诸葛菜odreb2b基因在培育耐旱植物中的应用的制作方法

专利名称：诸葛菜odreb2b基因在培育耐旱植物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及从诸葛菜中克隆了一个新的编码区为978bp的干旱相关转录因子基因(ODREB2B)，并且提供了利用此基因遗传转化获得耐旱耐寒转基因植物的分子方法。
背景技术：
植物在生长过程中受干旱和寒冷的影响很大，在此过程中，一系列的基因被诱导表达。已有许多实验证明在拟南芥中一类被成为DRE(dehydration-responsive element)的顺式作用元件在干旱诱导基因表达过程中起着重要作用。DREB是一类能与DRE顺式作用元件结合的转录因子，该类转录因子的AP2 Domain就是与DRE的结合部位。在拟南芥中这类转录因子共有5种，分别为DREB1A，DREB1B，DREB1C，DREB2A，DREB2B。其中DREB1类转录因子主要受冷诱导，DREB2类转录因子主要受干旱诱导。DRE这类顺式作用元件常在一些干旱和冷诱导表达基因的启动子区域发现，因此DREB这类基因的编码蛋白通过结合在DRE顺式作用元件上启动寒旱相关下游基因的表达，从而使植物表现对干旱和寒冷的抵抗力。
我们从诸葛菜(Orychophragmus violaceus，又称二月兰)中克隆了一个新的干旱诱导的DREB类转录因子编码基因，并命名为ODREB2B。该基因所编码的蛋白具有AP2 DNA结合区，能与一些干旱相关下游基因的启动子区域的干旱反应元件相结合，从而调控耐旱、耐寒相关基因的转录，是植物耐旱机制的上游开关。该基因与拟南芥中DREB2B基因的核酸序列相似性为69％，氨基酸序列相似性为46％。我们构建了该基因的植物表达载体，并将此耐旱基因导入各类植物中，以提高植物的耐旱耐寒性。

发明内容
1、克隆了新的DREB类基因ODREB2B从已发表的拟南芥DREB2A和DREB2B基因序列的比较中，我们设计了包括DREB基因起始密码和终止密码的的一对简并引物，分别为P1和P2。利用SDS法提取诸葛菜的基因组DNA，通过PCR扩增得到980bp左右的特异片断，连接到pGEM-Teasy上并进行测序，表明该基因的完整编码区为978bp，编码325个氨基酸。将测序结果与拟南芥中DREB2B基因的序列进行相似性比较，发现诸葛菜中的DREB2B基因与拟南芥中相应基因有69％的同源性，翻译成氨基酸序列后进行相似性比较，两者的相似性亦有46％。将这个新的蛋白序列进行BLAST分析，显示该蛋白的16-169位氨基酸为含有能与DRE顺式作用元件结合的AP2 domain。以上分析说明该基因为诸葛菜中DREB类的新基因，命名为ODREB2B。
2、构建了ODREB2B基因的植物表达载体pAHC-ODREB2B和p3ubiODREB2B将ODREB2B基因连接到pGEM-Teasy载体上，并命名为pT-ODREB2B。Not I酶切pT-ODREB2B，回收约1kb的小片段，连接到pGEM-5Z上，得到中间载体p5Z-ODREB2B。将p5Z-ODREB2B用EcoR V和Sac I酶切，回收小片段，同时将pAHC25用Sma I和SacI酶切，回收大片段，连接小片段和大片段，转化DH5 α并进行PCR和酶切鉴定后得到pAHC-ODREB2B。
从pT-ODREB2B上选择酶切位点Not I将ODREB2B切下并回收，连接到pUbi-Bar载体上，形成Ubi-ODREB2B-Ubi-bar-Tnos结构，再用Hind III单酶双切将Ubi-ODREB2B单元切下，与p3300-Tnos载体经Hind III酶切后相连接，经过酶切和PCR鉴定重组质粒，最终得到含有如下结构的植物表达载体p3ubiODREB2BLB-Ubiquitin-ODREB2B-Tnos-Ubiquitin-Bar-Tnos-RBUbiquitin启动子为泛素蛋白基因的5’端调控区，在单子叶植物中组成型表达。
