作为上皮来源的癌症的生物标记物的adamts-7的制作方法

专利名称：作为上皮来源的癌症的生物标记物的adamts-7的制作方法
作为上皮来源的癌症的生物标记物的ADAMTS-7相关申请的交叉引用
本申请要求2005年2月17日提交的美国临时专利申请No. 60/653,818的35U.S.C. § 119 (e)之下的权益。发明领域
本发明涉及通过评定从患者获得的生物样品ADAMTS-7的水 平用于上皮来源的癌症的诊断和预后的方法。 发明背景
癌症存活率中最重要的因素之一是在早期的检测。检测癌症早 期事件的临床分析提供了介入和防止癌症发展的机会。随着基因描绘和 蛋白质组的发展，在可用于诊断和预测特定癌症的分子标记物或"生物 标记物"的鉴定方面有了显箸的进展。例如，对于前列腺癌来说，抗原 PSA (前列腺特异性抗原)可以在血液中检测，是存在前列腺癌的指示。 因而，存在前列腺癌风险的男性的血液可以快速、容易和安全地筛选提 高的PSA水平。
虽然在癌症检测领域存在着显箸的进展，本领域仍然需要鉴定 可以容易地用于临床应用的用于各种癌症的新的生物标记物。例如，迄 今为止，对于使用易于检测的生物标记物诊断乳腺癌，存在着相对较少 的可用选择。EGFR的过量表达，特别是伴随着雌激素受体的减量调节， 是乳腺癌患者中不良预后的标志.乳腺癌的其他已知标记物包括血液中 高水平的M2丙酮酸激酶(M2PK)(美国专利NO. 6,358,683 )、血液 中高的ZNF217蛋白水平(WO 98/02539)以及对于诊断有用的、乳腺 癌中新近鉴定的蛋白质PDEBC的差异表达(美国专利申请No. 20030124543 )。这些生物标记物提供了诊断的可选择方法，然而，它 们没有被广泛地使用。此外，尽管使用许多组织化学遗传学的和免疫学 的标记物，临床医师仍然难以预测那些肿瘤将转移到其他器官。[OO习生物标记物的鉴定对于改善诊断、预后以及疾病的治疗是特别 相关的因而，本领域需要鉴定可以快速、容易和安全地检测的选择性 的生物标记物。这样的生物标记物可以用于诊断、分期、或监视患有癌
症的个体的进展或治疗，特别是疾病的侵入性的、可能的转移阶段。 发明概述
本发明基于这种发现，ADAMTS-7蛋白存在于尿液中，在患 有乳腺癌、前列腺、膀胱癌、脑癌和肝脏癌症的患者中ADAMTS-7表 达和活性被增量调节。因而，本发明涉及预后评估的方法、便于诊断上 皮来源的癌症的方法，和治疗效力的标记物。特别地，在生物样品例如 尿液中检测的ADAMTS-7蛋白的存在预测了癌症的存在，因为 ADAMTS-7蛋白在健康个体中不以显著性水平检测到。因而，测量生物 样品(例如尿液或血液)中ADAMTS-7的存在或不存在提供了快速、 容易和安全的筛选，其可用于患者中上皮来源的癌症，例如前列腺、乳 腺、肝脏、脑或膀胱癌症的诊断和预后。
在一个实施方式中，提供了一种方法，用于便于患者中上皮来 源的癌症的诊断。所述方法包括从患者获得生物样品，检测所述生物样 品中ADAMTS-7 (或其片段)的存在或不存在，其中ADAMTS-7的存 在是存在上皮来源的癌症的指示。
在另 一个实施方式中，所述方法包括测量来自患者的测试生物 样品中存在的ADAMTS-7水平，并比较观察到的ADAMTS-7水平与相 同类型的对照样品存在的ADAMTS-7水平。与对照样品相比在测试样 品中更高的ADAMTS-7水平，是癌症的指示。优选的，本发明的方法 用于上皮来源的癌症的早期检测。例如，可以在年度体检期间由医师来 筛选患者。
术语"对照样品"是指从相信不患有癌症的"正常的"或"健 康的"个体获得的生物样品。对照物可以使用本领域公知的方法来选 择。 一旦很好地确定了对照群体的水平，来自测试生物样品的阵列结果 可以直接与已知的水平比较。[OOIO]术语"测试样品"是指从要检测上皮来源的癌症的患者获得 的生物样品。[OOll]例如，生物样品可以获自血液、组织(例如肺瘤或乳腺)、 血清、大便、尿液、痰、脑脊液、乳头吸出物和细胞溶胞产物的上清液。 一种优选的生物样品是尿液。
在一个方面，要诊断的上皮来源的癌症是乳腺癌、基底细胞
癌、腺癌、胃肠道癌症，例如唇癌、口腔癌、食道癌、小肠癌症和胃癌、 结肠癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卯巢癌、子宫颈癌、肺癌和皮肤癌， 例如扁平细胞和基底细胞癌症、前列腺癌、肾脏细力包癌，和其他影响整 个身体的上皮细胞的已知的癌症。
本发明进一步预期评定ADAMTS-7水平来监视被设计以治 疗患有上皮来源的癌症的患者的治疗方案的治疗效力。
在一个优选的实施方式中，所述生物样品是尿液样品。然而， 也可以使用血液、组织、血清、大便、痰、脑脊液、乳头吸出物和细胞 溶胞产物的上清液的生物样品。
在本发明的一个方面中，通过用特异性结合ADAMTS-7蛋白或其部分的基于抗体的结合部分接触测试样品或其制备物来测量生物 样品中存在的ADAMTS-7水平。基于抗体的结合部分与ADAMTS-7形 成可以被检测的复合物，从而容许测量ADAMTS-7的水平。
基于抗体的免疫分析是测量ADAMTS-7蛋白水平的优选的方式。然而，可以使用本领域技术人员已知的任何方法来评定 ADAMTS-7水平。例如，在某些实施方式中，通过测量ADAMTS-7 mRNA 转录产物Cyr61水平来分析ADAMTS-7表达水平。做为选择，通过质 谱法，包括SELDI质谱法来评定ADAMTS-7水平。ADAMTS-7水平也 可以通过生物学活性分析，包括但不限于基质凝力交电泳(zymography) 来评定。
在进一步的实施方式中，本发明提供了试剂盒，其包含用于 测量生物样品中的ADAMTS-7的手段。
