专利名称：基于多癌症侵袭相关机制的生物标记的制作方法
基于多癌症侵袭相关机制的生物标记相关申请的交叉引用本申请要求2010年5月28日提交的美国临时专利申请第61/349，684号和2010年4月13日提交的美国临时专利申请第61/323，818号的优先权，其通过引用全文纳入本文。1.引言本发明涉及以下发现:特定差异性表达基因与癌侵袭相关，如原发性肿瘤的某些细胞在转移的初始阶段中侵入相邻结缔组织。此活性的根本生物机制在癌症发展进程中发生并标志获得与转移癌相关的运动性和侵袭性。因此，鉴定与该机制相关的生物标记如本文公开的特定差异性表达基因，能用于诊断具体癌症并进行分期，用于监控癌症发展/消退，用于开发疗法，和用于预测某些治疗策略的适宜性。2.
背景技术：
据推测癌侵袭与改变的蛋白质水解环境相关(Kessenbrock K, Cell2010; 141:52-67)且可包括活化成纤维细胞的出现。肿瘤的“促纤维形成”间质中存在活化成纤维细胞称为“癌相关成纤维细胞”(CAF)，似乎是癌侵袭的根本生物机制的一部分。如本申请所概括，看来特异性涉及此转移相关纤维成形性反应的特定CAF亚组在本文中称为“转移相关成纤维细胞”(MAF)。因此，与所述MAF相关的对应基因表达特征和生物机制在本文中分别称为“MAF特征”和“MAF机制”。目前对鉴定癌侵袭和随后转移的根本生物机制有极大兴趣，本发明即针对此问题。3.
发明内容
本发明涉及构成转移相关成纤维细胞(“MAF”)特征的生物标记和其在诊断多种癌症并进行分期中的应用。这至少部分基于以下发现:鉴定某些基因的差异表达指示有高度特异性的多种癌症的诊断和/或分期。因此，在多个实施方式中，本发明提供诊断、诊断试剂盒的方法以及包括评价对象生物标记状态的治疗方法。本发明进一步部分基于以下发现:由于某些基因的差异表达能就侵袭潜力获得起标记作用，这类表达概况可用于筛选能抑制转移潜力获得的治疗。因此，在多个实施方式中，本发明提供就抗侵袭和/或抗转移特性筛选治疗以及筛选试剂盒的方法。在某些实施方式中，本发明针对诊断对象中侵袭癌的方法，所述方法包括测定对象样品中COLlIAl基因产物相对于正常对象的表达水平，其中COLlIAl基因产物过表达指示所述对象有侵入性癌。在某些实施方式中，本发明针对诊断对象中侵入性癌的方法，所述方法包括测定对象样品中以下基因产物相对于正常对象的表达水平:至少一种选自C0L11A1、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl 和 C0L1A2 的基因产物，以及至少一种选自 THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMPl1、POSTN、ADAMl2, LOX、FNl和SNAI2的基因产物，其中所述基因产物的过表达指示所述对象有侵入性癌。在某些实施方式中，表达水平由包含加工样品从而裂解该样品中细胞的方法测定。在某些这类实施方式中， 所述方法包括至少部分纯化细胞基因产物并使所述蛋白暴露于检测剂的额外步骤。在某些这类实施方式中，所述方法包括至少部分纯化细胞核酸并使所述核酸暴露于检测剂的额外步骤。在某些这类实施方式中，所述方法包括测定SNAIl表达水平的额外步骤，其中SNAIl未过表达而其他基因产物过表达的测定结果指示所述对象有侵入性癌。在某些实施方式中，本发明针对治疗对象的方法，所述方法包括进行鉴定MAF特征的上述诊断方法，建议患者进行影像学方法。在某些这类实施方式中，鉴定MAF特征后建议患者不进行新辅助治疗。在某些这类实施方式中，鉴定MAF特征后建议患者改变其目前治疗方案。在某些实施方式中，本发明针对鉴定抑制对象中癌侵袭的试剂的方法，所述方法包括使测试剂接触表达成纤维细胞特征相关转移的癌细胞，其中如果所述测试剂降低基因在该特征中的过表达，则该测试剂可用作抑制癌侵袭的治疗剂。在某些实施方式中，所述方法使用的转移相关成纤维细胞特征包括至少一种选自以下基因产物的过表达:C0L11A1、COLIOAKC0L5AKC0L5A2,COLIAI 和 C0L1A2 的基因产物，以及至少一种选自 THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、P0STN、ADAM12、L0X、FN1 和 SNAI2 的基因产物。在某些实施方式中，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒包括:(a)能与转移相关成纤维细胞特征基因产物特异性相互作用的标记报道分子；(b)对照或校准试剂，和(C)描述使用试剂盒方式的说明书。在某些实施方式中，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒包括:(a)包含与转移相关成纤维细胞特征抗原特异性相互作用的抗体的偶联物，所述抗原结合于能产生可检测信号的信号生成化合物；(b)对照或校准试剂，和(C)描述使用试剂盒方式的说明书。在某些这类实施方式中，本发明针对包含以下的试剂盒:转移相关成纤维细胞特征抗原特异性抗体，其中由所述抗体结合的转移相关成纤维细胞特征抗原包括或衍生自一种或多种下列基因编码的蛋白:C0L11A1、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAU C0L1A2、THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMPl1、POSTN、ADAM12、LOX、FNl 和 SNAI2。在某些实施方式中，本发明试剂盒，所述试剂盒包括:(a)能与转移相关成纤维细胞特征核酸杂交的核酸；(b)对照或校准试剂，和(C)描述使用试剂盒方式的说明书。在某些这类实施方式中，所述试剂盒包括:(a)核酸序列，所述序列包括:(i)与转移相关成纤维细胞特征核酸特异性杂交的靶标特异性序列，和(ii)检测标记；(b)引物核酸序列；(c)指示扩增的核酸指示物；和(d)描述使用试剂盒方式的说明书。在某些这类实施方式中，本发明涉及的试剂盒包括与转移相关成纤维细胞特征核酸特异性杂交的核酸，所述核酸包括或衍生自下列基因之一:C0L11A1、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl、C0L1A2、THBS2、INHBA、VCAN, FAP, MMPl K POSTN, ADAMl2, LOX, FNl 和 SNAI2。4.附图简要说明
图1:描述本发明具体、非限制性实施方式的一般步骤。图2:使用表型分期阈值IIIc期转化就TCGA卵巢癌数据集中基因C0L11A1评价EVA指标。图3:描述EVA算法的低复杂度说明。图4:实施例所述机械无偏性(仅取决于表型)算法的伪码。5.发明详述 5.1MAF特征的鉴定
