表达TNF-α受体的间充质干细胞的制作方法

专利名称：：表达TNF-α受体的间充质干细胞的制作方法表达TNF-a受体的间充质干细胞本申请要求基于申请号为60A759,157的、于2006年1月13日提交的申请的优先权，优先权的内容全部并入作为参考。本发明涉及间充质干细胞。更具体地，本发明涉及表达肿瘤坏死因子-a(TNF-a)受体的间充质干细胞，特别是表达至少13pg/10e细胞的量的I型胂瘤坏死因子(TNF-a)受体(TNFR1)。所述间充质干细胞抑制淋巴细胞增殖。间充质干细月包(Mesenchymalstemcells,MSCs)是多能干细胞，其能轻易地分化成包括成骨细胞、肌细胞、软骨细胞以及脂肪细胞的多种谱系(lineage)(Pittenger等.，科学(Science).Vol.284,pg.143(1999);Haynesworth,等"骨(Bone).Vol.13,pg.69(1992);Prockop,Science.Vol.276，pg.71(1997))。体外研究已经证明了MSCs具有分化成肌肉(Wakitani,等.，肌神经(MuscleNerve)Vol.18,pg.1417(1995))、神经元样前体(Woodbmy，等.，神经科学研究(J.Neurosci.Res.).Vol.69,pg.908(2002);Sanchez-Ramos,等.，实马企4申经病学(Exp.Neurol)..Vol.171,pg.109(2001))、心肌细胞(Toma，等.，循环(Circulation).Vol.105，pg.93(2002);Fakuda,Artif.Organs.Vol.25,pg.187(2001))以及其他可能的细胞类型的能力。此外，MSCs已经被证实可以为造血干细胞扩增(expansion)提供有效的滋养层(Eaves,等.，纽约科学院年才艮(Ann.N.Y.Acad.Sci).Vol.938,pg.63師l);Wagers，等"基因治疗(GeneTherapy)■Vol.9,t)g.606(2002))。最近多种动物模型研究已经表明MSCs可能对骨、软骨、半月板或者心肌组织的损伤修复或者再生有用(DeKok，等.，ili床口腔埋植研究(Clin.OralImdantsRes)..Vol.14,pg.481(2003));Wu，等"移植(Transplantation).Vol.75，pg.679(2003);Noel,等"可调查研究药物的现有评i仑(Curr.Opin.Investig.Drugs).Vol.3，pg.1000(2002);Ballas,等.，鱼胞生物学副刊(J.Cell.Biochem.SUPPL).Vol.38,pg.20(2002);Mackenzie,等.，BloodCellsMol.Pis..Vol.27,pgs.601-604(2001))。若干研究者已经将MSCs用在动物疾病模型的移植中取得了令人振奋的结果。所述动物疾病模型包括成骨不全症(Pereira，等.，国家科学院学才艮(Proc.Nat.Acad.Sci.).Vol.95，pg.1142(1998))、帕金森综合征(Schwartz,等.，人类基因治疗(Hum.GeneThen).Vol.10，pg.2539(1999))、脊髓损伤(Chopp,等.，神经学寺艮道(Neuroreport).Vol.11，pg.3001(2000);Wu，等"神经科学研究(J,Neurosci.Res.).Vol.72,pg.393(2003))以及心脏紊乱(Tomita，等.，Circulation.Vol.100,pg.247(1999).Shake,等.，胸外科年才艮(Ann.Thorac.Surg.).Vol.73,pg.1919(2002))。重要的是，已有报道在治疗成骨细胞不全症(Horowitz,等.，血液(Blood).Vol.97,pg.1227(2001);Horowitz,等.Proc.Nat.Acad.Sci.Vol,99,pg.8932(2002))以及提高异源骨髓移植的移植物移入(Frassoni，等.，国际细胞治疗学会(Int.SocietyforCellTherapy).SA006(摘要)(2002);Koc,等:，J.