在另一个实施方式中，提供了指导个体的治疗的方法。所述 方法包括让个体测试获自所述个体的生物样品中的ADAMTS-7的存 在，其中临床医师审查该结果，如果对于ADAMTS-7的存在所述生物 样品是阳性的，所述临床医师因而指导所述个体治疗。所述测试可以在 所述个体居留的同一国家、或在其他国家进行，所述结果例如通过网站 变为可用的，或被传送给临床医师。
下文中公开了本发明的其他方面。附图的简要说明
附随的图画，合并到本说明书中并作为本说明书的一部分，
与说明书一同说明了本发明的实施方式，用来解释本发明的目的、益处和原理。
附

图1显示了通过zymography在来自膀胱癌患者的尿液中约 190 kDa高分子量明胶酶种类的存在。
附图2A和2B显示了来自膀胱癌患者尿液的约190kDa高分 子量明胶酶种类的部分纯化。附图2A，酶语。附图2B，银黄染色凝胶。
附图3显示了富集了 HMW明胶酶种类的样品用Sypro Ruby Stain染色的SDS-PAGE。
附图4显示了 ADAMTS-7的氨基酸序列(SEQIDNO: 1 )。
附图5A和5B显示了在来自癌症患者的尿液样品中通过 zymography的ADAMTS-7检测，和它在获自健康个体的尿液样品中的 缺乏。附图5A,在来自癌症患者的尿液样品中高MW明胶酶种类的明 胶酶谱；第一泳道代表分子量标记物(MW) ， l-9指示的泳道代表来自 单独的患者的尿液样品，使用50 yL未浓缩的尿液，泳道l是来自前 列腺癌患者的尿液样品，泳道2是来自脑癌患者的尿液样品，泳道3是 来自膀胱癌患者的尿液样品，泳道4是来自乳腺癌患者的尿液样品，泳 道5是来自乳腺癌患者的尿液样品，泳道6是来自肝癌患者的尿液样 品，泳道7是来自肝癌患者的尿液样品，泳道8是来自乳腺癌患者的尿 液样品，以及泳道9是来自乳腺癌患者的尿液样品。箭头指向大约190 kDa的ADAMTS-7。附图5B显示了来自正常的年龄/性别匹配对照、没 有癌症的患者的尿液样品的平行zymographic分析。在所有情况下 ADAMTS-7是不可检测的。
附图6A和6B显示了在来自患有或不患有癌症的患者的尿液 样品中ADAMTS-7蛋白的代表性的免疫印迹染色。附图6B,在4-12% 梯度SDS-PAGE凝胶上跑动的来自癌症患者的尿液分析泳道l，来自 前列腺癌患者的浓缩的尿液样品，泳道2，来自前列腺癌患者的浓缩的 尿液样品，泳道3,来自乳腺癌患者的浓缩的尿液样品，泳道4,来自 乳腺癌患者的浓缩的尿液样品，泳道5,来自膀胱癌患者的浓缩的尿液 样品，泳道6,来自乳腺癌患者的浓缩的尿液样品，泳道7,来自乳腺 癌患者的浓缩的尿液样品，泳道8，来自乳腺癌患者的浓缩的尿液样。 附图6B显示了来自正常的年龄/性别匹配对照、没有癌症的患者的浓缩 尿液样品的平行免疫印迹分析。在来自患有乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌
的患者的尿液样品中检测到190kDa种类。 发明详述
我们发现，患者的生物样品中存在的ADAMTS-7水平与上皮 来源的癌症的存在或不存在相关。
如在此使用的，"上皮来源的癌症"是指由上皮细胞产生的 癌症，其包括但不限于，乳腺癌、基底细胞癌、腺癌、胃肠癌、唇癌、 口腔癌、食道癌、小肠癌和胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵 巢癌、子宫颈癌、肺癌、乳腺癌和皮肤癌，例如扁平细胞和基底细胞癌、 前列腺癌、肾脏细胞癌、和其他影响整个身体的上皮细胞的已知癌症。
术语"侵略性的"或"侵入的"对于癌症是指肿瘤扩展超过 它的边界进入邻近组织的倾向(Darnell, J.( 1990), Molecular Cell Biology, Third Ed., W. H. Freeman, NY)。侵入性癌症可以与器官限制的癌症形 成对照，其中肿瘤被限制在特定的器官。肿瘤的侵入性质常常伴有蛋白 水解酶的作用，例如胶原酶，其降解基质和基底膜材料来允许肿瘤扩展 超出被嚢的限制，并超出肿瘤位于其中的特定组织的限制。
如在此使用的术语"转移，，是指癌症从起源器官向患者中其 他远端位点的散布的情况。肿瘤转移的过程是多级的事件，涉及局部侵 入和细胞间基质的石皮坏、进入血管的入血管内渗、淋巴的或其他通道的 转运、在循环中的存活、在第二位点中的血管的出血管渗出，以及在新 位置的生长(Fidler,等人,Adv. Cancer Res. 28, 149-250 ( 1978 ) ， Liotta, et al, Cancer Treatment Res. 40， 223-238 ( 1988 ), Nicolson, Biochim. Biophy. Acta948,175-224( 1988 )和Zetter,N. Eng. J. Med. 322, 605-612( 1990))。提高的恶性细胞运动性已经与动物以及人类肿瘤中增强的转移可能性 相关联(Hosaka,等人，Gann 69, 273-276 ( 1978)和Haemmerlin, et al, Int. J. Cancer 27, 603-610 ( 1981 ))。
如在此使用的，"生物样品"是指从患者、优选的人类患者 获得的生物材料的样品，包括组织、组织样品、细胞样品(例如，组织 活检，例如穿刺活检、刷试活检、表面活检、针吸活检、穿孔活检、切 除活检、开口活检、切割活检或经内窥镜活检)和肿瘤样品。生物样品 还可以是生物液体样品。在一个优选的实施方式中，所述生物样品是尿 液。然而，也可以使用血液、血清、唾液、脑脊液、乳头吸出物和细胞
溶胞产物的上清液。
本发明还包括在本发明的方法中使用生物样品的分离物。如在此使用的，生物样品的"分离物"(例如，组织或肿瘤样品的分离物) 是指一种材料或组合物(例如，生物材料或组合物)，其以及从样品分离、衍生、提取、纯化或分离，并且优选的基本上没有不希望的与该生 物样品相关的组合物和/或混杂物或杂质。