3、通过基因枪和农杆菌介导的方法对草坪草和牧草进行了遗传转化，并获得了耐旱转基因草坪草和牧草将ODREB2B基因置于在单子叶中高效表达的Ubi启动子驱动下，通过基因枪和农杆菌介导的方法导入广泛应用的草坪植物如早熟禾、高羊茅、黑麦草、紫羊茅、剪股颍、结缕草、狗牙根以及牧草如苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草、冰草中，使草坪草和牧草的耐早性显著提高，对于解决城市绿化中草坪耗水量大与我国水资源形势严峻的矛盾有重要意义。目前已获得转基因草坪草，并已初步表现出增加耐缺水能力，有助于解决草坪草耗水量大、养护困难的问题。因此这一转基因草坪草在节约城市绿化用水方面很有潜力。
这里应特别指出的是，虽然在本发明的下述实施例中以转基因烟草、草坪草(包括早熟禾、高羊茅、黑麦草、紫羊茅、剪股颍、结缕草、狗牙根等)和牧草(包括苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草、冰草等)的产生及检测举例进一步详细描述了本发明，但这绝不意味本发明制备的诸葛菜ODREB2B基因及其所用的植物表达载体只用于转化和产生表达ODREB2B基因编码蛋白的烟草、早熟禾、高羊茅、黑麦草、紫羊茅、剪股颍、结缕草、狗牙根、苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草、冰草，还包括其它草坪植物和牧草。因为本领域的技术人员可以利用本专利构建好的ODREB2B基因表达载体，利用本专利提供的植物遗传转化方法转化其它草坪植物和牧草植物。
在本发明的一个实施方案中，ODREB2B基因置于Ubiquitin(泛素蛋白基因的5’端调控区，在单子叶植物中组成型表达)启动子的调控之下，构建了适合于单子叶的植物表达载体pAHC-ODREB2B。将该基因连接到pGEM-Teasy载体上，并命名为pT-ODREB2B。NotI酶切pT-ODREB2B，回收约1kb的小片段，连接到pGEM-5Z上，得到中间载体p5Z-ODREB2B。将p5Z-ODREB2B用EcoR V和Sac I酶切，回收小片段，同时将pAHC25用Sma I和Sac I酶切，回收大片段，连接小片段和大片段，转化DH5 α并进行PCR和酶切鉴定后得到pAHC-ODREB2B。该表达载体由于没有LB(Left Border)、RB(RightBorder)，因此不能通过农杆菌介导的方法转化植物，而采取基因枪的方法转化植物。
根据本发明的这一个实施方案，ODREB2B基因的启动子为Ubiquitin，终止子为Tnos；筛选标记基因为Bar，bar基因的启动子亦为Ubiquitin，终止子为Tnos。
在本发明的一个实施方案中，ODREB2B基因置于Ubiquitin启动子的调控之下，构建了适合于用农杆菌转化的植物双元表达载体p3ubiODREB2B。从pT-ODREB2B上选择酶切位点Not I将ODREB2B切下并回收，连接到pUbi-Bar载体上，形成Ubi-ODREB2B-Ubi-bar-Tnos结构，再用Hind III单酶双切将Ubi-ODREB2B单元切下，与p3300-Tnos载体经Hind III酶切后相连接，经过酶切和PCR鉴定重组质粒，最终得到含有如下结构的植物表达载体p3ubiODREB2BLB-Ubiquitin-ODREB2B-Tnos-Ubiquitin-Bar-Tnos-RB根据本发明的这一个实施方案，ODREB2B基因的启动子为Ubiquitin，终止子为Tnos；筛选标记基因为Bar，bar基因的启动子为Uniquitin，终止子为Tnos。
根据本发明的这一个实施方案，该植物表达载体既可以通过农杆菌介导的方法遗传转化植物，亦可以通过基因枪的方法转化植物。
根据本发明的这一个实施方案，构建所选用的原始植物表达载体为CAMBIA公司的pCAMBIA3300表达载体，其植物筛选标记基因为Bar，bar基因的编码产物提供了除草剂(草丁膦)抗性功能。
根据本发明的这一个实施方案，构建所选用的原始植物表达载体除了CAMBIA公司的pCAMBIA3300表达载体外，还可以选用CAMBIA公司的其它表达载体或者本领域技术人员所构建的其它常用的植物表达载体如pGPTV系列，pBI系列pCB系列等。