一个关于严重乳头状卵巢癌的研究(Bignotti E, Am J Obstet Gynecol2007; 196:245 el-11)比较了 14个网膜原发性肿瘤样品和17个网膜转移性肿瘤样品的基因表达概况，鉴定156个差异表达的基因。为研究这些基因在独立的丰富数据集中的显著性，仅使用这156个基因对癌症基因组图谱(TCGA)基因表达数据集进行分层聚类，所述数据集由含精确分期信息的377个卵巢癌样品组成。得到的热图显示94个样品中约100个高度过表达基因的显著“红色方块”，来自IIIb和以下分期肿瘤的41个样品中没有一个在所述94个“红色方块”样品内(P=4X 10-6)，与这些基因的协调过表达一致，指示肿瘤发展到至少IIIc期。为测定此反应是否在其他癌症中由基因表现，开发了一种以无偏方式鉴定与具体表型(如转变到特定分期)相关的协调过表达基因的计算技术。结果一致地“再发现”过表达基因的相同“核心”特征。发现此现象在多种癌症中出现，所述癌症各自有其潜在涉及额外基因的特征，但共有核心特征。在某些实施方式中，本发明涉及在基因具有其极端(在大部分情况下最大)值时(但不是没有其他)通过关注与二元(“低期”相比“高期”)表型相关的基因簇而鉴定MAF特征(低/高分期的具体阈值取决于具体癌症类型)，包括首先开发基因和表型间关联的特殊量度，称为“极值关联”(EVA)。简言之，EVA指标是具有最高基因表达值的所有样品子集中偏向性部分的最小P值。换言之，假设总共有M个样品，其中N个是“低期”且M-N个是“高期”，选择有最闻基因表达值的m个样品。假定基因表达值与表型不相关，所选m个样品中有最多η个“低期”样品的概率由累积超几何概率h(x彡n;M，N，m)给出。随后，EVA指标等于-1ogltl (所有可能的η值中这些概率的最小值)。例如，假设就总共300个样品而言，有250个高期样品和50个低期样品。此外，假设有特定基因最高值的100个样品包含99个高期样品和I个低期样品。在此情况中，可用MATLAB函数hypercdf (1，300, 50, 100) =5 X IO^9评估h (X彡I; 300，50，100)，得到该基因的EVA指标为至少-1og10 (5 X 10_9) =8.3，例如若第101个样品还是高期，则所述基因的EVA指标会甚至更高。应注意一旦达到最高值，剩余样品的分选排列不相关，反映了仅极值与表型相关的假设。图2显示C0L11A1基因的累积超几何概率值，使用TCGA卵巢癌数据集和IIIb和IIIc之间的分期阈值:m=133时产生最大值(8.31)。事实上，有最高C0L11A1表达的所有133个样品处于IIIc或IV期。然后开发了机械无偏性(仅取决于表型)算法，就多种标记“高期”或“低期”的样品给定基因表达数据集时，所述算法可选择仅在高期样品中协调过表达的基因。首先根据EVA指标标准选择排列最高的前100个基因。仅使用此基因集，用间隙统计进行k-均值聚类(Tibshirani R, J R Statist Soc B 63:411-423)。此步骤中，如果基因确实协调过表达，其会在热图上良好排列。这导致选择与高/低期表型最相关的类群所属样品-此集合称为“基于EVA的样品”。该类群中的几乎所有样品超过MAF分期阈值，仅很少的例外可能是由于误诊。其次，定义“干净”MAF表型，对比(a) “基于EVA”和“高期”的样品与(b) “非基于EVA”和“低期”的样品。如果样 品数目足够大，此“干净”表型提供可鉴定与观察到的侵袭现象和/或转移相关协调过表达最相关的基因的最灵敏方法。然后用异方差t检验通过“干净”表型来排列基因并计算其多重检验校正P值，选择邦弗伦尼校正(Bonferronicorrection)后P〈10_3的基因。最后，发现这些选定基因集在所有癌表达数据集上的交叉并根据倍数变化对其进行排列。
对于有η个样品和m个探针组的数据集，EVA算法计算η X m累积超几何分布概率。这可能在计算上相当密集，因此设计了低复杂度实现算法以随着EVA算法推进而动态“建立”各探针组的累积超几何分布，如下所详述。给定有高期样品和b_低期样品的数据集，构建了对应所有可能样品子集的超几何概率的(a+1) X (b+1)表。然后，对于各探针组，根据所述探针组的表达值来分选样品。此排序广生从左下角到右上角穿过表格的路径，就各样品而目向上或向右移动。此路径的每一步骤中，遇到所观察数目或更多高期样品的累积概率计算是通过对当前细胞沿对角线向下和向右的入口求和，包括当前细胞本身。图3所示的直观示例最佳展示了所述算法，其中数据集共有3个低期样品和5个高期样品。各探针组产生穿过此表格的路径，示例路径在此以灰色显示。I对应高期样品且O对应低期样品，此示例探针集产生路径111001011。就对应于子路径111001的蓝色细胞而言，遇到这许多或更多高期样品的概率通过对所述蓝色细胞沿对角线向下和向右的3个概率求和(包括其本身)来计算。此情况中，所述概率相当高(82.2%)。对沿着路径的每一步计算此累积概率，这些的最小值是EVA算法的输出。在某些实施方式中，本发明针对与癌侵袭和/或MAF出现相关的生物标记特征。本文所用的术语侵袭和侵袭性涉及转移的初始阶段，其中特定癌症的发生浸润局部组织且该癌症开始扩散。在本发明的某些实施方式中，侵袭和/或MAF出现的生物标记特征包括COLlIAl的过表达。在某些实施方式中，侵袭和/或MAF出现的生物标记特征包括COLlIAl和INHBA的过表达。在某些实施方式中，侵袭和/或MAF出现的生物标记特征包括COLlIAl和THBS2的过表达。在某些实施方式中，侵袭和/或MAF出现的生物标记特征包括C0L11A1、INHBA和THBS2的过表达。
在某些实施方式中，侵袭和/或MAF出现的生物标记特征包括过表达至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种、或至少所有六种下列蛋白:C0L11A1 (优选)，C0L10A1, C0L5A1, C0L5A2, COLlAl 和 C0L1A2。在某些实施方式中，侵袭和/或MAF出现的生物标记特征包括过表达至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种、或至少所有六种下列蛋白:C0L11A1 (优选)，C0L10A1, C0L5A1, C0L5A2, COLlAl和C0L1A2 ；以及下列一种或更多或者两种或更多或者三种或更多:THBS2 (优选)，INHBA (优选)，VCAN, FAP, MMPl 1，POSTN, ADAMl2, LOX, FNl 和SNAI2。在某些实施方式中，侵袭和/或MAF出现的生物标记特征包括过表达至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种、或至少六种下列蛋白:C0L11A1 (优选)，C0L10A1, C0L5A1, C0L5A2, COLlAl和C0L1A2 ；以及下列一种或更多或者两种或更多或者三种或更多:THBS2 (优选)，INHBA (优选)，VCAN, FAP, MMPl 1，POSTN, ADAMl2, LOX, FNl, SNA12 ;以及SNAIl表达未显著改变时(如在某些非限制性实施方式中，SNAIl基因甲基化)。在本发明的一个特定非限制性实施方式中，C0L11A1、THBS2和INHBA但不是SNAIl的过表达指示侵袭进展。在某些实施方式中，侵袭和/或MAF出现的生物标记特征包括过表达COLlIAl、INHBA和THBS2中的一种、两种、或所有三种以及差异性表达一种或多种选自下组的miRNA:hsa-miR-22;hsa-miR-514-l/hsa-miR-514_2|hsa-miR-514-3;hsa-miR-152;hsa-miR-508;hsa-miR-509-l/hsa-miR-509-2/hsa-miR-509_3;hsa-miR-507;hsa-miR-509-l/hsa_miR-509-2;hsa-miR-506;hsa-miR-509-3;hsa-miR-214;hsa-miR-510;hsa-miR-199a-l/hsa_miR199a_2;hsa-miR-21;hsa_miR-513c;和 hsa_miR-199b。