在优选的实施方式中，所述生物样品被处理以防止 ADAMTS-7蛋白或ADAMTS-7 mRNA的降解。抑制或防止降解的方法 包括但不限于，用蛋白酶或RNAase抑制物处理生物样品、冷冻生物样 品或将生物样品置于冰上。优选的，在分析之前，将生物样品或分离物 持续地保持在条件下以防止ADAMTS-7蛋白或ADAMTS-7 RNA的降 解。
如在此使用的，"组织样品"是指从个体、优选的人类个体 的完整组织获得或移除的组织的部分、碎片、局部、片段或级分。 一种 优选的组织样品是乳腺组织。
如在此使用的，"胂瘤样品，，是指肺瘤，例如从个体、优选 的人类个体获得或移除(例如，从个体的组织移除或提取的)的肿瘤的 部分、碎片、局部、片段或级分。
如在此使用的，"原发肿瘤"是在患者体内的第一位点出现 的肿瘤，可以不同于"转移性肿瘤"，其在远离原发肿瘤的远端位点出 现在个体的身体中。
如在此使用的，"LCIS"是指小叶原位癌。LCIS也称为小叶 瘤形成，有时被分类为非扩散乳腺癌的种类。它不渗透穿过小叶的壁。 虽然它本身通常不变为侵入性的癌症，有这种状况的女性具有在同一个 或对侧乳腺中发展侵入性乳腺癌的更高的风险。
如在此使用的，"DOS"是指导管原位癌。导管原位癌是最 常见的非扩散乳腺癌种类。在DCIS中，恶性细胞已经转移通过导管的 壁进入乳腺的脂肪组织。粉刺状癌是一种DCIS，其比其他种类的DCIS 更可能在乳房肿瘤切除术后回到相同的区域，并且与其他形式的DCIS 相比更紧密地关联着侵入性导管癌的最终发展。
如在此使用的，"ADAMTS-7"是指Genebank登记号protein, NP—055087.2 ( Homosapiens ) ( SEQ ID NO: 1 )(附图4 )的ADAMTS-7
蛋白。ADAMTS-7是具有1型凝血栓蛋白基序7的disintegrin样和金属 蛋白酶(reprolysin型)。术语"ADAMTS-7"还涵盖物种变体、同源物、等位形式、突变形式和其等同物。本发明涉及便于在患者中诊断上皮来源的癌症的方法。在一 个实施方式中，所述方法包括从患者获得生物样品，检测所述生物样品 中ADAMTS-7 (或其片段)的存在或不存在，其中ADAMTS-7的存在 是存在上皮来源的癌症的指示。在另一个实施方式中，所述方法包括测量从怀疑患有癌症的 患者获得的测试样品中的ADAMTS-7水平，比较观察到的水平与对照 样品中分析的ADAMTS-7水平，所述对照样品例如从相信不患有癌症 的单个患者或个体群体获得的样品。ADAMTS-7的水平高于正常的对照 中观察到的水平指示癌症的存在。ADAMTS-7的水平可以通过任何单位 来表示，例如，从密度计、活性分析或Elisa平板读数器获得的单如在此使用的，"与对照样品中的水平相比在测试样品中更 高的ADAMTS-7水平"是指ADAMTS-7的数量，其高于对照样品中存 在的ADAMTS-7数量。术语"更高水平"是指一种水平，其统计学上 显著地或显著地高于对照样品中发现的水平。优选的，"更高水平"是 至少2倍或更高。术语"统计学上显著的"或"显著地"是指统计显著性，一 般意味着两倍标准误差(2SD)在正常的标记物浓度之上，或更高。为了比较的目的，测试样品和对照样品是相同的类型，也就 是，获自相同的生物来源。然而，对照样品也可以是标准样品，其含有 与获自健康个体的相同类型生物样品中通常发现的相同浓度的 ADAMTS-7。例如，对于通常在生物样品例如尿液、血液、脑脊液或组 织中发现的ADAMTS-7数量，可以有标准的正常对照样品。在本发明的一个方面，可以进行第二诊断步骤。例如，如果 发现ADAMTS-7水平指示癌症存在，则可以进行检测所述癌症的其他 方法来确认癌症的存在。可以使用各种其他的诊断步骤的任一种，例如 乳房造影法(乳腺癌)、超声、PET扫描、MRI或任何其他成像技术、 活组织4全查、临床4全查、ductogram或4壬<可其他方法。本发明的方法对于确定患有癌症的患者的适当疗程也是有用 的。治疗过程是指在诊断之后或在治疗癌症之后对患者采取的治疗办
法。例如，确定癌症复发、散布或患者存活的可能性，可以帮助确定是 否应当采取更保守的或更激进的方法来治疗，或者是否应当组合治疗形 式。例如，当癌症复发是可能的时，有益的是在外科治疗之前或之后进 行化学疗法、放射、免疫治疗、生物学修饰治疗、基因治疗、疫苗等等， 或在患者被治疗期间调整时间跨度。
ADAMTS-7水平可以通过本领域技术人员已知的任何方法来 测量。在本发明中， 一般优选的是使用抗体、或抗体等同物来检测生物 标记物蛋白的水平。然而，也可以使用用于生物标记物表达的检测的其 他方法。例如，通过分析mRNA转录产物可以监视ADAMTS-7表达水 平。例如，当生物样品是肺瘤或组织样品时，测量ADAMTS-7 mRNA 是优选的。
评定mRNA水平的方法是本领域技术人员^^知的。例如，通 过Northern印迹可以实现RNA转录产物的检测，其中RNA的制备物在 变性琼脂糖凝胶上跑动，转移到适合的支持物，例如活化的纤维素、硝 化纤维或玻璃或尼龙膜上。标记的(例如，放射性标记的)cDNA或RNA 然后与所述制备物杂交，洗涤，并通过例如放射自显影的方法来分析。
RNA转录产物的检测可以进一步使用已知的扩增方法来实 现。例如，在本发明的范围内的是将mRNA逆转录成cDNA，随后聚合 酶链式反应(RT-PCR);或如美国专利No. 5,322,770描述的对两个步 骤使用单个酶，或将mRNA逆转录成cDNA，随后对称性缺口脂肪酶链 式反应(RT画AGLCR)，如R. L. Marshall，等人，PCR Methods and Applications 4: 80-84 ( 1994 )所描述的。在参考文件Pabic et. al. Hepatology, 37 ( 5 ) : 1056-1066， 2003中描述了才企测ADAMTS-7 mRNA 转录产物的一种适合的方法，通过将完全引用将其合并在此。