在本发明的一个实施方案中，植物表达载体导入农杆菌的方法为冻融法。冻融法为本领域技术人员非常熟悉的技术操作，不是本发明的关键。通过PCR检测阳性的农杆菌菌株，用于转化烟草、草坪草和牧草。
根据本发明的这一个实施方案，所选用的农杆菌菌株为LBA4404。
根据本发明的这一个实施方案，所选用的农杆菌菌株除了LBA4404外，还应包括农杆菌的其它菌株，如EHA101。这些菌株的特征是本身含有Vir毒性蛋白区，能够帮助转入的植物表达载体中的T-DNA转移到植物的基因组中。
在本发明的一个实施方案中，转化烟草、草坪草和牧草的一种方法为农杆菌介导法。
根据本发明的这一个实施方案，植物筛选所用的抗生素除了除草剂，还包括卡那霉素，具体选用何种筛选要看选用植物表达载体所对应的标记基因。如选用pAHC-ODREB2B和p3ubiODREB2B载体筛选标记为除草剂。
在本发明的一个实施方案中，转化草坪草和牧草的另一种方法为基因枪法。
根据本发明的这一个实施方案，用于基因枪转化的载体质粒主要是pAHC-ODREB2B和p3ubiODREB2B。这两种载体的植物筛选标记均为除草剂。
本发明用于靶植物的实际转化方法除了农杆菌介导法和基因枪法，还可以使用本领域技术人员所熟知的各种不同的转化技术将重组DNA序列导入待转化的靶植物细胞。这些方法包括但并不仅限于农杆菌介导法，微粒轰击法(即基因枪法)，显微注射法，共沉淀法，电穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等。本领域技术人员可以通过参考有关文献得到详情。最好使被转化的序列稳定的整合到靶植物细胞的基因组中，从而使其在传代的过程中不被丢失。另外，用于转化靶植物的核苷酸序列可以以线性，环形或其它重组载体的形式如人工染色体的形式存在。
本发明的有益效果ODREB2B基因受干旱诱导表达强烈，同时也受寒冷诱导表达，其编码蛋白为DREB类转录因子，具有AP2 DNA结合区，能与一些干旱相关下游基因的启动子区域的干旱反应元件相结合，从而调控耐旱、耐寒相关基因的转录，是植物耐旱机制的上游开关。我们构建了该基因的植物表达载体，并将此耐旱基因导入各类植物中，以提高植物的耐旱耐寒性。将ODREB2B基因导入草坪草和牧草植物后，能有效提高转基因植物的耐旱保水和耐寒能力。转基因株系在离体条件下与未转基因对照株系相比，6小时后保水力提高14～38％，9小时后保水力提高24～56％。在田间种植条件下转基因株系比未转基因对照节水26％～41％。作为耐寒性能的一个指标，转基因株系离子渗漏的相对电导率比对照降低了42％～50％，相对电导率越低，耐寒性能越强。
四、附图简要说明

图1是表示植物表达载体pAHC-ODREB2B构建流程的示图。
图2是表示植物表达载体p3ubiODREB2B的示图。
图3是ODREB2B基因转化草坪草和牧草的PCR检测。
图中扩增条带大小为1kb，电泳带从左到右编号依次为M，1，2，3，4，5，6。M表示分子标记Marker，1为正对照，2为负对照，3-6为不同转基因株系。
图4是ODREB2B基因转化草坪草和牧草的Southern检测。
图中杂交条带大小为1kb，谱带从左到右编号依次为M，1，2，3，4，5，6。M表示分子标记，1为正对照，6为负对照，2-5为不同转基因株系。
图5是转ODREB2B基因草坪草和牧草的Northern检测。
谱带从左到右编号依次为1，2，3，CK。1-3表示不同转基因株系，CK为负对照。
图6是转ODREB2B基因草坪草和牧草的Western Dot Bolt检测。
谱带从左到右编号依次为1，2，3，CK。1-3表示不同转基因株系，CK为负对照。
图7是转ODREB2B基因草坪草和牧草的保水力曲线。
横坐标为离体叶片小时数，纵坐标为叶片含水量百分比。◆表示非转基因对照，●■▲表示三种不同转基因株系。
图8是转ODREB2B基因草坪草和牧草的相对电导率柱状图。
横坐标为不同株系，其中CK表示非转基因对照，A、B、C表示不同转基因株系，纵坐标为相对电导率百分比。
