结果。
实施例1探测血清中与免疫系统相关的分子以前的血清学研究显示，经硫酸葡聚糖处理的小鼠的血清中T-细胞来源的总糖脂升高了大约100倍(Parish等，Cell.Immunol.第33卷，第134-144页，1977)。相反，T-细胞缺陷裸鼠的血清中缺少这些糖脂(Parish等，Immunogenetics第3卷，第129-137页，1976)。
Parish等也报道了，通过硫酸铵/吡啶方法可以从血清中抽提出免疫系统来源的糖脂(Parish等，Immunogenetics第3卷，第455-463页，1976)。
因此，我们用硫酸铵/吡啶抽提正常小鼠、裸鼠、已注射硫酸葡聚糖的正常小鼠的血清样品，并用MALDI-TOFMS分析这些样品，以确定质谱分析是否适用于分析血清中的糖脂和寡糖以及这个方法能否用于鉴定癌症标记。材料与方法1. 血清样品收集来自正常BALB/c小鼠或4天前腹膜内注射1mg 500kDa硫酸葡聚糖的BALB/c小鼠的血液。还收集来自T-细胞缺陷型Swiss裸鼠的血液。收集之后血液在37℃温育30分钟，4℃过夜保存，然后离心收集血清。2. 分级分离血清---硫酸铵/吡啶法用饱和硫酸铵沉淀血清蛋白，之后用吡啶使上清液脱盐，参见以前所发表的方法(Parish等，Immunogenetics第3卷，第455-463页，1976)。用蒸发法去除吡啶，残留物在氯仿/甲醇/水[2/43/55(v/v/v)]中重悬。通过0.2um过滤器过滤悬液，滤液分两次加于预平衡的C18Seppak柱之上(Waters，Taunton，MA)。
收集洗脱物(未被吸附的或流过的级分)并用如下所描述的MALDI-TOF MS进行分析。用2ml甲醇/水溶液，之后用2ml甲醇，之后用2ml氯仿/甲醇，之后用2ml氯仿，依次洗脱柱体。分开收集各级分并用如下所描述的MALDI-TOF MS进行分析。3. MALDI-TOF MS分析为制备用于质谱分析的样品，级分在真空中干燥。将所述流过级分和甲醇/水级分溶于水(200μl)中，用1kDa分子量截断透析膜使之在大量水中透析，然后蒸发使之干燥。所有级分重新溶解于10ml用于载入质谱仪的相关溶剂中。
按上所述制备级分(1μl)并涡旋使之与基质溶液[1μl溶于甲醇中的3.5mg/ml 2-(4-羟基苯基偶氮)苯甲酸(HABA)溶液]。混合物(1μl)加载于有96个上样位置的样品盘上，在室温下干燥。之后把样品盘放入MALDI-TOFMS(TofSpec-2e；Micromass，Manchester，英国)。用氮激光(337nm)进行电离，在线性负离子模式下进行分析。数据用分子质量分布图表示，单位Da；用样品中探测到的最高丰度分子种类的高度的百分数来描述峰的高度。
结果初始研究检验了MALDI-TOF MS能否用于探测免疫系统起源的、和/或它们的表达需要活性T-细胞功能的分子种类。
用MALDI-TOF MS分析时，我们发现，来自硫酸葡聚糖处理的BALB/c小鼠的血清的流过级分(即，未被C18Seppak柱吸附的级分)含有一个分子质量约为1022Da的非常突出的种类(图1)。与之相比，来自未被处理的BALB/c小鼠的流过级分中虽然能探测到这个质量的分子种类，但其水平低得多(图2)，而用MALDI-TOF MS在裸鼠血清中完全不能探测到此分子种类(图3)。
图1到3所显示的数据指出，～1022道尔顿的种类是免疫系统依赖性的。然而，事实是在文中所述情况下这个种类不与C18Seppak柱结合，这暗示它是一种血清寡糖。
实施例2在患有肿瘤的动物的血清中水平降低的癌症标记材料与方法1. 血清样品从携带有高转移性大鼠乳腺癌13762MAT的雌性Fisher 344大鼠(Parish等，Int.J.Cancer第40卷，第511-518页，1987)收集血液。为了在动物体内诱导肿瘤，如前所述(Parish等，Int J.Cancer第40卷，第511-518页，1987)在体外维持肿瘤细胞，用2×105个13762 MAT细胞对大鼠(鼠龄10-13周)进行静脉内注射，这些细胞在含有10％(v/v)FCS的0.6mlRPMI1640培养基中。注射肿瘤细胞后13天收集血液。在此阶段，在大鼠肺中可发现许多小的次级肿瘤，但大鼠没有显示出由肿瘤引起的痛苦征兆。从血液中制备血清，方法如实施例1所述。2. 血清的分级分离用如实施例1所述的硫酸铵/吡啶法对来自患有肿瘤的大鼠的血清进行分级分离。3. MALDI-TOF MS分析如实施例1所述，进行质谱分析，包括样品制备和上样及数据分析。
结果图4A和图4B提供的数据显示来自正常和患有肿瘤的大鼠的血清的C18Seppak流过级分的质谱分析图。