可以在此使用的其他已知的扩增方法包括但不限于在PNAS USA 87: 1874-1878 ( 1990)中描述的和也在Nature 350 (No. 6313): 91-92 ( 1991 )中描述的所谓"NASBA"或"3SR"技术；在欧洲专利申 请(EPA)No. 4544610中描述的Q画P扩增；链置换扩增，如G. T. Walker 等人，Clin. Chem. 42 : 9画13 ( 1996)和欧洲专利申请No. 684315所描述 的；以及目标介导的扩增，如PCT公开WO 9322461所描述的。
还可以采用原位杂交可视化，其中放射活性标记的反义RNA
探针探针与活检样品的薄片杂交，洗涤，用RNase裂解，并暴露于感光 乳剂用于放射自显影。样品可以用苏木精染色来表现样品的组织学组 成，使用适合的滤光器暗视野成像来显示发展的乳剂。也可以使用非放 射性标记，例如毛地黄毒苷。
做为选择，可以在DNA阵列、芯片或微阵列上检测mRNA 表达。相应于ADAMTS-7的寡核苷酸被固定在芯片上，芯片然后与从 患者获得的测试样品的标记的核酸杂交。用含有ADAMTS-7转录产物 的样品获得阳性的杂交信号。制备DNA阵列的方法和它们的使用是本 领域公知的。(参见，例如，美国专利NO.: 6,618,67%; 6,379,897; 6,664,377; 6,451,536; 548,257; U.S. 20030157485和Schena等人，1995 Science 20:467-470; Gerhold等人，1999 Trends in Biochem. Sci. 24, 168-173;和Lennon等人，2000 Drug discovery Today 5: 59-65,通过完全引用 将它们合并在此)。也可以进行基因表达的系列分析(SAGE)(参见 例如美国专利申请20030215858)。
为了监视mRNA水平，例如，从要测试的生物样品提取 mRNA,逆转录，产生荧光标记的cDNA探针。能够与ADAMTS-7 cDNA 杂交的微阵列然后使用标记的cDNA探针来试探，扫描载玻片，测定荧 光强度。这种强度与杂交强度和表达水平相关。
特别地，当生物样品是液体样品例如血液或尿液时，也可以 测量ADAMTS-7蛋白水平或ADAMTS-7活性。在一个实施方式中， ADAMTS-7蛋白的水平通过使生物样品与基于抗体的结合部分接触来 测量，所述基于抗体的结合部分特异性地结合ADAMTS-7或ADAMTS-7 的片段。然后检测抗体-ADAMTS-7复合物的形成作为ADAMTS-7水平 的度量。
术语"基于抗体的结合部分"或"抗体"包括免疫球蛋白分 子和免疫球蛋白分子的免疫活性决定簇，例如，含有特异性结合(免疫 反应)ADAMTS-7、或本发明的其他生物标记物的抗原结合位点的分 子。术语"基于抗体的结合部分"意图包括完整的抗体，例如，任何同 种型的抗体(IgG、 IgA、 IgM、 IgE,等等)，并包括也特异性地与ADAMTS-7 蛋白反应的其片段。抗体可以使用常规技术来片断化。因而，该术语包 括抗体分子的蛋白水解裂解的或重组制备的部分的片段，其能够与某些 蛋白选择性地反应。这种蛋白水解的和/或重组片段的非限制性实例包括Fab、 F(ab')2、 Fab'、 Fv、 dAbs以及含有由肽接头连接的VL和VH结 构域的单链抗体(scFv) 。 scFv's可以共价地或非共价地连接来形成具 有两个或多个结合位点的抗体。因而，"基于抗体的结合部分"包括抗 体和重组抗体的多克隆的、单克隆的或其他纯化的制品。术语"基于抗 体的结合部分"进一步意图包括人源化的抗体、双特异性抗体和具有来 自抗体分子的至少一个抗原结合决定簇的嵌合分子。在优选的实施方式 中，可4企测地标记基于抗体的结合部分。
如在此使用的，"标记的抗体"包括通过可检测的方式标记 的抗体，包括但不限于，酶学地、放射性地、荧光地和化学发光地标记 的抗体。抗体也可以用可检测的标签，例如c-Myc、 HA、 VSV-G、 HSV、 FLAG、 V5或HIS来标记。
在使用基于抗体的结合部分用于检测生物标记物水平(例如 ADAMTS-7或附图5的生物标记物)的本发明的诊断和预后方法中，生 强度相关。 '一 。
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在一个优选的实施方式中，基于抗体的结合部分通过将抗体 与酶连接来可检测地标记。随后，当暴露于其底物时，所述酶将与所述 底物反应，这样来产生化学部分，其可以通过例如分光光度法、荧光或 通过可见装置来检测。可用于可检测标记本发明的抗体的酶包括但不限 于，苹果酸脱氢酶、葡萄球菌的核酸酶、A-V-类固醇异构酶、酵母乙醇 脱氢酶、oc-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化酶、碱性磷 酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、p-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿酶、 过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氲酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。化 学发光是可用于检测基于抗体的结合部分的另一种方法。
检测也可以使用各种其他的免疫分析的任一种来实现。例 如，通过放射性地标记抗体，有可能通过使用放射免疫分析来检测抗 体。放射性同位素可以通过例如使用Y计数器或闪烁计数器或通过放射 照相的手段来检测。对于本发明的目的特别有用的同位素是3H、 1311、 35S、 "C和优选的1251。
