耐高温核酸酶在培育植物雄性不育系中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了耐高温核酸酶在培育植物雄性不育系中的应用。本发明提供了一种培育雄性不育的转基因植物的方法，是将含有核酸酶基因的表达盒导入出发植物中，得到雄性不育的转基因植物；所述核酸酶是如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（c）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（d）将序列表中序列1、序列2或序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有核酸酶功能的由序列1、序列2或序列3衍生的蛋白质。本发明采用很好的解决核酸酶的温度敏感问题，植株在常温乃至高温下表现为稳定的雄性不育。
【专利说明】耐高温核酸酶在培育植物雄性不育系中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及耐高温核酸酶在培育植物雄性不育系中的应用。
【背景技术】
[0002]作物的杂种优势能大大提高作物的产量和品质，然而目前杂种优势的利用仍不普及，主要限制因素是人工去雄费时费力，化学去雄难以控制等。利用基因工程创造作物雄性不育及相应的保持系和恢复系，对提高产量和品质有着重要的作用和意义。
[0003]欲利用杂种优势，最重要的就是构建出性状稳定的雄性不育系。目前核雄性不育系植物的构建策略主要是通过特异的表达细胞毒性因子，特别是Barnase，获得植物雄性不育系。具体方法为:将花药绒毡层特异的启动子与细胞毒素基因及终止子串联成为嵌合基因，导入植物，利用特异的启动子驱动在花药中表达细胞毒素基因，特异的阻断花粉的发育，导致植物的雄性不育。然而以前的研究表明花药绒毡层特异启动子表达Barnase获得的不育性状在高温下存在育性恢复现象。我们认为是由于Barnase在高温下活性不稳定造成的。用耐高温的核酸酶(如具有高Tm值的牛RNase A)可能克服该问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供耐高温核酸酶在培育植物雄性不育系中的应用。
[0005]本发明提供了一种培育雄性育性降低或雄性不育的转基因植物的方法，是将含有核酸酶基因的表达盒导入出发植物中，得到雄性育性低于所述出发植物或雄性不育的转基因植物；所述核酸酶是如下(a)或(b)或(C)或(d): (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(C)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列表中序列1、序列2或序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有核酸酶功能的由序列1、序列2或序列3衍生的蛋白质。
[0006]所述核酸酶基因可为如下(I)至(9)中任一所述的DNA分子:(I)编码区如序列表中序列7所示的DNA分子；(2)编码区如序列表中序列8所示的DNA分子；(3)编码区如序列表中序列9所示的DNA分子；(4)编码区如序列表中序列10所示的DNA分子；(5)序列表中序列4自5’末端第912至1465位核苷酸所不的DNA分子；(6)序列表中序列5自5’末端第489至986位核苷酸所示的DNA分子；(7)序列表中序列6自5’末端第1572-2069位核苷酸所示的DNA分子；(8)在严格条件下与(I)至(7)中任一限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(9)与(I)至(7)中任一限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码所述的蛋白的DNA 分子。
[0007]所述“含有核酸酶基因的表达盒”自上游至下游可依次包括如下元件:启动子、所述核酸酶基因和终止子。所述启动子具体可为绒毡层特异启动子，更具体可为序列表的序列4中自5’末端第102-909位核苷酸所不的TA29启动子、序列表的序列5中自5’末端第102-486位核苷酸所不的A9启动子或序列表的序列6中自5’末端第102-1565位核苷酸所示的ENDl启动子。所述“含有核酸酶基因的表达盒”具体可如序列表的序列4、序列5或序列6所示。
[0008]所述“含有核酸酶基因的表达盒”具体可通过重组质粒导入所述出发植物。所述重组质粒可为重组质粒pTA29_RNase A_Nos、重组质粒pA9_RNase A-Nos或重组质粒pENDl-RNase A-Nos0所述重组质粒pTA29_RNase A-Nos %:序列表的序列4自5’末端第102-1723位核苷酸所示的DNA分子插入重组质粒pCambia2300-aroAM12_GATEWAY的attRl序列和attR2序列之间得到的重组质粒。所述重组质粒pA9_RNase A-Nos为:序列表的序列5自5’末端第102-1244位核苷酸所示的DNA分子插入重组质粒pCambia2300-aroAM12-GATEWAY的attRl序列和attR2序列之间得到的重组质粒。所述重组质粒pENDl-RNase A-Nos为:序列表的序列6自5’末端第102-2327位核苷酸所示的DNA分子插入重组质粒pCambia2300-aroAM12_GATEWAY的attRl序列和attR2序列之间得到的重组质粒。