与正常动物相比，患有肿瘤的动物的血清中分子质量约为814Da和1021Da的两个分子种类的水平降低(比较图4A和图4B)。在文中所述情况下这些分子不与C18Seppak柱结合的事实暗示它们是血清寡糖。此1021Da分子种类与以上实施例1中鉴定的与免疫系统有关的1022Da分子种类相同。
实施例3在患有肿瘤的动物的血清中水平升高的癌症标记材料与方法1. 血清样品如实施例2所述，收集正常和患有肿瘤的大鼠的血液。2. 血清的分级分离---氯仿甲醇法将来自患有肿瘤的动物的血清(1ml)在真空中干燥。在每个血清样品中加入氯仿甲醇溶液(2ml)，混合物在4℃温育过夜，其间剧烈搅拌以抽提糖脂。离心混合物并收集氯仿/甲醇相。抽提过程再重复4次，每次抽提在4℃持续2小时。汇合每次抽提的氯仿/甲醇相，在真空中干燥。残留物在氯仿/甲醇/水溶液[2/43/55(v/v/v)]中重悬。悬液通过0.2um过滤器过滤，滤液分两次加于预平衡的C18Seppak柱上。收集洗脱物(未被吸附或流过的级分)。用2ml甲醇/水溶液，之后用2ml甲醇，之后用2ml氯仿/甲醇，之后用2ml氯仿，依次洗脱柱体。分别收集各级分。3. MALDI-TOF MS分析如实施例1所述，进行质谱分析，包括样品制备和上样及数据分析。
结果在来自患有肿瘤的大鼠的血清级分氯仿/甲醇抽提物(图5B)和血清级分甲醇抽提物(图6B)中，鉴定出与肿瘤有关的分子种类。由于这些级分含有结合C18Seppak柱的分子种类，故它们是糖脂，优选是神经节苷脂。在没有携带肿瘤的健康大鼠的血清中，也出现了这些种类，但其水平降低了非常多，或者无法用MALDI-TOF MS检测到(图5A和图6A)。更具体地，患有肿瘤的动物的氯仿/甲醇洗脱物中包含四个显著的种类，通过MALDI-TOF MS测定，它们的分子质量分别约为1454Da、1592Da、1621Da和1686Da；而这些种类在对照血清样品中检测不到(图5A)。事实上，在来自正常大鼠的氯仿/甲醇洗脱物的谱中，观察到大量的背景峰，但没有探测到优势种类(图5A)。这些数据清楚地显示，通过MALDI-TOFMS可以探测到患有癌症的动物的血清中的癌症标记。
患有肿瘤的动物的甲醇洗脱物包含一种占优势的糖脂/神经节苷脂，通过MALDI-TOF MS测定其分子质量约为1676Da(图6B)。这个种类在对照大鼠的血清中也存在(图6A)，但比肿瘤来源样品中的水平低得多。当在两个谱中对比1676Da种类与1185Da种类的峰高度时1676Da种类的水平改变尤其明显(图6A和图6B)。因此，在患有肿瘤的动物的血清中，1676Da种类的水平升高。
可能是，1676Da糖脂正常由增殖细胞分泌，因此，动物中增殖癌细胞的存在导致了这种分子的血清水平升高。
权利要求
1.鉴定癌症标记的方法，包括(I)用质谱分析法分离来自患有癌症的人或动物被试者的血液级分；(II)用质谱分析法分离来自健康的人或动物被试者的血液级分；(III)对比(I)和(II)得到的分子种类分布图，并鉴定那些与(II)相比时在(I)中有改变水平的分子种类，其中所述分子种类的升高或降低的水平表明这些分子种类是癌症标记。
2.权利要求1的方法，其中质谱分析法包括基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱分析法(MALDI-TOF MS)。
3.权利要求1的方法，其中质谱分析法包括电喷射质谱分析法。
4.权利要求1的方法，其中癌症标记是糖脂。
5.权利要求4的方法，其中糖脂是神经节苷脂。
6.权利要求1的方法，其中癌症标记是寡糖。
7.权利要求1的方法，其中癌症选自人的卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、急性淋巴细胞白血病、何杰金氏病、肺小细胞癌、黑素瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和软组织肉瘤。
8.权利要求1的方法，其中癌症选自非人动物的淋巴瘤(几种)、黑素瘤、肉瘤和上皮组织恶性肿瘤。
9.权利要求7的方法，其中上皮组织恶性肿瘤是腺癌。
10.权利要求1的方法，其中血液级分是血清级分。
11.权利要求1的方法，还包括第一步从患有癌症的被试者获得血液级分。
12.权利要求1的方法，还包括第一步从健康被试者获得血液级分。
13.权利要求1的方法，还包括测定患有癌症的被试者的血液级分中或健康被试者的血液级分中癌症标记的丰度，或者测定所述血液级分中某一分子种类的相对丰度。
14.鉴定指示特定癌症的癌症标记的方法，所述方法包括(I)用质谱分析法分离来自患有癌症的人或动物被试者的血液级分；(II)用质谱分析法分离来自所患癌症不同于(I)的癌症的人或动物被试者的血液级分；(III)用质谱分析法分离来自健康的人或动物被试者的血液级分；和(IV)对比在(I)和(II)和(III)得到的分子种类分布图，并鉴定那些与(III)相比时在(I)或(II)中有改变水平的分子种类，其中所述改变水平表明这些分子种类是指示特定癌症的癌症标记。