还可能的是用萸光化合物标记抗体。当荧光标记的抗体暴露 于适当波长的光线时，然后由于荧光可以检测它的存在。在最常用的荧 光标记化合物之中有CYE染料、异硫氰酸荧光素、罗丹明、phycoerytherin、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、o-phthaldehyde和荧光胺。抗体也可以使用荧光发射金属，例如152Eu或其他镧系元素 来可检测地标记。这些金属可以使用金属螯合基团如二亚乙基三胺五乙 酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)来附着于抗体。抗体也可以通过将它连结到化学发光化合物来可检测地标 记。然后通过检测在化学反应过程期间出现的发光的存在，来确定化学 发光物-抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例有鲁米诺、 萤光素、isoluminol、 theromatic acridinium ester、咪哇、acridinium盐和 草酸酯。如上所述，通过免疫分析，例如酶联免疫吸附分析(ELISA)、 放射免疫分析(RIA)、免疫放射分析(IRMA) 、 Western印迹或免疫 组织化学，可以检测ADAMTS-7水平，以下详细地说明每一种方法。 免疫分析例如及其快速的ELISA或RIA，是更一般地优选的。也可以采 用抗体阵列或蛋白芯片，参见，例如美国专利申请NO: 20030013208A1; 20020155493A1; 20030017515和美国专利No: 6,329,209; 6,365,418; 通过完全引用将它们合并在此。
免疫分析"放射免疫分析"是使用抗原的标记的(例如，放射性标记 的)形式用于检测和测量抗原浓度的技术。用于抗原的放射性标记物的 实例包括"H、 14C和1251。通过使生物样品中的抗原与标记的(例如， 放射性地)抗原竟争结合针对所述抗原的抗体，来测量生物样品中抗原 ADAMTS-7的浓度。为了确保标记的抗原和未标记的抗原之间的竟争结 合，标记的抗原以足以饱和所述抗体的结合位点的浓度存在。样品中的 抗原浓度越高，将结合所述抗体的标记的抗原的浓度越低。在放射免疫分析中，为了确定结合了抗体的标记的抗原的浓 度，必需从游离抗原中分离抗原抗体复合物。从游离抗原分离抗原抗体 复合物的一种方法是通过使用抗同种型抗血清从游离抗原分离抗原抗 体复合物的另一种方法是通过使用福尔马林灭活的S. aw^z^沉淀抗原 抗体复合物。从游离抗原分离抗原抗体复合物的再另 一种方法是通过进 行"固相放射免疫分析"，其中抗体被连接(例如，共价地)到Sepharose 珠子、聚苯乙烯孔、聚氯乙烯孔或微滴定孔。通过比较结合了抗体的标 记的抗原的浓度和基于具有已知抗原浓度的才羊品的
生物样品中抗原的浓度。
"免疫放射分析"(IRMA)是一种免疫分析，其中抗体试剂 被放射性地标记。IRMA需要产生多价的抗原结合物，通过例如与蛋白 质如兔血清白蛋白(RSA)结合的技术。多价的抗原结合物必需具有每 分子至少2个抗原残基，所述抗原残基必须有足够的距离间隔以容许至 少两个抗体与所述抗原的结合。例如，在IRMA中，多价的抗原结合物 可以附着于固体表面，例如塑料球体。将未标记的"样品"抗原以及被 放射性标记的针对所述抗原的抗体添加到含有多价抗原结合物包被的 球体的试管中。样品中的抗原与所述多价抗原结合物竟争抗原抗体结合 位点。在适合的孵育期之后，通过洗涤除去未结合的反应物，测定在固 相上的放射性的数量。结合的放射性抗体的数量与样品中抗原的浓度成 反比。
最常见的酶免疫分析是"酶联免疫吸附分析(ELISA)"。 ELISA是使用标记(酶连接)形式的抗体用于检测和测量抗原的浓度的 技术。存在各种形式的ELISA,其是本领域的技术人员公知的。在 "Methods in Imrnunodiagnosis", 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980; Campbell et al, "Methods and Immunology", W. A. Benjamin, Inc., 1964;和Oellerich, M. 1984， J. Clin. Chem. Clin. Biochem.， 22:895-904中描述了本领域已知的标准技术。
在"夹心ELISA"中，抗体(例如，抗-ADAMTS-7)与固相 (即，微量滴定板)连接，并暴露于含有抗原(例如，ADAMTS-7)的 生物样品。然后洗涤固相来除去未结合的抗原。然后标记的抗体(例如， 酶连接的)与结合的抗原(如果存在)结合形成抗体-抗原-抗体夹心。 可以与抗体连接的酶的实例是碱性磷酸酶、辣根过氧化酶、荧光素酶、尿酶和p -半乳糖苷酶。酶连接的抗体与底物反应来产生可以测量的有色 反应产物。
在"竟争ELISA"中，抗体与含有抗原(例如，ADAMTS-7) 的样品孵育。然后抗原-抗体混合物与包被了抗原(即，ADAMTS-7)的 固相(例如，微量滴定板)接触。样品中存在的抗原越多，越少的游离 抗体可用于结合固相。然后向所述固相添加标记的(例如，酶连接的) 二级抗体来确定结合到固相的初级抗体的数量。
在"免疫组织化学分析，，中，通过将所述组织暴露于对要分
析的蛋白是特异性的抗体，测试组织的切片的特定蛋白质。然后通过许 多已知方法的任一种来显现抗体，来确定蛋白质的存在和存在的数量。 用于显现抗体的方法的实例有，例如，通过与所述抗体连接的酶(例如， 荧光素酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或|3半乳糖苷酶)或化学方法(例如，DAB/底物显色)。