五具体实施例方式所有实施例中的细菌培养和DNA操作均参考《分子克隆实验室操作指南》(金冬雁等译，科学出版社，北京(1993))和《精编分子生物学指南》(颜子颖等译，科学出版社，北京(1998))。分子操作中的工具酶如限制性内切酶均购自Promega公司，New EnglandBiolabs公司。
实施例1 ODREB2B基因的克隆从已发表的拟南芥DREB2A和DREB2B基因序列的比较中，我们设计了包括DREB基因起始密码和终止密码的的一对简并引物，分别为P1和P2，将诸葛菜中DREB2类型基因克隆出来。引物序列如下P15′-GAAGG/AAGATGGCA/TGTT/ATATGAT/ACA-3′P25′-CCGNTTCANCTCGAGNNANANGAT-3′。
其中N指A、T、G、C四种碱基在同一位置上的简并碱基。
利用SDS法提取诸葛菜的基因组DNA，通过PCR扩增得到980bp左右的特异片断，琼脂糖凝胶电泳检测后，纯化回收特异片段，连入pGEM-T Easy载体，送北京博亚生物技术公司进行序列测定。测序结果表明该基因的完整编码区为978bp，编码325个氨基酸。将测序结果与拟南芥中DREB2B基因的序列进行相似性比较，发现诸葛菜中的DREB2B基因与拟南芥中相应基因有69％的同源性，翻译成氨基酸序列后进行相似性比较，两者的相似性亦有46％。将这个新的蛋白序列进行BLAST分析，显示该蛋白的16-169位氨基酸为含有能与DRE顺式作用元件结合的AP2 domain。以上分析说明该基因为诸葛菜中DREB类的新基因，命名为ODREB2B。
细菌质粒DNA的制备(1)挑取单菌落接种于含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；(2)取1.5ml菌液于小离心管中，10,000rpm离心30秒；(3)菌体沉淀重悬于100ul溶液I(50mM蔗糖，20mM Tris.Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0))中，振荡混匀并静置数分钟；(4)加入新鲜配置的200ul溶液II(0.2N NaCl，1％SDS)，轻弹混匀，冰上放置3分钟；(5)加入预冷的150ul溶液III(60ml 5M KAc，11.5ml冰乙酸，28.5ml无菌水)，轻弹混匀，冰上放置5分钟；(6)12,000rpm离心5分钟；
(7)取上清液，加入1倍体积的异丙醇，混匀后在冰上放置10分钟；(8)12,000rpm离心5分钟，弃去上清后稍微晾干，使之溶于200ul无菌水；(9)加入100ul7.5M醋酸铵，轻轻混匀后在冰上放置10分钟；于12,000rpm离心5分钟；(10)取上清液，加入两倍体积无水乙醇后，于冰上或-20℃放置20分钟，12,000rpm离心15分钟；(11)沉淀用70％乙醇清洗，抽干后溶于TE缓冲溶液(10mM Tris.Cl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0))中。
质粒酶切条件30ul反应体系中，加入10×酶切缓冲液3ul，DNA 1-5ug，限制性内切酶1ul(10U)，加无菌双蒸水补至30ul，37℃反应1-2小时，琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
DNA片段的回收(1)从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段(体积不要超过100ul)置于小离心管；(2)加入3倍体积的溶胶液，60℃水浴5分钟，其间轻摇小离心管数次使胶完全溶化；(3)加入10ul玻璃奶，用加样器混匀。室温静置5分钟；(4)离心，3,000rpm数秒，吸弃上清；(5)加125ul漂洗液，混匀。离心弃上清；(6)重复第五步两次；(7)加适量无菌蒸馏水或TE缓冲液，混匀；(8)60℃水浴5分钟；(9)15,000rpm离心数秒。回收上清备用。
连接10ul反应体系中加入5∶1比例量的插入片段和载体片段，1单位T4DNA连接酶，16℃放置10小时左右。