在某些实施方式中，侵袭和/或MAF出现的生物标记特征包括过表达COLlIAl、INHBA和THBS2的一种、两种、或所有三种以及差异性甲基化一种或多种选自下组的基因:PRAME;SNAII;KRT7;RASSF5;FLJ14816;PPL;CXCR6;SLC12A8;NFATC2;H0M-TES-103;ZNF556;OCIAD2;APS;MGC9712;SLC1A2;HAK;C3orfl8;GMPR;和 C0R06。不受理论约束，认为排序靠前的基因提示MAF特征的一个特性是基于激活素信号传导的成纤维细胞活化。认为所述信号传导产生某些改变的蛋白质水解形式，最终使得环境富集胶原 COLlIAl、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLIAUP / 或 C0L1A2。MAF 特征中存在的其他相关基因是金属蛋·白酶-3 (TIMP3)、溶基质素-3 (MMPll)和钙粘附蛋白_11 (CDHll)的组织抑制剂。尽管包括miRNA和甲基化基因在内的各MAF特征分子如SNAIl能用作潜在治疗靶标，认为激活素信号传导在MAF机制中起作用的情况表明卵泡抑素(激活素结合蛋白)能用作侵袭和/或转移抑制剂，这正是近期研究(Talmadge JE1Clin Cancer Res2008; 14:624-6;Ogino H, Clin Cancer Res 2008; 14:660-7)就单独癌症类型方面显示的内容。另一种方法是使用间充质-上皮转化(MET)介质如基因TCF21，已知TCF21在数个单独癌症类型中沉默。由于数种原因尚未发现MAF特征为多癌症侵袭和/或转移相关特征，尽管已发表了数个与特定癌症相关的其他部分重叠特征。首先，这些其他特征各缺乏精确表型定义，认识到所述特征仅在超过具体分期的肿瘤亚组中存在。确实，如果卵巢癌的表型阈值设为II期-1II期或III期-1V期，而不是IIIb期-1IlC期，所述特征会不明显。甚至可能(见下)错误选择表型阈值会产生反向结果。第二，各癌症类型在MAF特征以外具有其自身其他特征。例如，卵巢癌中伴随着基因C0LEC11、PEG3和TSPAN8的大幅下调，而在其他癌症中不是如此。实际上，本发明的一个实施方式是鉴定共同的多癌症“核心”特征，从中能更容易鉴定通用侵袭和/或转移相关生物机制。第三，也是最重要的一点，MAF特征经间充质-上皮转化(MET)或通过MAF细胞凋亡而潜在可逆。例如(Ellsworth RE, Clin Exp Metastasis2009;26:205-13),比较转移性淋巴结样品与其对应原发性乳腺癌样品，发现C0L11A1在原发性肿瘤样品中的表达高许多。这种反向结果可能阻碍数据分析。MAF特征的潜在可逆性强调了所述特征是动态过程的一部分且也许所有侵入性和/或转移性样品在某一时刻但仅暂时在此，这解释了为何只在其子集中观察到。已认识到“尽管难以证明，所有癌细胞类型必需经历部分或完整EMT以变为运动和侵入型是合理的(Weinberg RA.纽约加兰科学出版社(New York:Garland Science) ; 2007)第 600 页”。这特别令人兴奋，因为靶向MAF机制的任何抑制侵袭和/或转移的治疗干预广泛应用于跨不同癌症类型的转移前肿瘤，其直到本公开前还是未实现的目标。因此，通过计算分析公开可用的生物信息，系统生物学揭示了多癌症侵袭相关基因表达特征的核心，且多癌症转移相关特征可产生临床应用，如抑制侵袭和/或转移的治疗。在不久的将来，有大量额外信息可用，包括下一代测序、用于多种癌症的miRNA和甲基化信息，可在此工作上建立其他令人振奋的计算研究并阐明相应复杂生物过程的细节。5.2使用MAF特征的试验本文所述发现的直接临床应用涉及开发高特异性侵袭和/或转移感测生物标记试验方法。在某些实施方式中，所述试验方法包括但不限于:核酸扩增试验；核酸杂交试验；和蛋白检测试验。在某些实施方式中，本发明的试验包括这些检测技术的组合，例如但不限于:使用扩增和杂交以检测基因在核酸水平表达变化的试验，如过表达或表达降低；检测基因在蛋白水平表达变化的免疫试验；以及包含基于核酸的检测步骤和基于蛋白的检测步骤的组合试验。本文所用的“过表达”指基因产物表达相对于正常或对照值增加，在非限制性实施方式中，增加至少约30%或至少约40%或至少约50%、或至少约100%、或至少约200%、或至少约300%、或至少约400%、或至少约500%、或至少约1000%。本文所用的“表达降低”指基因产物表达相对于正常或对照值减少，在非限制性实施方式中，减少至少约30%或至少约40%或至少约50%、至少约90%，或减少到用常规方法基本无法检测的表达水平。本文所用的“基因产物”指基因转录和/或翻译的任何产物。因此，基因产物包括但不限于mRNA前体、mRNA和蛋白。在某些实施方式中，本发明提供组合物和方法以检测指示样品中所有或部分MAF特征的基因表达，使用基于核酸杂交和/或扩展的试验。在非限制性实施方式中，上述MAF特征内的基因/蛋白构成给定试验中评估的至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%的基因/蛋白。在某些实施方式中，本发明提供用核酸杂交试验检测指示样品中所有或部分MAF特征的基因表达的组合物和方法，其中来自所述样品或其扩增产物的核酸与一种或多种核酸探针序列的阵列杂交。在某些实施方式中，“阵列”包括支持物，优选固体，一种或多种核酸探针结合支持物。优选的阵列通常包括多种在不同已知位置偶联底物表面的不同核酸探针。这些阵列也描述为“微阵列”或“芯片”，在本领域中已有普遍描述，例如美国专利号5，143，854，5，445，934，5，744，305，5，677，195，5，800，992，6，040，193，5，424，186 和 Fodor等，Science, 251:767-777 (1991)。阵列一般可用多种技术生成，如机械合成方法或组合光刻法与固相合成法的光引导合成方法。用机械合成方法合成这些阵列的技术描述于例如美国专利号5，384，261和6，040，193，所述专利通过引用全文纳入本文以用于所有目的。尽管优选平面阵列，但阵列可在几乎任何表面或甚至多重表面上制造。阵列可以是珠、凝胶、聚合物表面、纤维如光纤、玻璃或任何其他合适基底上的核酸。参见美国专利号5，770，358，5，789，162，5，708，153，6，040，193 和 5，800，992。在某些实施方式中，本发明的阵列可以某种方式包装，从而允许诊断、预后、和/或预测应用或者可以是包括一切的装置；例如美国专利号5，856，174和5，922，591。在某些实施方式中，本发明的杂交试验包括引物延伸步骤。从固体支持物延伸引物的方法公开于例如美国专利号5，54 7，839和6，770，751。另外，用引物延伸对样品进行基因分型的方法公开于例如美国专利号5，888，819和5，981，176。