根据实践者的偏爱和基于本公开，可以使用其他技术来检测 本发明的生物标记物。这种技术之一是Western印迹(Towbin等人，Proc. Nat Acad. Sci. 76:4350 ( 1979)),其中适当处理的样品在SDS-PAGE 凝胶上跑动，之后转移到固相支持物，例如硝酸纤维素膜。然后可检测 标记的特异性结合ADAMTS-7的抗体可以用于评定生物标记物水平， 其中来自可检测标记的信号的强度相应于存在的生物标记物的数量。例 如通过密度测定法可以测定所述水平。j谬法
此外，可以使用质谱法，例如MALDI/TOF (飞行时间)、 SELDI/TOF、液相色谱-质谱法(LC-MS )、气相色语-质语法(GC-MS )、 高效液相层析-质语法(HPLC-MS)、毛细管电泳-质谦法、核磁共振波 谱法或串联的质谱法(例如，MS/MS、 MS/MS/MS、 ESI-MS/MS,等等) 来^r测本发明的生物标记物。参见，例如，美国专利申请NO: 20030199001、 20030134304、 20030077616，通过引用将它们合并在此。
质谱方法是本领域公知的，已经被用于定量和/或鉴定生物分 子，例如蛋白质(参见，例如Li等人,(2000) Tibtech 18:151-160; Rowley 等人,(2000 ) Methods 20: 383-397;和Kuster and Mann( 1998 ) Curr. Opin. Structural Biol. 8: 393-400 )。进一步的，已经开发了允许分离的蛋白质 的至少部分起始测序的质谱技术。Chait等人，Science 262:89-92( 1993 ); Keough等人，Proc, Natl. Acad. Sci. USA. 96:7131-6 ( 1999 ) ; reviewed in Bergman, EXS 88:133-44 ( 2000 )。
在某些实施方式中，使用气相离子分光光度计。在其他实施 方式中，使用激光-脱附/电离质谱法来分析样品。现代的激光脱附/电离 质谱法("LDI-MS")可以按两种主要的变体来操作基质帮助的激光 脱附/电离("MALDI")质谱法和表面增强的激光脱附/电离("SELDI")。 在MALDI中，被分析物与含有基质的溶液混合， 一滴所述液体置于基 底的表面上。然后基质溶液与所述生物分子共结晶。基底被插入到质谱 仪中。将激光能量导向基底表面，在此它脱附并离子化所述生物分子而不显著地破碎它们。然而，MALDI作为分析工具有局限性。它不提供 分馏样品的手段，基质材料可能影响检测，特别是对于低分子量的被分 析物。参见，例如，美国专利No, 5， 118,937 (Hillenkamp等人，)，和美 国专利No. 5,045，694 ( Beavis & Chait)。
在SELDI中，基底表面被修饰，使得它是脱附过程中的主动 参与者。在一个变体中，所述表面用选择性结合目标蛋白的吸附试剂和 /或捕获试剂衍生化。在另一种变体中，所述表面用激光轰击时不脱附的 能量吸收分子来衍生化。在另一种变体中，所述表面用分子衍生化，所 述分子结合目标蛋白质，并且含有在应用激光时被打断的光解的键。在 这些方法的每一种中，衍生化试剂一般被定位在施加样品的基底表面上 的特定位置。参见，例如，美国专利No.5,719,060和WO98/59361。例 如，通过使用SELDI亲和性表面来捕获被分析物并向捕获的被分析物添 加含有基质的液体来提供能量吸收材料，可以组合这两种方法。
关于质谱仪的其他信息，参见，例如，Principles of Instrumental Analysis, 3rd edition., Skoog, Saunders College Publishing, Philadelphia, 1985;和Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4.sup.th ed. Vol. 15 ( John Wiley & Sons, New York 1995 ) , pp. 1071-1094。
检测标记物或其他物质的存在一般将包括信号强度的检测。 随后，这可以反映结合到基底上的多肽的数量和性质。例如，在某些实 施方式中，可以比较第一样品和第二样品的光谱的峰值信号强度(例 如，视觉地，通过计算机分析，等等)，来确定特定生物分子的相对数 量。可以使用软件程序例如Biomarker Wizard程序(Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Calif.)来帮助分析质谦。质谫仪和它们的技术是本领域的 技术人员公知的。
本领域的任何技术人员理解，质谱仪的任何组件(例如，脱 附源、质量分析器、检测，等等)和各种样品制品可以与在此描述的其 他适合的组件或制品，或与本领域已知的那些组合。例如，在某些实施 方式中对照样品可以含有重原子(例如，13C),从而允许测试样品在同 一质谱法进行中与已知的对照样品混合。
在一个优选的实施方式中，使用激光脱附时间飞行(TOF) 质谱仪。在激光脱附质谱法中，具有结合的标记物的基底被导入进气系 统中。通过来自电离源的激光将标记物脱附和电离成气相。通过离光学 的组件收集产生的离子，然后在时间飞行质量分析器中，离子被加速通 过短的高压电场并飘入高真空仓室中。在高真空仓室的远端，被加速的 离子在不同的时间击打在灵敏的检测器表面。由于飞行的时间是离子质 量的函数，在离子形成和离子检测器撞击之间经过的时间可用于鉴定特 定的质量电荷比的分子的存在或不存在。