[0009]所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物，具体可为拟南芥或烟草，更具体可为哥伦比亚生态型拟南芥或烟草Nc89。
[0010]本发明还保护以上任一所述核酸酶、以上任一所述核酸酶基因、以上任一所述“含有核酸酶基因的表达盒”或以上任一所述重组质粒在培育雄性育性降低的转基因植物或植物雄性不育系中的应用。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，具体可为拟南芥或烟草，更具体可为哥伦比亚生态型拟南芥或烟草NC89。
[0011]本发明采用很好的解决不育性状的温度敏感问题，植株在常温乃至高温下表现为稳定的雄性不育。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为实施例2的步骤三中植株的表型照片。
[0013]图2为实施例2的步骤三中植株的花粉萌发实验的照片。
[0014]图3为实施例2的步骤三中植株的FAD-PI染色的照片。
[0015]图4为实施例3的步骤四中植株的表型照片。
[0016]图5为实施例3的步骤四中植株的花粉萌发实验的照片。
[0017]图6为实施例3的步骤四中植株的FAD-PI染色的照片。
[0018]图7为实施例3的步骤四中植株培养的照片(种荚)。
[0019]图8为实施例3的步骤四中植株培养的照片(花粉)。
[0020]图9为实施例4的步骤四中植株的表型照片。
[0021]图10为实施例4的步骤四中植株的花粉萌发实验的照片。
[0022]图11为实施例4的步骤四中植株的FAD-PI染色的照片。
【具体实施方式】
[0023]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。本发明提供的核酸酶最初是从牛的胰腺组织发现的。农杆菌菌株GV3101:购于Clontech 公司。哥伦比亚生态型拟南芥(col_0):购自 Arabidopsis B1logical ResourceCenter (ABRC)0烟草Nc89:购自中烟种子有限责任公司。
[0024]重组质粒pCambia2300-aroAM12_GATEWAY的构建方法:(I)合成序列表中序列11所示的双链DNA分子(自5’末端第270-1553位核苷酸为aroAM12草甘膦抗性基因的反向互补序列)，用SacI和HindIII酶切后插入植物双元载体pCambia2300的SacI和HindIII酶切位点之间，得到重组质粒pCambia2300-aroAM12 ；(2)合成序列表中序列12所示的双链DNA分子(自5’末端第7-134位核苷酸为attRl序列，第173-478位核苷酸为致死基因CXDB的反向互补序列，第1756-1880位核苷酸为attR2序列)，用SacI酶切后插入重组质粒pCambia2300-aroAM12 的 SacI 酶切位点，得到重组质粒 pCambia2300-aroAM12_GATEWAY。
[0025]RNase A蛋白如序列表的序列I所不。将RNase A蛋白的编码基因命名为RNaseA基因，其开放阅读框如序列表的序列10所示。
[0026]实施例1、重组质粒的构建
[0027]一、重组质粒甲的构建
[0028]1、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子(序列表的序列4中，自5’末端第I至101位核苷酸为attLl位点，第102-909位核苷酸为TA29启动子，第910-915位核苷酸为限制性内切酶Nco I的识别序列，第913-914位核苷酸为起始密码子，第921-1090位核苷酸为内含子甲，第1091-1462位核苷酸为核酸酶的编码序列，第1463-1465位核苷酸为终止密码子，第1465-1470位核苷酸为限制性内切酶Sac I的识别序列，第1471-1723位核苷酸为终止子，第1724-1823位核苷酸为attL2位点)。
[0029]2、米用 Invitrogen 公司的 Gateway LR Clonase II enzyme mix 试剂盒将步骤 I的双链DNA分子与重组质粒pCambia2300-aroAM12-GATEWAY进行LR反应，得到重组质粒甲(又称重组质粒pTA29-RNase A-Nos ;即通过LR反应，序列表的序列4自5’末端第102-1723位核苷酸所示的DNA分子导入到重组质粒pCambia2300-aroAM12-GATEWAY中，形成重组质粒pTA29-RNase A_Nos)。序列表的序列4自5’末端第102-1723位核苷酸所示的DNA分子编码序列表的序列2所不的蛋白质。
[0030]二、重组质粒乙的构建
[0031]1、合成序列表的序列5所不的双链DNA分子(序列表的序列5中，自5’末端第I至101位核苷酸为attLl位点，第102-486位核苷酸为A9启动子，第487-492位核苷酸为限制性内切酶Nco I的识别序列，第489-491位核苷酸为起始密码子，第492-605位核苷酸为内含子乙，第612-983位核苷酸为核酸酶的编码序列，第984-986位核苷酸为终止密码子，第986-991位核苷酸为限制性内切酶Sac I的识别序列，第992-1244位核苷酸为终止子，第1245-1344位核苷酸为attL2位点)。