在某些实施方式中，检测样品中所有或部分MAF特征的方法包括基于核酸扩增的试验。在某些实施方式中，所述试验包括但不限于:实时PCR(例如参见 Mackay, Clin.Microbiol.1nfect.10(3):190-212, 2004)，链置换扩增(SDA)(例如参见 Jolley 和 Nasir, Comb.Chem.High Throughput Screen (《高通量筛选》).6 (3): 235-44, 2003)，再生式序列复制反应(3SR)(例如参见Mueller等,Histochem.Cell.Biol.108(4-5):431-7, 1997)，连接酶链式反应(LCR)(例如参见 Laffler 等，Ann.Biol.Clin.(Paris).51 (9):821-6, 1993)，转录介导的扩增(TMA)(例如参见 Prince 等，J.Viral Hepat.11(3): 236-42，2004)，或基于核酸序列的扩增(NASBA)(例如参见 Romano等，Clin.Lab.Med.16(1):89-103, 1996)。在本发明的某些实施方式中，基于PCR的试验例如但不限于实时PCR，用于检测测试样品中MAF特征的存在。在某些实施方式中，MAF特征特异性PCR引物组用于扩增MAF特征相关RNA和/或DNA靶标。这些靶标的信号能用例如荧光标记探针产生。没有这些靶序列时，在某些实施方式中，荧光团的荧光发射可通过同样操作性连接探针核酸的淬灭分子来消除。然而，存在靶序列时，探针在引物延伸步骤中结合模板链且催化引物延伸步骤的聚合酶的核酸酶活性使荧光团释放并生成检测信号，因为荧光团不再连接淬灭分子。(综述参见 Bustin, J.Mol.Endocrinol 25，169 - 193 (2000))。选择荧光团(例如 FAM,TET 或 Cy5)和对应淬灭分子(例如BHQl或BHQ2)在本领域技术范围内且特异性标记试剂盒市售可得。在某些实施方式中，本发明通过检测感兴趣基因编码的一种或多种蛋白浓度变化，提供检测指示样品中所有或部分MAF特征的基因表达的组合物和方法。在某些实施方式中，本发明涉及通过检测感兴趣基因编码的蛋白浓度变化，使用免疫试验检测基因表达调节。本领域已知多种技术用于经免疫试验检测蛋白表达变化。(参见The Immunoassay Handbook (《免疫测定手册》)，第2版,David Wild编,伦敦自然出版集团(Nature Publis hing Group) 2001。)在某些这类免疫试验中，能与感兴趣蛋白如MAF特征的个体成员特异性相互反应的抗体试剂共价或非共价结合固相。共价结合的连接剂已知且可以是固相一部分或在包被前对其衍生。免疫试验所用固相的示例是多孔和非多孔材料、胶乳粒子、磁性粒子、微粒、条、珠、膜、微量滴定孔和塑料管。固相材料的选择和标记抗体试剂的方法根据所需试验形式运行特性测定。对于一些免疫试验，不需要标记，然而在某些实施方式中，免疫试验所用的抗体试剂结合信号生成化合物或“标记”。此信号生成化合物或“标记”本身可检测或可与一种或多种其他化合物反应以产生可检测产物(也参见美国专利号6，395，472B1)。这种信号生成化合物的示例包括发色团、放射性同位素(例如1251、1311、32P、3H、35S和14C)、荧光化合物(例如荧光素和若丹明)、化学发光化合物、粒子(可见或荧光)、核酸、络合剂、或催化剂如酶(例如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β -半乳糖苷酶和核糖核酸酶)。在酶应用的情况中，添加显色、突光或产生能量(lumo-genic)底物可生成检测信号。其他检测系统如时间分辨荧光、内反射荧光、扩增(例如聚合酶链式反应)和拉曼光谱也用于本发明方法。根据本文所述试验方法之一来自待测试对象的“样品”可以是至少一部分组织、至少一部分肿瘤、细胞、细胞集合、或液体(例如血液、脑脊液、尿液、表达的前列腺液、腹膜液、胸膜积液、腹膜液等)。在某些实施方式中，与本发明试验相关使用的样品将通过活检获得。通过开放或经皮技术完成活检。开放性活检用手术刀常规进行并可包括移除完整肿瘤块(切除活检)或部分肿瘤块(切开活检)。相反，经皮活检通常用类似针的设备摸索或由成像装置辅助进行，且可以是细针抽吸(FNA)或核心活检。FNA活检中，获得个体细胞或细胞簇用于细胞学检测。核心活检中，获得组织核心或片段用于组织学检测，可经冷冻切片或石蜡切片完成。在本发明的某些实施方式中，本文所述试验方法可用于检测癌症中MAF特征的存在。在某些实施方式中，所述癌症可包括涉及实体瘤出现的癌症。在某些实施方式中，所述癌症可包括上皮癌。在某些实施方式中，所述癌症可包括例如但不限于卵巢癌、胃癌、胰腺癌、十二指肠癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、阴道癌、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、睾丸癌、口腔癌、食道癌以及神经母细胞瘤和尤文氏肉瘤。在某些实施方式中，本发明针对能诊断、预后和/或预测应用MAF特征的试验方法。例如但不限于，本文所述试验方法可用于诊断背景，如侵入性癌可通过检测样品中所有或部分MAF特征来诊断。在某些非限制性实施方式中，本文所述试验方法可用于预后背景，如检测所有或部分MAF特征能评价未来转移的可能性，包括尚未鉴定所述转移的那些情况。在某些非限制性实施方式中，本文所述试验方法可用于预测背景，如检测所有或部分MAF特征能评价某些治疗类型的可能益处，例如但不限于新辅助治疗、手术切除、和/或化疗。在某些非限制性实施方式中，本发明的标记物和试验方法可用于测定对象中的癌症是否发展到侵入性和/或转移形式，或消退(例如响应治疗)。在某些非限制性实施方式中，本发明的标记物和试验方法可用于对癌症分期(其中临床分期考虑是否发生侵袭)。由于MAF特征在多种癌症中作为某些癌症不同分期出现的侵袭标记而存在，所述多癌症分期是可能的。例如，在某些实施方式中，本发明的标记物和试验方法可用于对选自乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌和神经母细胞瘤的癌症分期。在某些实施方式中，本发明的标记物和试验方法可用于鉴定原位乳腺癌何时达到I期。在某些实施方式中，本发明的标记物和试验方法可用于鉴定卵巢癌何时达到III期，更特定是IIIc期。在某些实施方式中，本发明的标记物和试验方法可用于鉴定结直肠癌何时达到II期。在某些实施方式中，本发明的标记物和试验方法可用于鉴定神经母细胞瘤何时发展超越I期。在某些非限制性实施方式中，本发明的标记物和试验方法可用于预测诊断患有癌症对象中的药物反应，所述癌症例如但不限于上皮癌，至少一部分MAF特征先前鉴定为与乳腺癌中耐受新辅助化疗相关(Farmer P, NatMed 2009; 15:68-74)。然而，由于MAF特征的多癌症相关性(直到提交本发明才得以理解)，本发明的某些实施方式涉及利用MAF特征的存在以预测诊断有上皮癌对象中的药物反应，所述上皮癌选自卵巢癌、胃癌、胰腺癌、十二指肠癌、肝癌、结肠癌、阴道癌、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、睾丸癌。在某些非限制性实施方式中，MAF特征或与之相关的标记物子集可用于评价治疗在对象中的关联(相对)益处。例如，若治疗决定是基于癌症定位于对象的假设，出现MAF特征或与之相关的标记物子集会提示癌症为侵入性。在一个特定非限制性实施方式中，手术或放射学抗肿瘤治疗前新辅助化学和/或免疫治疗对有恶性肿瘤对象的相对益处可通过测定MAF特征或与之相关的标记物子集的存在来评价，其中MAF特征或与之相关的标记物子集的存在指示所述新辅助治疗赋 予对象的相对益处减少。在某些实施方式中，本发明的试验能检测表达的协同调节，例如但不限于MAF特征相关基因的过表达。在某些实施方式中，所述检测包括但不限于检测COLlIAl、THBS2和INHBA的表达。在某些实施方式中，所述检测包括但不限于检测以下表达:C0L11A1 (优选)，C0L10A1, C0L5A1, C0L5A2, COLlAl和C0L1A2 ；以及下列一种或更多或者两种或更多或者三种或更多:THBS2 (优选)，INHBA (优选)，VCAN, FAP, MMP11, POSTN, ADAMl2, LOX, FNl 和SNAI2。