15.权利要求14的方法，其中质谱分析法包括基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱分析法(MALDI-TOF MS)。
16.权利要求14的方法，其中质谱分析法包括电喷射质谱分析法。
17.权利要求14的方法，其中癌症标记是糖脂。
18.权利要求17的方法，其中糖脂是神经节苷脂。
19.权利要求14的方法，其中癌症标记是寡糖。
20.权利要求14的方法，其中癌症标记指示选自下组的特定癌症人的卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、急性淋巴细胞白血病、何杰金氏病、肺小细胞癌、黑素瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和软组织肉瘤。
21.权利要求14的方法，其中癌症标记指示选自下组的特定癌症非人动物的淋巴瘤(几种)、黑素瘤、肉瘤和上皮组织恶性肿瘤。
22.权利要求21的方法，其中上皮组织恶性肿瘤是腺癌。
23.权利要求14的方法，其中血液级分是血清级分。
24.权利要求14的方法，还包括第一步从任一个或多个所述被试者获得血液级分。
25.权利要求14的方法，还包括测定癌症标记在任一个或多个所述血液级分中的丰度或相对丰度。
26.鉴定指示特定癌症的癌症标记的方法，所述方法包括(I)用质谱分析法分离来自人或动物被试者的一组血液级分，其中所述组中的每一个成员都来自患有不同癌症的被试者；(II)用质谱分析法分离来自健康人或动物被试者的血液级分；(III)将(I)中来自所述血液级分组的各成员的分子种类分布图进行互相比较，并与来自(II)的血液级分的分子种类分布图进行比较；(IV)从(III)鉴定出与(II)的血液级分的分布图相比时在(I)的所述组的一个成员中有改变水平的分子种类，其中所述改变水平表明该分子种类是指示特定癌症的癌症标记。
27.权利要求26的方法，其中质谱分析法包括基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱分析法(MALDI-TOF MS)。
28.权利要求26的方法，其中质谱分析法包括电喷射质谱分析法。
29.权利要求26的方法，其中癌症标记是糖脂。
30.权利要求29的方法，其中糖脂是神经节苷脂。
31.权利要求26的方法，其中癌症标记是寡糖。
32.权利要求26的方法，其中癌症标记指示选自下组的特定癌症人的卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、急性淋巴细胞白血病、何杰金氏病、肺小细胞癌、黑素瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和软组织肉瘤。
33.权利要求26的方法，其中癌症标记指示选自下组的特定癌症非人动物的淋巴瘤(几种)、黑素瘤、肉瘤和上皮组织恶性肿瘤。
34.权利要求33的方法，其中上皮组织恶性肿瘤是腺癌。
35.权利要求26的方法，其中血液级分是血清级分。
36.权利要求26的方法，还包括第一步从任一个或多个被试者获得血液级分。
37.权利要求26的方法，还包括测定癌症标记在任一个或多个所述血液级分中的丰度或相对丰度。
38.诊断或探测人或动物被试者体内的癌症的方法，包括(I)用质谱分析法分离包含来自怀疑患有癌症的人或动物被试者的血液级分的测试样品；(II)用质谱分析法分离包含来自健康被试者的血液级分的对照样品；和(III)对比从(I)和(II)得到的癌症标记水平，其中与对照样品相比时测试样品中所述癌症标记水平的升高或降低指示(I)中的被试者患有癌症。
39.权利要求38的方法，其中质谱分析法包括基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱分析方法(MALDI-TOF MS)。
40.权利要求38的方法，其中质谱分析法包括电喷射质谱分析法。
41.权利要求38的方法，其中癌症标记是糖脂。
42.权利要求41的方法，其中糖脂是神经节苷脂。
43.根据权利要求41或42的方法，其中通过质谱分析法测定，所述糖脂具有选自下组的分子质量(I)在1439到1459Da之间的分子质量(平均质量1454Da)；(II)在1587到1597Da之间的分子质量(平均质量1592Da)；(III)在1616到1626Da之间的分子质量(平均质量1621Da)；(IV)在1671到1681Da之间的分子质量(平均质量1676Da)；和(V)在1681到1691Da之间的分子质量(平均质量1686Da)。