[0032]2、米用 Invitrogen 公司的 Gateway LR Clonase II enzyme mix 试剂盒将步骤 I的双链DNA分子与重组质粒pCambia2300-aroAM12-GATEWAY进行LR反应，得到重组质粒乙(又称重组质粒pA9-RNase A-Nos ;即通过LR反应，序列表的序列5自5’末端第102-1244位核苷酸所示的DNA分子导入到重组质粒pCambia2300-aroAM12-GATEWAY中，形成重组质粒pA9-RNase A_Nos)。序列表的序列5自5’末端第102-1244位核苷酸所示的DNA分子编码序列表的序列3所不的蛋白质。
[0033]三、重组质粒丙的构建
[0034]1、合成序列表的序列6所示的双链DNA分子(序列表的序列6中，自5’末端第I至101位核苷酸为attLl位点，第102-1565位核苷酸为ENDl启动子，第1570-1575位核苷酸为限制性内切酶Nco I的识别序列，第1572-1574位核苷酸为起始密码子，第1575-1688位核苷酸为内含子丙，第1695-2066位核苷酸为核酸酶的编码序列,第2067-2069位核苷酸为终止密码子，第2069-2074位核苷酸为限制性内切酶Sac I的识别序列，第2075-2327位核苷酸为终止子，第2328-2427位核苷酸为attL2位点)。
[0035]2、米用 Invitrogen 公司的 Gateway LR Clonase II enzyme mix 试剂盒将步骤 I的双链DNA分子与重组质粒pCambia2300-aroAM12-GATEWAY进行LR反应，得到重组质粒乙(又称重组质粒pENDl-RNase A-Nos ;即通过LR反应，序列表的序列6自5’末端第102-2327位核苷酸所示的DNA分子导入到重组质粒pCambia2300-aroAM12-GATEWAY中，形成重组质SpENDl-RNase A_Nos)。序列表的序列6自5’末端第102-2327位核苷酸所示的DNA分子编码序列表的序列3所不的蛋白质。
[0036]实施例2、转基因拟南介的犾得和鉴定
[0037]一、转基因植物的获得
[0038]1、将重组质粒pTA29_RNase A-Nos导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。
[0039]2、通过花浸泡法(Clough, S.J.，and Bent, A.F.(1998).Floral dip: a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformat1n of Arabidopsis thaliana.PlantJ16, 735-743.)将重组农杆菌导入哥伦比亚生态型拟南芥，得到TO代种子。
[0040]3,TO代种子收获后在MS培养基(含有50mmol/L卡那霉素和lmmol/L草甘膦)中筛选抗性植株(TO代植株)。
[0041]4、将抗性植株(母本)和哥伦比亚生态型拟南芥(父本)杂交，得到Tl代种子。
[0042]5、T1代种子在MS培养基(含有50mmol/L卡那霉素和lmmol/L草甘膦)中筛选抗性植株(Tl代植株)。
[0043]分别提取TO代植株和Tl代植株的叶片的总RNA并反转录为cDNA，用Fl和Rl组成的引物对对来自各个样本的cDNA进行PCR鉴定(靶序列为约380bp的条带)，PCR鉴定为阳性的植株即为转基因植株。
[0044]Fl:5’ -GCCTTGCTGTATTTTGGCAGGTAAGGAAACTGCAGCAGCCAA-3’ ；
[0045]Rl:5，-CGGGAGCTCTACACTGAAGCATCAAAGTGGAC-3，。
[0046]抽样提取Tl代转基因植株的总RNA，将总RNA反转录为cDNA后对核酸酶基因区域进行PCR鉴定并测序，结果表明，内含子被剪切掉了，内含子两端的核苷酸连接并表达序列表的序列2所不的蛋白质。
[0047]二、对照植物的获得
[0048]将出发质粒代替重组质粒pTA29_RNase A-Nos进行步骤一的操作，得到转空载体对照植株。
[0049]三、转基因植物的鉴定
[0050]1、拟南芥植株培养
[0051]将5株萌发10天的Tl代转基因植株、10株萌发10天的哥伦比亚生态型拟南芥和8株萌发10天的Tl代转空载体对照植株，在相同条件下培养30天(16小时光照，8小时黑暗；23-27°C)，第30天观察表型并拍照，进行花粉萌发实验和FDA-PI染色实验。
[0052]2、结果
[0053](I)表型观察
[0054]哥伦比亚生态型拟南芥花的表型如图1A、1B所示，花药长可触及柱头。转空载体对照植株的花的表型与哥伦比亚生态型拟南芥花的表型一致。转基因植株的花的表型如图1C、1D、1E和IF所示。转基因植株的花有多种表型:有的花丝和花萼均极短，花萼无法包裹柱头，而花丝发育不良，且长度仅为柱头的一半，无法触及柱头；有的花丝极短且发育不良，但花萼较大，基本可以包裹雌蕊，但此类花花瓣难以展开，长期处于未开花状态，最终花瓣及花丝在花萼包裹下萎缩；亦有的花丝比柱头略短，难以触及柱头，但花药发育较为正常，花药能够裂开散出花粉；偶见与野生型的花外观较为相像的花，花丝长，能够触及柱头，花药表观发育较为正常，花药能够裂开散出花粉。
[0055](2)花粉萌发实验