例如但不限于，诊断有癌症的对象或者评价癌症存在或分期的对象(癌症优选但不限于上皮癌)样品可就出现MAF基因和/或过表达至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种、或所有六种下列蛋白:C0L11A1 (优选)，C0L10A1，C0L5A1, C0L5A2, COLlAl和C0L1A2 ;以及下列一种或更多或者两种或更多或者三种或更多:THBS2(优选)，INHBA (优选)，VCAN, FAP, MMP11, POSTN, ADAMl2, LOX, FNl 和 SNAI2 进行测试。优选但不限于，SNAIl 表达不改变(此外，在本发明的某些非限制性实施方式中，SNAIl基因甲基化)。在本发明的一个特定非限制性实施方式中，过表达COLl 1AUTHBS2和INHBA而非SNAII，指示诊断具有侵入性和/或转移发展的癌症。在某些实施方式中，本发明的高特异性侵袭感测生物标记试验检测C0L11A1的过表达。在某些实施方 式中，所述高特异性侵袭感测生物标记试验检测COLllA和INHBA的协调过表达。在某些实施方式中，所述高特异性侵袭感测生物标记试验检测COLllA和THBS2的协调过表达。在某些实施方式中，所述高特异性侵袭感测生物标记试验检测COLl 1A、INHBA和THBS2的协调过表达。在某些实施方式中，所述高特异性侵袭感测生物标记试验检测一种、两种、或所有三种C0L11A、INHBA和THBS2的协调过表达以及一种或多种C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl和C0L1A2的表达；和下列一种或更多或者两种或更多或者三种或更多:VCAN、FAP、MMPl1、POSTN、ADAM12、LOX、FNl 和 SNAI2。在某些实施方式中，所述高特异性侵袭感测生物标记试验检测COLl 1A、INHBA和THBS2中一种、两种、或所有三种的协调过表达以及一种或多种miRNA的差异性表达，所述miRNA 选自下组:hsa-miR-22; hsa-miR-514-l/hsa_miR-514-2 I hsa-miR-514-3; hsa-miR-152;hsa-miR-508;hsa-miR-509-l/hsa-miR-509-2/hsa-miR-509-3;hsa-miR-507;hsa-miR-509-l/hsa-miR-509_2;hsa-miR-506;hsa-miR-509-3;hsa-miR-214;hsa-miR-510;hsa-miR-199a-l/hsa-miR199a_2;hsa-miR-21;hsa_miR-513c;和 hsa_miR-199b。在某些实施方式中，所述高特异性侵袭感测生物标记试验检测COLl 1A、INHBA和THBS2中一种、两种、或所有三种的协调过表达以及一种或多种基因的差异性甲基化，所述基因选自下组:PRAME; SNAI I; KRT7; RASSF5; FLJ14816; PPL; CXCR6; SLC12A8; NFATC2; HOM-TES-103;ZNF556;0CIAD2;APS;MGC9712;SLC1A2;HAK;C3orfl8;GMPR;和 C0R06。诊断试剂盒也包括在本发明范围内。更特定地，本发明包括测定测试样品中所有或部分MAF特征存在的试剂盒。测定样品中所有或部分MAF特征存在的试剂盒可包括:a)至少一种含有选自下组的氨基酸序列的MAF特征抗原，和b)含有与所述MAF特征抗原特异性相互作用抗体的偶联物，所述抗原结合于能产生检测信号的信号生成化合物。所述试剂盒还可包括含有抗原结合试剂的对照或校准物，以及描述使用该试剂盒方法的说明书。在某些实施方式中，所述试剂盒包括一种或多种MAF特征抗原特异性抗体，其中MAF特征抗原包括或衍生自一种或多种下列基因编码的蛋白:C0L11A1 (优选)，C0L10A1, C0L5A1, C0L5A2, C0L1A1,和 C0L1A2, THBS2, INHBA, VCAN, FAP, MMPl 1，POSTN, ADAMl2, LOX, FNl 和 SNAI2。在某些实施方式中，本发明涉及用于检测MAF特征核酸的试剂盒和组合物。在某些实施方式中，所述试剂盒包括能与一种或多种MAF特征核酸杂交的核酸。例如但不限于，所述试剂盒能与杂交和/或核酸扩增试验联用以检测MAF特征核酸。图1描述可用于所述试剂盒非限制性示例的一般策略。在某些实施方式中，用本发明试剂盒的可采用杂交和/或核酸扩增试验包括但不限于:实时 PCR(例如参见 Mackay, Clin.Microbiol.1nfect.10(3):190-212, 2004)，链置换扩增(SDA)(例如参见 Jolley 和 Nasir, Comb.Chem.High Throughput Screen (《高通量筛选》).6 (3): 235-44, 2003)，再生式序列复制反应(3SR)(例如参见Mueller等,Histochem.Cell.Biol.108(4-5):431-7, 1997)，连接酶链式反应(LCR)(例如参见 Laffler 等，Ann.Biol.Clin.(Paris).51 (9):821-6, 1993)，转录介导的扩增(TMA)(例如参见 Prince 等，J.Viral Hepat.11(3): 236-42，2004)，或基于核酸序列的扩增(NASBA)(例如参见 Romano等，Clin.Lab.Med.16(1):89-103, 1996)。在本发明的某些实施方式中，检测MAF特征核酸的试剂盒包括:⑴含有靶标特异性序列的核酸序列，所述序列与MAF特征核酸靶标特异性杂交，和(ii)检测标记。所述试齐IJ盒还可包括一种或多种可作为引物的额外核酸序列以介导靶序列的扩增，所述引物包括巢式和/或半巢式引物。在某些实施方式中，本发明的试剂盒还可包括作为扩增指示物的额外核酸序列，如用于实时聚合酶链式反应试验的标记探针。
本发明的试剂盒也用于同时或依序检测多种MAF特征核酸。这类情况中，所述试剂盒可包括不同引物组和一种或多种不同标记用于各个不同核酸靶标。在某些实施方式中，所述试剂盒包括核酸(例如杂交探针、引物或RT-PCR探针)，所述核酸包括或衍生自一种或多种下列基因:C0L11A1 (优选)，C0L10A1, C0L5A1, C0L5A2, C0L1A1,和 C0L1A2, THBS2, INHBA, VCAN, FAP, MMPl 1，POSTN, ADAMl2, LOX, FNl,和 SNAI2。本文所述任何示例性试验形式和本发明所述任何试剂盒可适于或优化用于自动化和半自动化系统(包括具有含微粒的固相的系统)，例如描述于如美国专利号5，089，424和5，006, 309，以及与本领域已知的任何市售可得检测平台联用。在某些实施方式中，本发明的方法、试验、和/或试剂盒涉及检测所有或部分MAF特征，其中所述检测可采用二元、检测/未检测的结果形式。在某些实施方式中，本发明的方法、试验、和/或试剂盒涉及检测所有或部分MAF特征，其中所述检测可采用多因子结果形式。例如但不限于，所述多因子结果可采用基于一、二、三或更多个因子的分数形式。所述因子可包括但不限于:(I)对MAF特征基因产物的表达、甲基化状态、和/或miRNA存在中的变化的检测；(2)样品中显示出水平改变的MAF特征基因产物的数目、甲基化状态、和/或miRNA的存在；和(3)MAF特征基因产物、甲基化状态、和/或miRNA存在的这种变化的程度。