44.权利要求38的方法，其中癌症标记是寡糖。
45.根据权利要求44的方法，其中通过质谱分析法测定，所述寡糖具有选自下组的分子质量(I)在809到819Da之间的分子质量(平均质量814Da)；和(II)在1016到1026Da之间的分子质量(平均质量1021Da)。
46.权利要求38的方法，其中怀疑患有癌症的被试者和健康被试者是人。
47.权利要求46的方法，其中癌症选自卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、急性淋巴细胞白血病、何杰金氏病、肺小细胞癌、黑素瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和软组织肉瘤。
48.权利要求38的方法，其中怀疑患有癌症的被试者和健康被试者是非人动物。
49.权利要求48的方法，其中癌症选自淋巴瘤(几种)、黑素瘤、肉瘤和上皮组织恶性肿瘤。
50.权利要求49的方法，其中上皮组织恶生肿瘤是腺癌。
51.权利要求38的方法，其中血液级分是血清级分。
52.权利要求38的方法，还包括第一步从任一个或多个被试者获得血液级分。
53.权利要求38的方法，还包括测定癌症标记在任一或多个所述血液级分中的丰度或相对丰度。
54.权利要求38的方法，其用于监测人或动物被试者体内的癌症进展。
55.诊断或探测人或动物被试者体内的癌症的方法，包括(I)实施权利要求1或14的方法以鉴定癌症标记；和(II)测定在怀疑患有癌症的人或动物被试者的血液级分中所述癌症标记的水平，其中，与健康血液级分相比，所述癌症标记水平的改变指示此被试者患有癌症。
56.权利要求55的方法，其中通过选自下组的方法测定血液级分中的癌症标记水平质谱分析、疏水作用层析、尺寸排阻层析、离子交换层析和免疫测定法。
57.选自下组的分离的癌症标记(I)分子质量在1439到1459Da之间(平均质量1454Da)的糖脂；(II)分子质量在1587到1597Da之间(平均质量1592Da)的糖脂；(III)分子质量在1616到1626Da之间(平均质量1621Da)的糖脂；(IV)分子质量在1671到1681Da之间(平均质量1676Da)的糖脂；(V)分子质量在1681到1691Da之间(平均质量1686Da)的糖脂；(VI)分子质量在809到819Da之间(平均质量814Da)的寡糖；(VIII)分子质量在1016到1026Da之间(平均质量1021Da)的寡糖。
58.权利要求57的方法，其中癌症标记是上皮组织恶性肿瘤的标记。
59.鉴定上皮组织恶性肿瘤的癌症标记的方法，包括；(IV)通过基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱分析法(MALDI-TOF MS)分离来自患有上皮组织恶性肿瘤的被试者的血液级分；(V)通过MALDI-TOFMS分离来自健康被试者的血液级分；(VI)对比(I)和(II)得到的分子种类分布图，并鉴定与(II)相比时在(I)中有改变水平的那些分子种类，其中，所述分子种类的升高或降低的水平指示此分子种类是上皮组织恶性肿瘤的癌症标记。
60.诊断或探测被试者体内上皮组织恶性肿瘤的方法，包括(I)通过基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱分析法(MALDI-TOF MS)分离包含有来自怀疑患有癌症的被试者的血液级分的测试样品；(II)通过MALDI-TOF MS分离包含有来自健康被试者的血液级分的对照样品；和(III)对比(I)和(II)的癌症标记水平，其中，与对照样品相比测试样品中所述癌症标记水平的升高或降低指示(I)中的被试者患有癌症，其中该癌症标记选自(a)分子质量在1439到1459Da之间(平均质量1454Da)的糖脂；(b)分子质量在1587到1597Da之间(平均质量1592Da)的糖脂；(c)分子质量在1616到1626Da之间(平均质量1621Da)的糖脂；(d)分子质量在1671到1681Da之间(平均质量1676Da)的糖脂；(e)分子质量在1681到1691Da之间(平均质量1686Da)的糖脂；(f)分子质量在809到819Da之间(平均质量814Da)的寡糖；(g)分子质量在1016到1026Da之间(平均质量1021Da)的寡糖。
全文摘要
本发明提供基于质谱分析法鉴定血清中的癌症标记的方法；并提供在诊断人和非人被试者体内癌症时所述癌症标记的用途。本发明还提供分离的癌症标记。
文档编号G01N27/62GK1449496SQ01814937
公开日2003年10月15日 申请日期2001年7月19日 优先权日2000年7月19日
发明者C·R·帕里什, V·M·卡瓦尔达－克拉内 申请人:比奥特龙有限公司