专利名称：癌症诊断标记物和方法
技术领域：
本发明涉及一种使用粒细胞群落刺激因子(G-CSF)的基因表达变 异体的癌症诊断标记物及其制备方法，具体涉及一种使用具有与G-CSF 的外显子4区域的5'-端连接的外显子2区域的3，-端的寡聚核苷酸作为 癌症诊断标记物的诊断癌症和/或评估癌症发展状态的方法。
背景技术：
癌症诊断一般通过下列方法来实现(1)使用显微镜诸如光学显微 镜或者电子显微镜进行形态学分析；(2)检测在癌组织中特异性表达的 蛋白质的免疫组化测定(Iran, 5Zom^/.丄，3:99， 1999; Z朋cet, 2:483, 1986)， 或者(3)分析在癌组织中发现的异常生物分子诸如突变基因的分子诊断。 与分子诊断相比，形态学和免疫组化诊断需要更长时间和更高的成本。 由于分子诊断具有相对简单的步骤并且产生结果时间较短，已经变成发 展新的癌症诊断方法的主要手段。近来，Health Digit公司开发了用于诊断 各种癌症的蛋白质芯片系统，并在世界上首次得到中国药品监督管理局 (CSDA)临床测试证实(www.health-digitcom)。但是，蛋白质芯片系统不是仅 仅使用一种生物标记物来诊断所有种类的癌症，而是使用10种或更多种蛋 白质作为标记物。
为了将这种诊断方法有效地应用于癌症诊断，最重要地是选择并使用能 够更精确并容易检测癌症发生的癌症诊断标记物。已经报道许多基因(Steve, M.等人，《/ C〃". 0腳/，, 20:3165~3175, 2002; Sridlhar， R.等人, / C7/w. <9 co/ogy, 20:1932 1941,2002)和蛋白质(Goessl,等人，t/ra/ogy, 58:335 338, 2001; Zhou,等人，Omcerrwa" 66:217~224, 2001;韩国专利公开 号.2001-0061173)作为诊断标记物，其中的一些已经在临床上用于癌症诊
4具有较低器官特异性的CEA、 BFP、 TPA 和IAP具有较低的敏感性，因此产生了假阳性数据。而且，具有较高器官特 异性的生物标记物诸如AFP、 PIVKAII、酯酶I、 CA19-9、 CA50、 Span-l 抗原、CA15-3和BCA225仅仅被用于目标器官。
在候选癌症诊断标记物开发中，许多研究人员使用微阵列技术，试图发 现具有诊断应用的根据病理和生理条件显示不同结果的基因，(Liu， H.X.等 人，27:55~58, 2001; Wilson, C.A.等人'O"coge朋，14:1-16, 1997; Weissenstdner, T., iVwc/e/c v4c/& 26:687, 1998; Zolezzi, F.等人，^m. / Me<i. Gewef., 71:366-370, 1997; Mottes J.R.和Iverson， L.E., 7Vewra", 14:613-623, 1995; Crook, R.等人，4:452~455, 1998; Jiang, Z.H.和Wu, J.Y.,尸rac. Soc. 脂.MW" 220:64~72, 1999)。
但是，由于通过上述提到的方法发现的候选癌症诊断标记物绝大部 分由表达的序列标记(EST)构成，它们仅仅被发现为具有数据的特性， 因此难以选择可靠的特异性候选者并获知(catch on)它们来源的真正基 因。特别地，通过人类基因组分析得知基因的数目并且还得知许多异构 体或者变异体通过它们得到表达而具有生物功能及其复杂性。因此，其 已经变成用于未来的另一种大的主题，以发现整个基因组中被表达的基 因和条件变异体以及它们的功能是什么。这些变化的变异体可以是找出 它们中异常变异体的形成和引起癌症的可能性之间的相关性的良好基础 (Cartegni, L.等人，Ato. i ev. 3:285~298, 2002; Schweighoffer, R等人，