5.3基于MAF特征的治疗方法在其他非限制性实施方式中，本发明提供治疗对象的方法，例如但不限于的方法包括进行上述诊断方法且随后，若MAF特征在对象样品中测得，建议患者进行进一步诊断过程(例如影像学方法如X射线、超声、计算机化轴向层面X射线摄影法(CAT扫描)或磁共振成像(MRI))，和/或建议给予对象抑制侵袭和/或转移的试剂治疗。在本发明的某些非限制性实施方式中，进行上述诊断方法并根据该试验结果作出治疗决定。例如但不限于，治疗决定如是否在手术或放射学抗肿瘤治疗前进行新辅助化学和/或免疫治疗可根据上述诊断方法结果作出。所述诊断方法的结果与诊断决定相关，由于出现MAF特征或与之相关的标记子集指示癌症未定位，因此对象样品中出现MAF特征或与之相关的标记子集指示该新辅助治疗赋予对象的相对益处减少。在某些实施方式中，进行上述诊断方法并根据该试验结果决定是否继续特定治疗方案。例如但不限于，决定是否继续特定治疗方案如是否继续特定化疗、放射治疗、和/或分子靶向治疗(例如癌细胞特异性抗体治疗)可根据上述诊断方法结果作出。所述诊断方法结果与决定是否继续特定治疗方案相关，因为对象样品中出现MAF特征或与之相关的标记子集可指示该对象对治疗的响应性。5.4基于MAF特征的药物开发方法本发明还可用于开发抑制多癌症侵袭的治疗，使用由MAF特征提供的生物学知识衍生靶标。在多个非限制性实施方式中，本发明提供鉴定抑制对象中癌侵袭和/或转移扩散的试剂的方法。在某些这类实施方式中，所述方法包括使测试剂接触表达MAF特征的癌细胞，其中如果所述测试剂降低该特征中的基因过表达，该测试剂可用作抑制癌侵袭和/或转移的治疗剂。在某些实施方式中，可测定测试剂对本文所述MAF特征中基因表达的效果(例如但不限于过表达至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种、或所有六种下列蛋白:C0L1 IAl (优选)， C0L10A1, C0L5A1，C0L5A2, COLlAl 和 C0L1A2 ;以及下列一种或更多或者两种或更多或者三种或更多:THBS2 (优选)，INHBA (优选)，VCAN, FAP, MMPl 1，POSTN, ADAM
12,LOX, FNl和SNAI2，且如果所述测试剂降低该特征中的基因过表达，该测试剂可用作治疗/预防癌侵袭和/或转移的治疗剂。在某些实施方式中，可结合C0L11A1的表达分析测试剂的效果。在某些实施方式中，可结合COLl IAl和INHBA的表达分析测试剂的效果。在某些实施方式中，可结合COLl IAl和THBS2的表达分析测试剂的效果。在某些实施方式中，可结合C0L11A1、INHBA和THBS2的表达分析测试剂的效果。在某些实施方式中，可结合COLl 1A、INHBA和THBS2中一种、两种、或所有三种的表达以及一种或多种 C0L10A1, C0L5A1, C0L5A2, COLlAl 和 C0L1A2, VCAN, FAP, MMPl 1，POSTN, ADAM12, LOX, FNl和SNAI2的表达来分析测试剂的效果。在某些实施方式中，可结合C0L11A、INHBA和THBS2中一种、两种、或所有三种的表达以及一种或多种选自下组的miRNA的表达来分析测试剂的效果:hsa-miR-22;hsa-miR-514-1/hsa-miR-514-2|hsa-miR-514-3;hsa-miR-152;hsa-miR-508;hsa-miR-509-l/hsa-miR-509-2/hsa-miR-509_3;hsa-miR-507;hsa-miR-509-l/hsa-miR-509-2;hsa-miR-506;hsa-miR-509-3;hsa-miR-214;hsa-miR-510;hsa-miR-199a-l/hsa_miR199a_2;hsa-miR-21;hsa_miR-513c;和 hsa_miR-199b。 在某些实施方式中，可结合COLl 1A、INHBA和THBS2中一种、两种、或所有三种的表达以及一种或多种选自下组的基因甲基化来分析测试剂的效果=PRAME; SNAI I; KRT7; RASSF5;FLJ14816;PPL;CXCR6;SLC12A8;NFATC2;H0M-TES-103;ZNF556;0CIAD2;APS;MGC9712;SLC1A2;HAK;C3orfl8;GMPR;和 C0R06。5.5协同基因对的检测在某些实施方式中，作为第二步，鉴定了与特定MAF特征成员共同但非单独最相关的基因对，因此它们未在先前研究中出现。对于此任务，根据其与MAF特征成员的协同作用来排列基因对(Anastassiou D, Mol Syst Biol 2007; 3:83),使用(ffatkinson J, AnnN Y Acad Sci 2009;1158:302-13)的计算方法，这可进一步有利于生物学发现。发现2种卵巢癌之间以及2种结直肠癌之间有力验证的非限制性示例，但不是对2种癌症类型都通用。特别感兴趣的是在2种结肠癌的排列靠前基因中出现的基因对(CCL11，MMP2)和(SLAM7, SLAM8)，2种卵巢癌的排列靠前基因中出现的基因对(C7，TOGFRA)，(C7，ECM2)，(TCF21, ECM2) (TCF21是已知的间充质-上皮介质)。在某些实施方式中，可评价交互信息和协同作用。例如，假定2个变量如2个基因G1和G2的表达水平由联合概率密度P12决定，对应边际P1和p2，且使用简化符号，交互信息
I(G1IG2)是关联性的一般量度且定义为期望值E{logp12/p1p2}。2个变量G1, G2与第三变量G3的
协同性是[14]等于I (G1, G2;G3)-[I (G1;G3) +I (G2;G3)]，即G1, G2对与G3关联部分纯粹是由于G1和G2间的协同合作(“整体”减去“部分”之和)。5.6统计分析除了基因表达数据以外，miRNA表达和基因甲基化与MAF特征的关联也能在本发明内容中研究和使用。例如但不限于，用于miRNA表达和基因甲基化活性显著性以及用于协同对的P值评估可如下进行。应用基于置换的方法作为多重检验校正:进行100次类别标签的置换实验，各置换实验完成穷举搜索后保存对应的100个最高值。使用这100个最高值分数组，获得Gumbel (I型极值)分布的位置参数和尺度参数的最大可能估计值，产生累积密度函数F。然后，实际分数Xtl的P值在与表型无关的零假设下为1-F(Xtl)。类似地，对于协同对，发现100个数据集中最高得分的协同作用与初始相同，除了 C0L11A1探针值彼此随机置换，如上用Gumbel分布对最高置换协同分数建模。6.实施例6.1 实施例1由于我们聚焦于基因具有其极端(在大部分情况下最大)值时(但并不是没有其他)与转移二元(“低期”相比“高期”)表型相关的基因簇，首先开发基因和表型间关联的特殊量度，称为“极值关联”(EVA)。简言之，EVA指标是具有最高基因表达值的所有样品子集中偏向性部分的最小P值。换言之，假设总共有M个样品，其中N个是“低期”且M - N个是“闻期”，选择有最闻基因表达值的m个样品。假定基因表达值与表型不相关，所选m个样品中有最多n个“低期”样品的概率由累积超几何概率h(x≤n;M，N，m)给出。随后，EVA指标等于-1ogltl(所有可能的n值中这些概率的最小值)。例如，假设就总共300个样品而言，有250个高期样品和50个低期样品。