临床肿瘤(Clin.Oncol)..Vol.18，pgs.307-316(2000))的临床实验中也取得了有前途的结果。此外，来自不同实验室的体外研究已经表明MSCs可以抑制T细胞增殖，不管是在混合的淋巴细胞培养物中还是通过其他刺激物如抗原和促细胞分裂剂(DiNicola,等.，Blood,Vol.99，pgs.3638-3843(2002);Tse,等.，Transplantation.Vol.75,pgs.389-397(2003)';Agga簡l，等"Blood.Vol.105，pgs.1815-1822(2005))。近期的体外数据进一步证明MSCs会降低前炎性细胞因子、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)以及干扰素-Y(IFN-y)的分泌，同时增加免疫细胞抗炎细胞因子白介素-10(IL-10)和白介素-4(IL-4)的产生。(Aggarwal,2005)。这些结果表明，由于免疫调节和抗炎的活性，MSCs能对治疗发生在移植物对抗宿主疾病(GVHD)、实体器官移植以及自身免疫疾病中的免疫应答疾病有益，所述自身免疫疾病如多发性硬化与类风湿性关节炎。证明MSCs用于急性GVHD的治疗效果的临床病例报告有力支持了这个假设(LeBlanc,等.，柳叶刀(TheLancet).Vol.363，pgs.1439-1441(2004))。TNF-a受体在间充质干细胞表面得到表达。累积的数据表明TNF-a是间充质干细胞功能的重要调控子。在培养物中孵育TNF-a和人间充质干细胞增量调节前列腺素E2(PGE2)和角质形成细胞生长因子(KGF)的分泌，诱导口引咮胺2,3脱氧酶(Indoleamine2,3deoxygenase,IDO)活性以及激发细胞迁移。TNF-a已经祐:证实在伤口和发炎部位存在，特别是在移植物对抗宿主疾病的目标器官中存在。(Koide，等.，Transplantation.Vol.64,pgs.518-524(1997);Kuroiwa,等.，临床研究(J.Clin.Invest).Vol.107,pgs.1365-1373(2001);Deans,等.，实验血液学(Exp.HematoL)Vol.28,pgs.875-884(2002);Ellison,等.，，床免疫学(J.Clin.Immunol)..Vol.24,pgs.197-211(2004))。因此，所述数据表明间充质干细胞的TNF-a受体的表达可能对免疫抑制、免疫调节、抗炎、组织修复或者伤口愈合的活性，以及迁移到发炎部位是至关重要的。存在两种类型的TNF-a受体，或者说TNFRs:I型(TNFRI),也被称为p55，以及II型(TNFRII)，也被称为p75。(Tartaglia,等.，Proc.Nat.Acad.Sci.Vol.88,pgs.9292-9296(1991))两种类型的TNF-a受体都存在于MSCs上；但是TNFRI是主要的类型。(Vancheri，等.，美国呼吸道细胞与分子生物学(Am.J.Respir.CellMol.Biol.),Vol.22,pgs.628-634(2000);Debets，等"鱼胞因子(Cytokine),Vol.8，pgs.80-88(1996)。)本发明现在将描述有关附图，其中图1是TNFRI表达以及MSCs体外抑制PBMC增殖能力之间的相互关系的图表；图2是显示保存在-80。C、-70°C、-60"€和-50。。下的人间充质干细胞的TNFRI表达的图表；图3是显示保存在-80。C和-50。C下的人间充质干细胞的TNFRI表达和生i抑制PBMC增殖的图表；以及图4是显示人间充质干细胞的TNFRI表达，所述人间充质干细胞保存在-135。C或更低温度下，并且随后被解冻，在室温下保存6小时、8小时、24小时或者32小时。根据本发明的一个方面，提供了一种包含间充质干细胞的组合物。所述间充质千细胞表达足以抑制淋巴细胞增殖的量的I型TNF-a受体(TNFR1)。在一个实施方式中，间充质干细胞表达至少13pg/10"田胞的量的TNFRI。