尸/wvwflcoge"ow/c^ 1:187~197, 2000; Blencowe， B.J., 7>efi^ 5"c/" 25:106 110, 2000; Cooper, T.A.和Mattox, W., X肌i/wm. 61:259 266， 1997)。
本发明的发明人已经进行了长期研究，来开发新的可诊断各种癌症 的癌症诊断标记物，结果，确认在G-CSF基因转录过程中外显子3区域 的缺失在肿瘤细胞或者肿瘤组织中特异性显示，从而提出了有关使用
5G-CSF mRNA, cDNA变异体片段或者蛋白质作为癌症诊断标记物诊断癌症 的方法(WO 2003/027288 Al)。在使用G-CSF基因片段作为上述申请的 专利的癌症诊断标记物的微阵列中，G-CSF基因的外显子1、2、4和5DNA 片段与G-CSF基因的外显子3DNA区域一起被用作检测生物样品中具有 缺失外显子3区域的G-CSF基因片段的核酸探针。本发明的通过检测 G-CSF基因的外显子3区域缺失表达的诊断癌症的方法是使用基因变异 体的特性诊断癌症的技术之一，并被认为是有用的候选癌症诊断标记物， 因为该变异体在大多数癌症中存在。
同时，包括G-CSF基因的大多数基因通常表达许多异构体和变异体， 于是，固定在微阵列上的探针片段必须在检测G-CSF基因的外显子3区 域的缺失中具有高度的敏感性。而且，正常G-CSF或者它们的片段的表 达可在肿瘤细胞或肿瘤组织中与突变G-CSF异构体一起存在，因此仅仅 通过检测其基因表达中G-CSF的外显子3区域的存在的癌症诊断可导致 可信度的丧失或者较低的敏感性，此外，还具有评估癌症发展的状态问 题。
因此，本发明的发明人已经付出了极大的努力来开发新的核酸探针 用于检测可满足上述要求或者解决上述问题的没有外显子3区域的 G-CSF基因片段，结果发现当含有具有与G-CSF基因的外显子4区域的 5'-末端连接的G-CSF基因的外显子2区域的3，-末端的核酸序列的寡聚 核苷酸被用作癌症诊断标记物时，与其它探针相比其具有显著增加的高 度敏感性，并确定癌症发展的状态可通过使用含有具有与G-CSF基因的 外显子4区域的5'-末端连接的G-CSF基因的外显子2区域的3，-末端的 核酸序列的寡聚核苷酸与具有一部分或者全部G-CSF基因的外显子3区 域的序列的寡聚核苷酸一起作为癌症诊断标记物精确地被诊断，由此完 成了本发明。
发明内容
因此，本发明的主要目的在于提供用于诊断癌症的寡聚核苷酸，其
基本含有具有与粒细胞群落刺激因子基因的外显子4区域的5'-末端连接 的外显子2区域的3'-末端的剪接位点的核酸序列。
本发明的另一目的在于提供含有寡聚核苷酸的用于癌症诊断的诊断 试剂盒和使用寡聚核苷酸诊断癌症的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了用于癌症诊断标记物的寡聚核苷 酸，其基本上含有含有具有与G-CSF基因的外显子4区域的5，-末端连接 的外显子2区域的3'-末端的核酸序列的寡聚核苷酸的剪接位点的核酸序 列。
优选地，根据本发明的寡聚核苷酸基本上包括序列号l或2的核酸 序列。
本发明还提供了含有寡聚核苷酸的用于癌症诊断的诊断试剂盒。 在本发明中，用于癌症诊断的诊断试剂盒优选为用于评估癌症发展状态
的试剂盒，其另外含有基本上包括一部分或者全部G-CSF基因的外显子3
区域的序列的寡聚核苷酸。
在本发明中还提供了用于诊断癌症的方法，所述方法包括下列步骤 (a)从哺乳动物生物样品中获得G-CSF核酸样品；(b)扩增得到的G-CSF
核酸样品；和(c)检测扩增的样品中含有具有与G-CSF基因的外显子4
区域的5'-末端连接的外显子2区域的3，-末端的剪接位点的核酸序列的
寡聚核苷酸。
在本发明的方法中，步骤(c)优选包括其中在扩增的样品中同时检 测包括一部分或者全部G-CSF基因的外显子3区域的序列的寡聚核苷酸 与含有具有与G-CSF基因的外显子4区域的5，-末端连接的外显子2区域 的3'-末端的剪接位点的核酸序列的寡聚核苷酸的步骤。