[0056]上午十点左右取露白或者十字打开的花朵，收集花粉，铺于BK萌发培养基(配方见表1)上，100%湿度、25°C培养6小时后进行观察(在显微镜下，每个植株随机取100个花粉粒观察表型并计算萌发率)。
[0057]表1BK萌发培养基的配方(溶剂为水，pH7)
[0058]
【权利要求】
1.一种培育雄性育性降低或雄性不育的转基因植物的方法，是将含有核酸酶基因的表达盒导入出发植物中，得到雄性育性低于所述出发植物或雄性不育的转基因植物；所述核酸酶是如下(a)、(b)、(c)或(d): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (C)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (d)将序列表中序列1、序列2或序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有核酸酶功能的由序列1、序列2或序列3衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述核酸酶基因是如下(I)至(9)中任一所述的DNA分子: (1)编码区如序列表中序列7所示的DNA分子； (2)编码区如序列表中序列8所示的DNA分子； (3)编码区如序列表中序列9所示的DNA分子； (4)编码区如序列表中序列10所示的DNA分子； (5)序列表中序列4自5’末端第912至1465位核苷酸所不的DNA分子； (6)序列表中序列5自5’末端第489至986位核苷酸所不的DNA分子； (7)序列表中序列6自5’末端第1572-2069位核苷酸所不的DNA分子； (8)在严格条件下与(I)至(7)中任一限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子; (9)与(O至(7)中任一限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码所述的蛋白的DNA分子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述“含有核酸酶基因的表达盒”自上游至下游依次包括如下元件:启动子、所述核酸酶基因和终止子。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于:所述启动子为绒毡层特异启动子。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述“含有核酸酶基因的表达盒”如序列表的序列4或序列5或序列6所示。
6.核酸酶、编码所述核酸酶的基因或含有所述“编码所述核酸酶的基因”的表达盒在培育雄性育性降低的转基因植物或植物雄性不育系中的应用；所述核酸酶是如下(a)、(b)、(C)、(d): (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (C)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (d)将序列表中序列1、序列2或序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有核酸酶功能的由序列1、序列2或序列3衍生的蛋白质。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于:所述“编码所述核酸酶的基因”是如下(I)至(9)中任一所述的DNA分子: (I)编码区如序列表中序列7所示的DNA分子；(2)编码区如序列表中序列8所示的DNA分子； (3)编码区如序列表中序列9所示的DNA分子； (4)编码区如序列表中序列10所示的DNA分子； (5)序列表中序列4自5’末端第912至1465位核苷酸所不的DNA分子； (6)序列表中序列5自5’末端第489至986位核苷酸所不的DNA分子； (7)序列表中序列6自5’末端第1572-2069位核苷酸所不的DNA分子； (8)在严格条件下与(I)至(7)中任一限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子; (9)与(O至(7)中任一限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码所述的蛋白的DNA分子。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于:所述“编码所述核酸酶的基因”的表达盒自上游至下游依次包括如下元件:启动子、所述核酸酶基因和终止子。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于:所述启动子为绒毡层特异启动子。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于:所述“编码所述核酸酶的基因”的表达盒如序列表的序列4、序列5或序列6所示。
【文档编号】C12N9/22GK104164448SQ201310187545
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年5月20日 优先权日:2013年5月20日
【发明者】刘玉乐, 赖艺祯, 谢科, 隋宁 申请人:清华大学