在另一个实施方式中，间充质干细胞表达至少15pg/l()6细胞的量的TNFRI，在其他另一个实施方式中，间充质干细胞表达至少18pg/10S田胞的量的TNFRI.虽然本发明的范围不限于任何理论推理，申请人已经发现表达至少13pg/l(^细胞的量的I型TNF-a受体的间充质干细胞抑制淋巴细胞增殖。所述间充质干细胞在抑制免疫应答方面尤其有用，更特别地所述间充质干细胞在以下疾病的治疗中很有用移植物对抗宿主疾病；实体器官移植排斥诸如例如，心脏移植排斥、肝移植排斥、胰腺移植排斥、肠移植排斥和肾移植排斥；以及自身免疫疾病诸如例如类风湿性关节炎、多发性硬化、I型糖尿病、克罗恩氏病、传染性神经元炎、红斑狼疮、重症肌无力、视神经炎、牛皮痺、突眼性曱状腺肿、桥本氏病、奥德氏曱状腺炎(ord'sthyroiditis),再生障碍性贫血、莱特尔综合征、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、抗磷脂抗体综合征、眼阵挛-肌阵挛综合征、颞动脉炎、急性播散性脑脊髓炎、古德帕斯彻氏综合症、韦格纳氏肉芽肿病、乳糜泻、天疱疮、多关节炎、温型自身免疫性溶血性贫血与硬皮病。在一个实施方式中，间充质干细胞是从哺乳动物中获得。所述哺乳动物可以是灵长类，包括人类和非人类灵长类。间充质干细胞可以是同源混合物，或者可以是在MSCs中富含的混合的细胞群。同源的间充质干细胞混合物可以通过培养贴壁的髓细胞或者骨膜细胞获得，以及间充质干细胞可以通过特异性细胞表面标记来鉴定，所述细胞表面标记由唯一的单克隆抗体来鉴定。这里描述了用于获得间充质干细胞富集的细胞群的方法，比如，在美国专利第5,486,359号中描述的。可供选择的间充质干细胞的来源包括但不限于，血液、皮肤、脐带血、肌肉、脂肪、骨和软骨膜。在间充质干细胞培养物中表达的例如I型TNF-a受体的细胞TNF-a受体的量，可以由本领域技术人员已知的方法测定。这样的方法包括但不限于，例如定量酶联免疫吸附测定法。可以被理解的是，无论如何本发明的范围不被限制于任何特定的测定TNF-a受体的量的方法。在一个实施方式中，间充质干细胞培养物表达细胞TNF-a受体的量由酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定。在所述测定法中，来源于间充质干细胞培养物的细胞溶胞产物被加入ELISA板的孔里。所述孔可以被抗体包被，该抗体可以是单克隆抗体或者是多克隆抗体，该抗体抗TNF-a受体。然后洗涤该孔，接着和抗TNF-a受体的单克隆抗体或者多克隆抗体接触。所述抗体和合适的酶例如辣根过氧化酶结合。然后可以孵育所述孔，接着在孵育过程后洗涤所述孔。这些孔然后和合适的底物比如一种或多种色原接触。可以使用的色原可以包括但不限于，过氧化氬与四甲基联苯胺。加入所述底物之后，所述孔被孵育一段合适的时间。在完成孵育时，"停止，，溶液被加入到所述孔中以终止酶和底物的反应。接着测量样品的光密度(OD)。样品的光密度和包含已知量TNF-a受体的样品的光密度联系在一起，以测定待测间充质千细胞培养物中TNF-a受体的表达量。因此，本发明提供了用于选择表达至少13pg/10"田胞的量的I型TNF-a受体的间充质干细胞群的方法。所得被选择出来的间充质干细胞随后可以和合适的药物载体混合，用于治疗上文提到的疾病和紊乱。比如，间充质干细胞可以作为一种用于注射的细胞悬液给药，所述细胞悬液包括药学可接受的液体介质。本发明的间充质干细胞可以以有效量给药至动物，以治疗动物中的一种或多种上文提及的疾病或者紊乱。所述动物可以是哺乳动物，所述哺乳动物可以是灵长类，包括人类和非人类灵长类。所述间充质干细胞可以系统性地给药，诸如例如通过静脉内、动脉内或者腹膜内的给药。间充质干细胞给药的精确的剂量取决于多种因素，包括但不限于，病人的年龄、体重以及性别，接受治疗的疾病或者紊乱以及他们的程度和严重性。本发明接下来将通过以下实施例具体描述；然而，本发明的范围不限于这些实施例。实施例i为了研究TNFR1在hMSC免疫抑制中的作用，固SCs用TNFR1型反义寡核酸瞬时转染目的在于降低TNFR1的表达(Shen等.，J.Biol.Chem.,Vol.272,pgs.3550-3553(1997))。