通过下列详细描述和所附的权利要求书，本发明的其它特征和实施方式将更加显而易见。
图1是生产来自人类G-CSF基因的正常蛋白质和变异体的过程的示意图。
图2显示了可通过两种类型(A型、B型)的人类G-CSF基因的外 显子2区域形成的外显子2区域和外显子3区域的接合区域。
图3显示了在PCR中引物的连接位置和根据该位置所预期的PCR 产物。
图4是DNA芯片的设计，其包括扩增的G-CSF基因的每个区域的 探针(E2:由G-CSF基因的外显子2区域设计的探针；E2E3a:由类型A的具 有与G-CSF基因的外显子2区域的3'-末端和外显子3区域的5'-末端连 接的剪接位点设计的探针；E2E3b:由类型B的具有与G-CSF基因的外显 子2区域的3'-末端和外显子3区域的5'-末端连接的剪接位点设计的探 针；E3-1, E3-3, E3-4和E3-6: G-CSF基因的外显子3区域设计的探针；E2E4a: 由类型A的具有与G-CSF基因的外显子2区域的3'-末端和外显子4区域 的5'-末端连接的剪接位点设计的探针；E2E4b:由类型B的具有与G-CSF 基因的外显子2区域的3'-末端和外显子4区域的5'-末端连接的剪接位 点设计的探针；P:被构造成通过荧光标记作为位置标记物来区分位置的探 针;N:阴性对照(点样液)。
图5显示了使用图4的DNA芯片的杂交结果。红色圆圈显示了显示信 号的探针。
图6显示了根据细胞和组织类型的图4的DNA芯片的杂交结果(A:正 常人血液，B:肺癌(A549)， C:大肠癌(SES-T), D:胃癌(1:AGS, 2: YCC-2, 3: HwangOO, E:颈部肿瘤(l: C33A, 2: HeLa), F:增殖肿瘤细胞(HT1080), G:乳 腺癌MDA-MB-231), H:胰腺癌(Capan-2)， I:肝癌(SK-Hepl), J:黑素肉瘤 (SK-Mel),K:白血病(JurketcDNA文库)，L:胚肾(293))。红色圆圈显示能够区分肿瘤组织和正常组织的探针信号。
图7是DNA芯片的示意图，其包括被设计成检测G-CSF基因的剪接位 点的探针(E2E4:由具有与两种类型(A型、B型)的G-CSF基因的外显 子2区域的3'-末端和外显子4区域的5'-末端连接的剪接位点设计的探 针；E2E3:由具有与两种类型(A型、B型)的G-CSF基因的外显子2 区域的3'-末端和外显3区域的5'-末端的剪接位点设计的探针；P:被构 造成通过荧光标记作为位置标记物来区分位置的探针；N:阴性对照(点样 液))。
图8显示了根据细胞和组织类型的图7的DNA芯片的杂交结果。红色 圆圈显示可在癌症的情况下特异性显示信号的探针。
图9是DNA芯片的示意图，其上固定有由每个G-CSF基因的外显子区 域设计的探针以检査每个探针的诊断效率。
图IO是显示G-CSF基因中每个探针的位置的示意图。包括在用于不具 有外显子3的G-CSF基因的探针中的椭圆形中的探针由剪接变异体的外显 子2的3'末端和外显子4的5'末端设计。
图11显示了根据细胞类型和显示有效的候选探针的探针信号强度，该 有效性可通过信号强度来推断。
图12显示了使用图9的DNA芯片的杂交结果，红色圆圈显示可仅仅在 癌症中特异性显示信号的探针。
图13显示了根据细胞和组织类型的图9的DNA芯片的杂交结果。通过 Scanarray 5000 (A:正常血液(WBC), B: 293 (胚胎细胞系)，C: SES-N (正常大 肠),D: SES-T (大肠癌),E: Colo205 (克隆的癌细胞系),F: DLD-1 (克隆的癌细 胞系)，G: HwangOO (胃癌细胞)，H: YCC-3 (胃癌细胞系)，J: MDA-MB-231 (乳 腺癌细胞系)，K: NCI-H460 (肺癌细胞系)，L: Caki-2 (肾癌细胞系)，M: Capan-2 (胰腺癌细胞系)，N: SK-Mel2(黑素肉瘤)，O: HepG-2 (肝细胞癌)，P: SK-Hepl (肝脏癌细胞系))得到的杂交反应图像。红色圆圈显示在癌症的情况