在某些实施方式中，在第一和第二样品中存在的一种或多种 生物分子的相对数量通过使用可编程的数字计算机执行算法来部分地 确定。所述算法在第一质谱和第二质谱中鉴定至少一个分值。所述算法 然后比较第一质语的峰值信号强度和第二质谱的峰值的信号强度。相对 信号强度是存在于第一和第二样品中的生物分子数量的指示。含有已知 数量的生物分子的标准物可以作为第二样品被分析来提供对第 一样品 中存在的生物分子数量的更好的定量。在某些实施方式中，也可以测定 第一和第二样品中生物分子的同一性。
在一个优选的实施方式中，通过MALDI-TOF质谱法来测量 生物标记物水平。
ADAMTS-7水平也可以使用其他生物分析来测量，例如测量 活性的生物分析，包括但不限于zymography。 Zymography是本领域技 术人员公知的分析,在Heusen et al, Anal. Biochem., ( 1980 ) 102:196-202; Wilson等人，Journal of Urology, ( 1993 ) 149:653-658; Hernon等 人，J. Biol. Chem. ( 1986 ) 261: 2814-2828, Braunhut等人，J. Biol. Chem. (1994) 269: 13472-13479;和Moses等人，Cancer Research 58, 1395-1399: April 1, 1998中描述，通过完全引用将它们合并在此。《傳
用于本发明的抗体可以从商业来源获得。做为选择，可以针 对ADAMTS-7、或生物标记物多肽的一部分来产生抗体。在美国申请 NO. 2002/0182702; 2003/0212256; 20020110894和WO 01/11074中公开 了用于ADAMTS-7抗体生产的有用方法，通过引用将它们合并在此。如，通过单克隆抗体生产(Campbell, A.M., Monoclonal Antibodies Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,
Elsevier Science Publishers, Amsterdam, the Netherlands ( 1984 ); St Groth etal, J. Immunology, ( 1990 ) 35-21;和Kozbor et al, Immunology Today(1983 ) 4:72)。通过本领域^^知的方法，通过使用蛋白质的抗原性部 分来筛选抗体库，例如噬菌体显示库，也可以容易地获得抗体。例如， 美国专利5,702,892 (U.S.A. Health & Human Services )和W0 01/18058(Novopharm Biotech Inc.)公开了用于产生抗体结合结构域片段的噬菌 体展示库和选4奪方法。
本发明还涉及用于上皮来源的癌症的检测和预后评估的商业 性试剂盒。所述试剂盒可以是本领域技术人员已知的任何结构，并且对 于进行在此描述的检测ADAMTS-7的一种或多种方法是有用的。所述 试剂盒是方便的，因为它们提供了如果不是全部也是大多数的基本试 剂，用于进行生物样品中ADAMTS-7检测的分析。此外，所述分析优 选的与标准物或多个标准物同时进行，所述标准物被包括在试剂盒内， 例如，预定数量的ADAMTS-7蛋白或核酸，使得测试的结果可以被定 量或校准。
所述试剂盒包括检测ADAMTS-7水平的手段，例如选择性地 结合ADAMTS-7蛋白的抗体或抗体片段，或容许合成编码所述蛋白质 的cDNA的DNA寡核苷酸引物组，或例如，检测ADAMTS-7 mRNA表 达的DNA探针。所述诊断分析试剂盒优选的配置为标准的双抗体结合 形式，其中一个ADAMTS-7特异性抗体捕获患者样品中的ADAMTS-7， 另一个ADAM特异性抗体被用于检测捕获的ADAMTS-7。例如，捕获 抗体被固定在固相上，例如分析平板、分析孔、硝化纤维膜、珠子、量 液杆、或洗脱柱的成分。所述第二抗体，即检测抗体， 一般用可检测的 标记来标签，例如量热试剂或放射性同位素。
在一个优选的实施方式中，所述试剂盒包含检测尿液样品中 ADAMTS-7水平的手段。在特定的实施方式中，所述试剂盒包括具有固 定在其上的抗ADAMTS-7抗体的"量液杆"，所述抗体同一性结合 ADAMTS-7蛋白。然后可以使用例如，用量热试剂或放射性同位素可检 测标记的第二抗体来检测特异性结合的ADAMTS-7蛋白。
在其他实施方式中，分析试剂盒可以采用(但不限于)以下 技术竟争性和非竟争性分析、放射免疫分析(RIA)、生物发光和化
学发光分析、荧光分析、夹心分析、免疫放射分析、斑点印迹、酶连接分析，包括ELISA、微量滴定板和免疫细胞化学。对于每种试剂盒，分 析的范围、敏感性、精确度、可靠性、特异性和重现性通过本领域技术 人员/>知的方法来确定。
以上描述的分析试剂盒将进一步提供使用说明书。
通过以下非限制性的实施例进一步说明本发明。
提供这些实施例来帮助理解本发明，不看作是本发明的限制,实施例IADAMTS-7作为在癌症患者的尿液中存在的高分子量明胶酶的 鉴定尿ADAMTS-7的鉴定
我们已经鉴定了在来自膀胱癌患者的尿液样品中分析的约 190 kDa高分子量明胶酶(附图1)为ADAMTS-7。
使用亲和层析和离子交换层析的组合来部分地纯化所述明胶 酶。富集了高分子量明胶酶种类的样品(来自膀胱癌患者)通过SDS-PAGE来分辨，并用Sypro Ruby Stain染色(附图3)。切下约190kDa 的蛋白条带，进行凝胶内的胰蛋白酶消化，随后串联的(MS-MS )质语 分析。约190 kDa明胶酶种类的质语分析表明，存在1%肽覆盖度的 ADAMTS-7 (具有凝血栓蛋白1型基序7的disintegrin和金属蛋白酶 (r印rolysin型)；具有凝血栓蛋白基序7前原蛋白的disintegrin和金属 蛋白酶)。Blast分析和文献检索确认了质语法鉴定处的肽相应于 ADAMTS醫7 ( NP—055087.2 )。实施例II在患有乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、脑癌和肝癌的患者中 ADAMTS-7表达和活性被增量调节