为了达到不同程度的TNFR1表达抑制，三种不同浓度的寡核苷酸被用于转染实验。没有被转染的MSCs和用正义寡核苷酸转染的MSCs被用作对照。hMSCs上的TNFR1表达通过ELISA在细胞溶胞产物中测定，并且TNFR1表达的减少在hMSCs抑制hPBMC体外增殖能力方面的作用得到了研究。来源于7位不同的供者、得自人骨髓的传代5(Passage5)次的MSCs被用于分析。细胞从骨髓抽取物中获得，并使用羟乙基淀粉分离。所述细胞接着通过5次传代培养，并^皮冷冻在标准的深低温保藏溶液中，该溶液在PlasmalyteA中包含5。/。人血清白蛋白(HSA)和10%二曱亚砜。(百特(Baxter))所述细胞在分析前于-80。C保存。在实验的当天，固SCs被解冻，计数，并以2.5x105细胞/孔的浓度置于6孔的组织培养板上。过夜孵育后，细胞被浓度为1.25ng/mL、2.5pg/mL和5|ig/mL的TNFR1正义寡核苷酸或者反义寡核苷酸按照制造商的转染试剂说明书转染。(英杰(Invitrogen)，Cellfectin转染试剂产品插入物)。转染后24小时，从板上收集细胞，一组细胞被溶解，细胞溶胞产物中表达的TNFR1通过ELISA按照sTNFRIELISA说明书分析(R&D系统，产品插入物)。TNFR1表达以每1x106细胞所表达的TNFR1的pg数来表征。为了进行ELISA测定，每孔2.5xl()SMSCs在孔中直接被溶解，通过使用250)^1/孔的细胞溶解哺乳动物细胞溶解/提取试剂(西格玛(Sigma)，分类号No.C-2978),其含有完全蛋白抑制剂组合物(罗氏(Roche))。接着所述细胞溶胞产物在艾本德(eppendorf)管中于U，000-M，000rpm下被离心10分钟，以从溶胞緩沖溶液中除去不溶解的物质。然后所述细胞溶胞产物被收集到一个新的试管中用于ELISA检测。一种细胞溶胞的可选方法，即，在试管中溶解细胞小球，也在冷冻细胞和从组织培养板或者培养瓶中收集细胞时进行。两种方法，直接在培养板中溶解细胞和在试管中溶解细胞小球，给出了可对比的结果。一种商业上可供的ELISA试剂盒，Quantikine,人类sTNFRI(分类号No.DRT100,R&D系统)被用于在细胞溶胞产物中检测TNFR1。该检测提供了溶解的以及细胞-联合的TNFR1的测量(Qjwang，等.，生物化学(Biochemistry).Vol.36,pg.6033(1997))。该实验使用了定量的三明治酶免疫测定技术。该实验使用了微量培养板，其包括了预先包被有对TNFR1特异性的单克隆抗体的小孑L。存在于校准器(calibrator)样品、质量控制样品或者MSC细胞溶胞产物样品中的TNFR1被固定的TNFR1抗体所捕获。清洗掉所有未结合的底物后，对TNFR1特异性的酶联的多克隆抗体被加入到孔中。在除去所有未结合的酶联抗体的清洗步骤后，底物溶液被加入到所述孔中，接着与结合的TNFR1的数量成比例地显色。然后中止显色，颜色的强度通过使用酶联吸附测定读数器测量。ELISA的具体细节在下文给出。50nl的检测稀释剂HDl-7、含有防腐剂的緩冲蛋白质基底(bufferedproteinbase),;故加入到ELISA平板的孔中。所述孔包#1有对TNFRl特异性的单克隆抗体。然后200)il的校准器(calibrator)样品(包含500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml或7.813pg/ml的可溶人类TNFRI)、质量控制样品(包含45pg/ml、100pg/ml或250pg/ml人类TNFRI)，或者细胞溶胞产物被加入到孔中。在将校准和质量控制样品加入到孔里前，如前文所述，所述样品用细胞溶解的哺乳动物细胞溶解萃取剂(sigma)和完全蛋白质抑制剂组合物(Roche)处理。然后所述板上覆盖粘合带，在室温下孵育2小时士10分钟。接着通过在水池上方翻转所述平板，使每个孔里的液体倒出，接着洗涤板三次。每次洗涤板每孔加入400(il/孔的洗涤緩冲液。残余液体通过翻转板和吸干除去。然后每个孔加入200^1可溶解的与辣根过氧化酶结合的TNFRI多克隆抗体。所述板在室温下粹育2小时士10分钟。