9下特异性显示信号的探针。
图14显示了通过将每种探针与点样液混合制备的DNA芯片。用蓝色方
块标记的部分是代表癌症的探针定位于其上的区域。
图15显示了使用图14的DNA芯片根据实施例8和实施例9的通过利 用序列号32和序列号33的引物而扩增来自正常和肿瘤临床样品的人类 G-CSF核苷酸序列得到的杂交产物的结果。
具体实施例方式
本发明涉及一种用于诊断癌症和/或评估癌症发展状态的方法，该方 法使用基本上含有具有与在通过包括微阵列的基因分析方法在转录后加 工之后产生的G-CSF基因变异体片段的外显子2区域的3'-末端和外显子 4区域的5'-末端连接的剪接位点的核酸序列。换言之，本发明涉及一种 用于诊断癌症和/或评估癌症发展状态的方法，该方法使用通过缺失 G-CSF基因的外显子3区域以连接外显子2区域和外显子4区域作为癌 症诊断标记物得到的G-CSF变异体。
G-CSF基因的外显子1 5在正常人体的剪接过程中正常连接，但剪 接以肿瘤细胞或者肿瘤发展细胞中不具有外显子3的变异体形式发生以 产生不具有外显子3的mRNA(图1)。人类G-CSF基因的外显子2区域 具有两种类型(A型、B型)，因此外显子2区域和外显子3区域的剪接 位点也具有两种类型(图2)。而且，G-CSF基因的剪接结果是，具有所 有外显子1~外显子5的G-CSF mRNA从正常细胞中被分离，而不具有 外显子3的mRNA从肿瘤细胞中被分离，上述mRNAs的差别可通过PCR 使用对G-CSF基因特异的引物来确认(图3)。
在识别两种基因在肿瘤细胞中特异性表达(或者抑制)以及基因突 变的分子生物学方法以PCR (Bottema, C.D., MwtoA 233:93-102， 1993; Nelson, D丄.，Ow. O/ /". Dev., 1:62-68, 1991; Pourzand, C.和Cerutti, P.,
Mw如.288:113-121， 1993; Holland, P.M.等人，尸rac. A^/. f/SA8:7276-7280, 1991 )、单链构象多态性(SSCP， Glavac, D., i/ww. 19:384-394, 2002; Strippoli, P.等人，J Mo/. MW., 8:567-572, 2001), DNA 序列分析(Sanger, F.等人，Prac. Ato/. Jrad Scf. 74:6463-5467, 1997),
蛋白截短检测(Hardy， C.A.， MeAoA Mo/. 5fo/.， 187:87-108， 2002),自动核苷 酸序列分析(Boutin, R等人，/^m. 7kfMto" 15(2):201-203, 2000),杂合体缺失 研究(Yang, Q.等人，C//". Ca"cer及仏，8:2890-2893, 2002),微卫星稳定性研究 (Furlan, D.等人，J!尸aAo/., 197:603-609, 2002),使用MALDI-TOF的基因分析 (Leushner ,五x戸/. to嵐Z)扭，1:11-18, 2001),通过杂交进行基因分析 (Wetmur， J.G" Critical Reviews in Biochem. Mol. Biol" 26:227-259, 1991),使用 DNA芯片进行基因分析(Goessl等人，f/ra/og);, 58:335-338， 2001; Zhou等人, Ca"cer及杠7>eW.， 66:217-224, 2001;韩国专利
发明者刘昭永, 李相烨, 柳元敏, 柳来春, 琴基昌 申请人:株式会社美迪基尼斯