此外，假设有特定基因最高值的100个样品包含99个高期样品和1个低期样品。在此情况中，可用MATLAB函数hypercdf (1，300, 50, 100) =5 X 10-9评估h (X≤I; 300，50，100)，得到该基因的EVA指标为至少-1og10 (5 X 10_9) =8.3，例如若第101个样品还是高期，则所述基因的EVA指标会甚至更高。应注意一旦达到最高值，剩余样品的分选排列不相关，反映了仅极值与表型相关的假设。图2显示COL11A1基因的累积超几何概率值，使用TCGA卵巢癌数据集和IIIb和IIIc之间的分期阈值:m=133时产生最大值(8.31)。事实上，有最高COL11A1表达的所有133个样品处于IIIc或IV期。然后开发了机械无偏性(仅取决于表型)算法，就多种标记“高期”或“低期”的样品给定基因表达数据集时，所述算法可选择仅在高期样品中协调过表达的基因。首先根据EVA指标标准选择排列最高的前100个基因。仅使用此基因集，用间隙统计进行k-均值聚类(Tibshirani R, J R Statist Soc B 63:411-423)。此步骤中，如果基因确实协调过表达，其会在热图上良好排列。这导致选择与高/低期表型最相关的类群所属样品-此集合称为“基于EVA的样品”。该类群中的几乎所有样品超过MAF分期阈值，仅很少的例外可能是由于误诊。其次，定义“干净”MAF表型，对比(a) “基于EVA”和“高期”的样品与(b) “非基于EVA”和“低期”的样品。如果样品数目足够大，此“干净”表型提供可鉴定与观察到的侵袭现象和/或转移相关协调过表达最相关的基因的最灵敏方法。然后用异方差t检验通过“干净”表型来排列基因并计算其多重检验校正P值，选择邦弗伦尼校正后P〈10_3的基因。最后，发现这些选定基因集在所有癌表达数据集上的交叉并根据倍数变化对其进行排列。对于有η个样品和m个探针组的数据集，EVA算法计算nXm累积超几何分布概率。这可能在计算上相当密集，因此设计了低复杂度实现算法以随着EVA算法推进而动态“建立”各探针组的累积超几何分布，如下所详述。给定有高期样品和b_低期样品的数据集，构建了对应所有可能样品子集的超几何概率的(a+1) X (b+1)表。然后，对于各探针组，根据所述探针组的表达值来分选样品。此排序广生从左下角到右上角穿过表格的路径，就各样品而目向上或向右移动。此路径的每一步骤中，遇到所观察数目或更多高期样品的累积概率计算是通过对当前细胞沿对角线向下和向右的入口求和，包括当前细胞本身。图3所示的直观示例最佳展示了所述算法，其中数据集共有3个低期样品和5个高期样品。各探针组产生穿过此表格的路径，示例路径在此以灰色显示。I对应高期样品且O对应低期样品，此示例探针集产生路径111001011。就对应于子路径111001的蓝色细胞而言，遇到这许多或更多高期样品的概率通过对所述蓝色细胞沿对角线向下和向右的3个概率求和(包括其本身)来计算。此情况中，所述概率相当高(82.2%)。对沿着路径的每一步计算此累积概率，这些的最小值是EVA算法的输出。此算法的伪码在图4中给出。对4个丰富基因表达数据集运行EVA算法，2个来自卵巢癌且2个来自结直肠癌(Jorissen RN, Clin Cancer Res 2009;15:7642-51;Smith JJ,Gastroenterology; 138:958-68),所述癌症有分期信息。使用多种分期转化，显然包括具有协调过表达基因的样品的癌症定义为在卵巢癌中超过IIIb期和结直肠癌中超过I期。有趣的是，认识到由(Bignotti E, Am J Obstet Gynecol 2007; 196:245 el-11)鉴定在卵巢癌网膜转移中存在的“转移相关基因”也主要由(Tothill Rff1Clin Cancer Res2008;14:5198-208)鉴定为属于关联广泛结缔组织生成的卵巢癌的“不良预后”亚型。
显然，发现在所有4个数据集中共有多种P〈10_12的基因。表I显示平均log(倍数变化)大于2的这些基因列表。倍数变化方面排列居前的基因是C0L11A1 (探针37892_at)，然后是C0L10A1、POSTN、ASPN、THBS2和FAP。其中所述基因协调过表达的几乎所有样品达到分期阈值，对于结肠癌是II期和对于卵巢癌是IIIc期。表1:用邦弗伦尼校正P〈10—3根据基于EVA的算法，所有四个数据集中与卵巢癌和结直肠癌内高癌期相关的排列靠前的基因
权利要求
1.种诊断对象中侵入性癌的方法，所述方法包括测定对象样品中C0L11A1基因产物相对于正常对象的表达水平，其中C0L11A1基因产物过表达指示所述对象有侵入性癌。
2.种诊断对象中侵入性癌的方法，所述方法包括测定对象样品中至少一种选自COLl IAl、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl 和 C0L1A2 的基因产物，以及至少一种选自THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、P0STN、ADAM12、L0X、FN1 和 SNAI2 的基因产物相对于正常对象的表达水平，其中所述基因产物的过表达指示所述对象有侵入性癌。
3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表达水平由包含加工样品从而裂解所述样品中细胞的方法测定。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括至少部分纯化细胞基因产物并使所述蛋白暴露于检测剂的额外步骤。
5.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括至少部分纯化细胞核酸并使所述核酸暴露于检测剂的额外步骤。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括测定SNAII表达水平的额外步骤，其中SNAIl未过表达而其他基因产物过表达的测定结果指示所述对象有侵入性癌。
7.种开发涉及对象癌症预后的方法，所述方法包括测定对象样品中至少一种选自 COLlIAU C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl 和 C0L1A2 的基因产物，以及至少一种选自THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、P0STN、ADAM12、L0X、FN1 和 SNAI2 的基因产物相对于正常对象的表达水平，其中所述基因产物的过表达指示对象中出现的癌有变为转移性的可能。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表达水平由包含加工样品从而裂解所述样品中细胞的方法测定。
9.权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括至少部分纯化细胞基因产物并使所述蛋白暴露于检测剂的额外步骤。
10.权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括至少部分纯化细胞核酸并使所述核酸暴露于检测剂的额外步骤。
11.权利要求7-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括测定SNAII表达水平的额外步骤，其中SNAIl未过表达而其他基因产物过表达的测定结果指示所述对象中出现的癌有变为转移性的可能。