接着把每个孔里的液体倒出，每个孔用如上所述的400^1洗涤緩沖液洗涤。然后将200pl的固定的过氧化氢和固定的四甲基联苯胺色原的底物溶液加入到每个孔中。所述板接着在室温黑暗中孵育20土10分钟。接着在每个孔中加入5(Hd2N的硫酸溶液。然后每个样品的光学密度(OD)在30分钟内用450nm测试滤波器和570nm的参照滤波器测量。接着将光学密度值和样品中的细胞溶胞产物的TNFR1的数量联系在一起。通过比较同时测定的MSC细胞溶胞产物样品的信号和TNFR1标准，完成定量。每一轮ELISA运行提供了校准曲线并包括了在检测样品前和后的双份的质量控制样品。质量控制样品被用于ELISA运行可靠性判定。TNFR1表达数据用每lx106细胞的受体皮克数来表征。原始的数据(用pg/ml)反应了每lxl(^细胞的TNFR1的皮克数(2.5x105细胞被溶解在250jil的溶解试剂中，因此相当于lx106细胞/ml)用于校准样品的ELISA值在下面的表1中给出。表l用于ELISA运行的校准标准的计算<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*注释:OD-光学密度；％DFT-%和理论值的差别；％CV-%差异系数质量控制样品的ELISA值在下面的表2给出。表2.用于ELISA运行质量控制(QC)样品的计算<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*注释OD-光学密度；％DFT-°/。和理论值的差别；Q/。CV-。/。差异系数基于如上表1和表2所示的校准样品和质量控制样品的ELISA值，来自供者的间充质干细胞的样品的TNFR1表达以每lxl()S细胞的pg数得到测定。如上所述，每位供者的间充质干细胞是没有转染的，或者是用1.25pg/ml、2.5|ig/ml或5昭/ml浓度的TNFRl正义的或者反义的寡核苷酸转染。ELISA值和来自每一供者的每份间充质千细胞样品的TNFRl表达量在下面的表3中给出。表3.检测样品的ELISA数值<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*注释这些值表示平均TNFR1数(从表3，第8栏"TNFR1以每10'细胞的pg数表示")周围所有的数。名不同供者的人类PBMC用于这次检测。按照该制造商的说明书用菲可帕克梯度离心(安玛西亚生物7>司(AmershamBiosciences)，菲科帕克+产物插入物(Ficoll-PaquePlusproductinsert))从外周血中分离出外周血单核细胞(PBMC)。检测前，细胞在-80°C下于包含90%FBS和10%DMSO的介质中保存。在实验当天，hPBMC被解冻、计数并以1x105细胞/孔与hMSCs(1x104细胞/孔)一起置于96孔的组织培养板上。抗-CD3(1pg/mL)和抗-CD28(1吗/mL)抗体的组合物被用来刺激淋巴细胞增殖，所述淋巴细胞增殖代表了GVHD和同种异体器官排斥的免疫细胞活化特性的体外模型(Trickett，等,免疫学方法(J.Immunol.Methods).Vol.275，pgs.251-255(2003);Koulova，等，实验医学杂志(J.Exp.Med.).Vol.173,No.3,pgs.759-762(1991);Foster,等，Transplantation.Vol.76,No.6;Czitrom,临床骨-牛及相关研究(Clin.Ortho.RelatRes.).Vol.326,pgs.11-24(1996))。然后所述板在包含5%C02的潮湿空气中孵育。通过添加1pCi/孔的[曱基JH]-胸腺嘧咬核苷用于最终18-20小时的培养，在开始培养的第五天测定单独PBMC的增殖和在MSC存在的情况下PBMC的增殖。在标记之后，使用96孔板收获器(harvester)将细胞转移到玻璃滤器上，通过液体闪烁P计数器测定摻入的DNA的放射性。以每分钟计数(cpm)表示的[曱基-3司-胸腺嘧啶核苷向DNA中的摄取代表了hPBMC的增殖。最终结果表示为。/。