我们在患有和不患有癌症的患者中测试了 ADAMTS-7活性 和表达。从患有乳腺癌、脑癌、前列腺癌、膀胱癌和肝癌的患者收集尿 液样品。50 m L的未浓缩的尿液样品通过明月交zymograpy来分析以^r测 ADAMTS-7活性。
对于ADAMTS-7的Western印迹分析，使用具有10 kDa截断
膜的微离心旋转柱(Vivaspin, Vivascience )浓缩尿液样品。所有分析的 样品被标准化为20 yg总蛋白。从规则的BisTris 4-12%梯度凝胶，而 不是zymogram产生免疫印迹。使用的ADAMTS-7抗体是来自Triple Point Biologies的兔多克隆抗体-RPl-ADAMTS-7,针对所述蛋白质的羧基末端o
如附图5A所述，在患有乳腺癌、脑癌、前列腺癌、脑癌、膀 胱癌和肝癌的患者中ADAMTS-7活性被增量调节。在来自正常的年龄/ 性别匹配对照、没有癌症的患者的浓缩尿液样品的平行zymographic分 析中没有检测到ADAMTS-7活性。
附图6A和6B显示了在来自患有或不患有癌症的患者的尿液 样品中ADAMTS-7蛋白的代表性的免疫印迹染色。如附图6B所示，在 来自患有乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌的患者的尿液样品中检测到 ADAMTS-7蛋白。在来自正常的年龄/性别匹配对照、没有癌症的患者 的浓缩尿液样品的平行免疫印迹分析没有检测到任何ADAMTS-7(附图 6A)。
在此和整个说明书中引用的参考文献通过引用将它们合并在此。
权利要求
1.一种用于促进患者的上皮来源的癌症的诊断的方法，所述方法包括a.从所述患者获得生物样品；和b.检测所述生物样品中ADAMTS-7的存在或不存在，其中ADAMTS-7存在是存在上皮来源的癌症的指示。
2. 权利要求1的方法，其中所述生物样品选自血液、组织、血清、 大便、尿液、痰、脑脊液、乳头吸出物和细胞溶胞产物的上清液。
3. 权利要求l的方法，其中所述生物样品是尿液。
4. 一种用于在患者中诊断上皮来源的癌症的方法，所述方法包括a. 测量在获自所述患者的测试样品中存在的ADAMTS-7水平；b. 比较所述测试样品中的ADAMTS-7水平与对照样品中存在的 ADAMTS-7水平；其中与对照样品中ADAMTS-7水平相比在测试样品中更高的 ADAMTS-7水平是上皮来源的癌症的指示。
5. 权利要求4的方法，其中所述测试样品和所述对照样品选自血 液、组织、血清、大便、尿液、痰、脑脊液、乳头吸出物和细胞溶胞产 物的上清液。
6. 权利要求4的方法，其中所述测试和对照样品是尿液。
7. 权利要求1或4的方法，其中所述上皮来源的癌症选自乳腺癌、 基底细胞癌、腺癌、胃肠癌、唇癌、口腔癌、食道癌、小肠癌症、胃癌、 结肠癌、肝癌、脑癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、肺癌、皮 肤癌、前列腺和肾脏细胞癌。
8. 权利要求l的方法，其中使用特异性结合ADAMTS-7蛋白的基 于抗体的结合部分来检测ADAMTS-7的存在或不存在。
9. 权利要求4的方法，其中ADAMTS-7的水平通过测量 ADAMTS-7蛋白的水平来测量。
10. 权利要求4的方法，其中ADAMTS-7的水平通过测量 ADAMTS-7的活性来测量。
11. 权利要求9的方法，其中ADAMTS-7蛋白的水平通过包括以下 步骤的方法来测量a.用特异性结合ADAMTS-7的基于抗体的结合部分接触所述测试 样品或其制备物来形成抗体-ADAMTS-7复合物；以及b.检测所述复合物的存在，从而测量存在的ADAMTS-7的水平。
12. 根据权利要求8或9的方法，其中使用可检测的标记物来标记 所述基于抗体的结合部分。
13. 根据权利要求12的方法，其中所述标记物选自放射性标记物、 半抗原标记物、荧光标记物和酶标记物。
14. 根据权利要求8或9的方法，其中所述基于抗体的结合部分是 抗体。
15. 根据权利要求14的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
16. 用于检测尿液样品中的ADAMTS-7的试剂盒，其包含容纳尿液 样品的容器，和至少一种特异性结合ADAMTS-7的抗体。
17. 权利要求18的试剂盒，其中所述试剂盒包含特异性结合 ADAMTS-7的两种抗体， 一种抗体固定在固相上， 一种抗体被可检测地 标记。
18. 权利要求18的试剂盒，其进一步包括使用说明书。
19. 一种指导个体的治疗的方法，其包括让个体测试获自所述个体 的生物样品中ADAMTS-7的存在，其中临床医师审查该结果，如果所 述生物样品对于ADAMTS-7的存在是阳性的，所述临床医师指导所述 个体治疗上皮来源的癌症。
20. 权利要求19的方法，其中所述生物样品是尿液。
全文摘要
ADAMTS-7表达和活性在患有上皮来源癌症的患者中被增量调节。因此，本发明涉及上皮来源的癌症(例如，乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、脑癌和肝癌)的诊断方法。特别地，在生物样品中ADAMTS-7的存在是上皮来源癌症的指示。因而，测量生物样品(例如尿液或血液)中的ADAMTS-7水平提供了快速、简单和安全的筛选，其可以用于诊断患者中的癌症。
文档编号A61K39/395GK101120016SQ200680005166
公开日2008年2月6日 申请日期2006年2月13日 优先权日2005年2月17日
发明者M·A·摩西, R·罗伊 申请人:儿童医疗中心有限公司