12.种诊断对象中侵入性癌的方法，所述方法包括测定对象样品中至少两种选自COLlIAl、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl 和 C0L1A2 的基因产物，以及至少一种选自THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、P0STN、ADAM12、L0X、FN1 和 SNAI2 的基因产物相对于正常对象的表达水平，其中所述基因产物的过表达指示所述对象有侵入性癌。
13.权利要求12所述的方法，其特征在于，所述表达水平由包含加工样品从而裂解所述样品中细胞的方法测定。
14.权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括至少部分纯化细胞基因产物并使所述蛋白暴露于检测剂的额外步骤。
15.权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括至少部分纯化细胞核酸并使所述核酸暴露于检测剂的额外步骤。
16.权利要求12-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括测定SNAIl表达水平的额外步骤，其中SNAIl未过表达而其他基因产物过表达的测定结果指示所述对象有侵入性癌。
17.种诊断对象中侵入性癌的方法，所述方法包括测定对象样品中C0L11A1、THBS2和INHBA中一种、两种、或所有三种相对于正常对象的表达水平，其中所述基因产物过表达指示所述对象有侵入性癌。
18.权利要求17所述的方法，其特征在于，所述表达水平由包含加工样品从而裂解所述样品中细胞的方法测定。
19.权利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法包括至少部分纯化细胞蛋白并使所述基因产物暴露于检测剂的额外步骤。
20.权利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法包括至少部分纯化细胞核酸并使所述核酸暴露于检测剂的额外步骤。
21.权利要求17-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括测定SNAIl表达水平的额外步骤，其中SNAIl未过表达而其他基因产物过表达的测定结果指示所述对象有侵入性癌。
22.种治疗对象的方法，所述方法包括进行权利要求1、7、12或17所述的诊断方法，其中蛋白过表达时，建议患者进行影像学方法。
23.种治疗对象的方法，所述方法包括进行权利要求1、7、12或17所述的诊断方法，其中蛋白过表达时，建议患者不进行新辅助治疗。
24.种治疗对象的方 法，所述方法包括进行权利要求1、7、12或17所述的诊断方法，其中蛋白过表达时，建议患者改变其目前治疗方案。
25.种鉴定抑制对象中癌侵袭的试剂的方法，所述方法包括使测试剂接触表达转移相关成纤维细胞特征的癌细胞，其中如果所述测试剂降低基因在所述特征中的过表达，所述测试剂可用作抑制癌侵袭的治疗剂。
26.权利要求25所述的方法，其特征在于，所述转移相关成纤维细胞特征包括过表达至少一种选自COLlIAl、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl和C0L1A2的基因产物，以及至少一种选自 THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、P0STN、ADAM12、L0X、FN1 和 SNAI2 的基因产物。
27.权利要求25所述的方法，其特征在于，所述转移相关成纤维细胞特征包括过表达至少两种选自COLlIAl、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl和C0L1A2的基因产物，以及至少两种选自 THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、P0STN、ADAM12、L0X、FN1 和 SNAI2 的基因产物。
28.种试剂盒，所述试剂盒包括: (a)能与转移相关成纤维细胞特征基因产物特异性相互作用的标记报道分子； (b)对照或校准试剂，和 (c)描述使用试剂盒方式的说明书。
29.权利要求28所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: (a)包含与转移相关成纤维细胞特征抗原特异性相互作用的抗体的偶联物，所述抗原结合于能产生可检测信号的信号生成化合物； (b)对照或校准试剂，和 (C)描述使用试剂盒方式的说明书。
30.权利要求29所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括转移相关成纤维细胞特征抗原特异性抗体，其中由所述抗体结合的转移相关成纤维细胞特征抗原包括或衍生自一种或多种下列基因编码的蛋白:C0L11A1、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl、C0L1A2、THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、P0STN、ADAM12、L0X、FN1 和 SNAI2。
31.权利要求28所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: (a)能与转移相关成纤维细胞特征核酸杂交的核酸； (b)对照或校准试剂，和 (C)描述使用试剂盒方式的说明书。
32.权利要求28所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: (a)核酸序列，所述序列包括: (i)与转移相关成纤维细胞特征核酸特异性杂交的靶特异性序列，和 (ii)检测标记； (b)引物核酸序列； (c)指示扩增的核酸指示物；和 (d)描述使用试剂盒方式的说明书。
33.权利要求31或32所述的试剂盒，其特征在于，所述与转移相关成纤维细胞特征核酸特异性杂交的核酸包括或衍生自下列基因之一:C0L1 IAl、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl、C0L1A2、THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMPl K POSTN, ADAMl2, LOX、FNl 和 SNAI2。
全文摘要
本发明涉及构成转移相关成纤维细胞(“MAF”)特征的生物标记和其在诊断多种癌症并进行分期中的应用。这至少部分基于以下发现鉴定某些基因的差异表达指示有高度特异性的多种癌症的诊断和/或分期。特定地，出现特征表明癌症已变为侵入性。因此，在多个实施方式中，本发明提供诊断、诊断试剂盒的方法以及包括评价对象生物标记状态的治疗方法。此外，由于某些基因的差异表达能作为获得转移潜力的标记，如表达概况能用于预测某些治疗干预的适宜性，例如新辅助治疗的适宜性。所述概况还可用于筛选能抑制转移潜力获得的治疗。因此，在多个实施方式中，本发明提供就抗转移特性筛选治疗以及筛选试剂盒的方法。
文档编号C12Q1/68GK103097548SQ201180029006
公开日2013年5月8日 申请日期2011年4月13日 优先权日2010年4月13日
发明者D·阿纳斯塔修, J·沃特金森, H·金 申请人:纽约市哥伦比亚大学托管会