PBMC在MSC存在下的增殖抑制率，其计算为層％画/"#遂(P皿C+MSC,c拜」jc層潜遂f皿C，_/每位供者的间充质干细胞的结果在下面的表5中给出。表5.用反义寡核苷酸和对照(正义寡核苷酸)转染的hMSC对CD3/CD28诱导的hPBMC的增殖抑制7名被测试的hMSC供者的汇总表<table>complextableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注释ND-没有数据上述关于CD3/CD28诱导的PBMC的增殖抑制的数据和上文表4所示的TNFRl的平均表达数据相关。关于平均TNFRl表达和CD3/CD28诱导的PBMC的增殖抑制的关系在下面的表6中给出。表6.TNFRl的表达和用TNFRl寡核苷酸转染的hMSC在体外对hPBMC增殖的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>这些实验的结果表明体外有着降低的I型TNFR(TNFRl)表达的hMSC失去了其体外抑制hPBMC增殖的能力。这些数据支持了这样的预测，即TNFRl的表达和MSC对PBMC增殖的抑制有重要的联系。因此，TNFRl可以作为MSC免疫调节活性的效价标志。基于已经获得的数据，每lxl0S田胞13.07pg的TNFRl(平均丄SD)的效价阔值，与少于50%hPBMC的增殖抑制相关(表6，附图l)。因此，无效力的MSC是那些每lxl0S田胞TNFRl表达少于13pg的细月包。实施例2TNFRl是hMSC功能的温度敏感的标记。在体外处理哺乳动物细胞被包括温度的许多因素所限制。比如，低于-80±5。C的低温，或者更低，然而低至-135。C或更低(液氮)是保存细胞所要求的。但是体外细胞增殖需要37土0.5。C的温度。细胞暴露于最佳温度范围之外可能会导致细胞功能降低或者细胞死亡。哺乳动物细胞可以经受住短期的较小的温度波动；然而，每一种细胞都有自己的细胞培养维持、装运和保存的温度承受范围。hMSC上TNFR1的表达水平和hMSC免疫抑制活性相关。hMSC的TNFRl表达水平少于13pg/l()S细胞已经被测定为阈值，在此之下固SC开始失去其抑制免疫应答的能力(参见图l)。因此，TNFRl的表达是hMSC免疫抑制的标记，TNFRl的表达是一种活性，所述活性被认为是MSC对有效治疗GVHD、器官排斥、自身免疫疾病和其他疾病中发生的免疫应答所必需的。这里，研究了在冷冻hMSC的保藏过程中的温度波动以及在室温下的暴露时间对hMSC上表达TNFRl的影响。保存温度的波动对TNFRl表达和hMSC免疫抑制潜能的影响这些实验的目的是研究hMSC在-80。C以上的温度中暴露后，其保持功能特点的能力，所述温度不是最佳的保存冷冻细胞的温度。5次传代的人MSCs被冷冻并放入-80土5。C的冷冻器中。几个星期后，从-80土5。C的冷冻器中取出冷冻细胞袋，接着放置在-70土5。C、-60土5。C或-50土5。C的温度中72±2小时。72±2小时后，在解冻和分析之前，将袋子重新保存在-80土5。C下至少24小时。将一组袋子从-80±5。C的冷冻器移动到另外一个-80±5°C的冷冻器，其他的袋子进行一样的程序，作为对照用。在实验的当天，解冻装有细胞的袋子，计数细胞，如在实施例1中所描述的那样制备细胞溶胞产物用于TNFR1ELISA。结果汇总在图2中(条块表示3个hMSC袋子的TNFR1平均值土SD)。这些数据表明hMSC暴露在-60土5。C或者-50±5°(:的温度下降低TNFR1的表达水平由ELISA所检测出来的TNFR1水平低于确定的hMSC效价阈值13pg/l(^细胞(由图表中的实线表示)。和TNFR1测量相似，两个保存在-80土5。C(最佳的保存温度作为对照)以及-50土5。C(相当于比-80土5。C的最佳保存温度高出+30。C)的装有hMSC的袋子被用来研究hMSC的免疫抑制活性。MSC体外抑制抗-CD3/CD28诱导的hPBMC增殖的能力如实施例1中所描述的那样测定。结果显示保存在-50+5。C的hMSC丧失了其抑制hPBMC增殖的能力，然而保存在-80土5。C的细胞抑制hPBMC的增殖达92%(图3,深色条块表示量化的数值)。MSC的免疫抑制活性取决于TNFR1的表达水平表达多于确定的MSC免疫抑制效价阈值——13pg/l(f细胞的TNFR1的细胞，具有生物学活性，TNFR1水平低于13pg/l(f细胞的细胞没有生物学活性(图3,浅色条块表示TNFR1表达水平的平均+SD。浅色条块内的数字表示量化的数值)。因此，非最佳保存温度降低了hMSC上TNFR1的表达，并且与固SC的功能降低相关。细胞在室温下暴露的时间对hMSC上TNFR1的表达的影响该实验的结果是在非最佳保存温度下暴露后，hMSC上TNFR1表达降低的附加证据。在该实验中，研究了细胞悬液在室温下保存对TNFR1的表达的影响。两套hMSC用于该实验。包含hMSC的袋子在实验前保存在《-135。C温度下。在实验当天，这些细胞被解冻并用PlasmalyteA生理溶液稀斷BAXER),所述稀释以模拟现有的用于在临床位点静脉内hMSC给药的细胞处理的方式进行。解冻并稀释后的hMSC在室温下保存(22°C-24°C)，取样并检测解冻后0(解冻后的瞬时基线)、6、8、10、24和32小时的TNFR1的量。结果显示暴露在室温下的固SC降低了hMSC上的TNFR1表达水平(图4,条块表示2套hMSC的TNFR1表达水平的平均土SD值。实线表示hMSC的效价阈值——13pg/10S田胞的TNFR1表达水平)。在24小时和32小时观察到显著的TNFR1表达水平下降，它和细胞活力的显著降低关联(20%以下，数据没有显示)。因此，上述实验表示hMSC的TNFR1表达对温度敏感，并且TNFR1可以作为在保存、装运或者细胞操作过程中，暴露在非最佳保存温度下的hMSC的功能标记。这里所有专利、公开出版物，包括公开了的专利申请、保藏编号和数据库登录号中揭示的内容此处并入作为参考，在同样程度上等同每个专利、出版物、保藏编号与数据库登录号具体个别地并入作为参考。应当理解的是，无论如何本发明的范围不限于上述的具体实施例。本发明除了具体描述的之外可以实践，仍在的权利要求中的范围内。权利要求1.一种组合物，其包含间充质干细胞，其中，所述间充质干细胞表达至少13pg/106细胞的量的I型TNF-α受体。2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述间充质干细胞表达至少15pg/l(^细胞的量的I型TNF-a受体。3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述间充质干细胞表达至少18pg/106细胞的量的I型的TNF-a受体。4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述间充质干细胞是人间充质干细月包。5.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含了可接受的药学载体。6.—种获得表达至少13pg/10"田胞的量的I型TNF-a受体的间充质干细胞的方法，其包括从至少一个供者获得至少一个包含间充质干细胞的细胞群；测定每个所述的至少一个或多个细胞群中的间充质干细胞所表达的I型TNF-a受体的量；以及选择表达至少13pg/l(^细胞的量的I型TNF-a受体的间充质干细胞。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述被选择的间充质干细胞表达至少15pg/106细胞的量的I型TNF-a受体。8.根据权利要求7所述的方法，所述被选择的间充质干细胞表达至少18pg/106细胞的I型的TNF-a受体。9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述间充质干细胞是人间充质干细胞。全文摘要本发明涉及表达至少13pg/10⁶细胞的量的I型TNF-α受体的间充质干细胞。所述间充质干细胞抑制淋巴细胞的增殖，特别是可以应用到移植物对抗宿主疾病的治疗中。文档编号C12N5/00GK101370930SQ200780002287公开日2009年2月18日申请日期2007年1月5日优先权日2006年1月13日发明者米歇尔·马塞利诺,罗德尼·蒙罗伊,艾丽西亚·蒂雷尔,西蒙·比布尼克,阿拉·丹尼尔科维奇,黛安娜·卡特申请人:奥西里斯治疗公司