大肠杆菌感受态细胞的制备(1)挑取E.coli DH5α单菌落接种于100ml液体培养基中，37℃培养至OD600约0.4；(2)冰浴10分钟，分装于无菌离心管中，4℃，4,000rpm离心5分钟收集细胞；(3)重悬于600ul冰预冷的0.1M CaCl2中，冰浴30分钟；(4)4℃，4,000g离心10分钟收集细胞。用100ul预冷的0.1M CaCl2重悬细胞沉淀，待用。
感受态细胞的转化(1) 取100ul感受态细胞加5ul连接产物，轻轻混匀，冰置30分钟；(2) 于42℃水中热激90秒，迅速置于冰上冷却1-2分钟；(3) 加200ul LB液体培养基，37℃振荡培养45分钟至1小时；(4) 均匀涂布于含适当抗生素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
重组质粒的筛选与鉴定a.蓝白斑筛选对于载体上含有lacZ基因的重组质粒，可以利用x-Gal/IPTG选择培养基进行初步筛选，没有插入外源片段的自身环化质粒菌落为蓝色，插入外源片段的重组质粒转化子为白色菌落；b.酶切鉴定挑取单菌落于含适当抗生素的3ml LB液体培养基中，37℃培养过夜提取质粒DNA，用适当限制性内切酶进行酶切以判断是否为阳性克隆；c.PCR检测以质粒DNA为模板，用特定引物在适当条件下做PCR扩增反应，电泳检测是否有特异条带。
实施例2 植物表达载体pAHC-ODREB2B的构建ODREB2B基因置于Ubiquitin(泛素蛋白基因的5’端调控区，在单子叶植物中组成型表达)启动子的调控之下，构建了适合于单子叶的植物表达载体pAHC-ODREB2B。将该基因连接到pGEM-Teasy载体上，并命名为pT-ODREB2B。Not I酶切pT-ODREB2B，回收约1kb的小片段，连接到pGEM-5Z上，得到中间载体p5Z-ODREB2B。将p5Z-ODREB2B用EcoR V和Sac I酶切，回收小片段，同时将pAHC25用Sma I和Sac I酶切，回收大片段，连接小片段和大片段，转化DH5α并进行PCR和酶切鉴定后得到pAHC-ODREB2B。该表达载体由于没有LB(Left Border)、RB(Right Border)，因此不能通过农杆菌介导的方法转化植物，而采取基因枪的方法转化植物。ODREB2B基因的启动子为Ubiquitin，终止子为Tnos；筛选标记基因为Bar，bar基因的启动子亦为Ubiquitin，终止子为Tnos。
操作过程中有关质粒提取、酶切、回收、连接、细胞转化、重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定均按照实施例1所述步骤进行。
实施例3 植物表达载体p3ubiODREB2B的构建
ODREB2B基因置于Ubiquitin启动子的调控之下，构建了适合于用农杆菌转化的植物双元表达载体p3ubiODREB2B。从pT-ODREB2B上选择酶切位点Not I将ODREB2B切下并回收，连接到pUbi-Bar载体上，形成Ubi-ODREB2B-Ubi-bar-Tnos结构，再用Hind III单酶双切将Ubi-ODREB2B单元切下，与p3300-Tnos载体经Hind III酶切后相连接，经过酶切和PCR鉴定重组质粒，最终得到含有如下结构的植物表达载体p3ubiODREB2BLB-Ubiquitin-ODREB2B-Tnos-Ubiquitin-Bar-Tnos-RBODREB2B基因的启动子为Ubiquitin，终止子为Tnos；筛选标记基因为Bar，bar基因的启动子为Uniquitin，终止子为Tnos。
该植物表达载体既可以通过农杆菌介导的方法遗传转化植物，亦可以通过基因枪的方法转化植物。操作过程中有关质粒提取、酶切、回收、连接、细胞转化、重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定均按照实施例1所述步骤进行。
实施例4 土壤农杆菌的转化土壤农杆菌感受态的制备(1)将土壤农杆菌菌株LBA4404接种于含适当抗生素的YEB液体培养基中，28℃振荡培养至对数期；(2)4℃，8,000rpm离心5分钟，收集菌体于小离心管中；(3)用600ul冰预冷的500mM CaCl2重悬洗涤细胞；(4)4℃，8,000rpm离心5分钟，细胞沉淀中加入200ul冰预冷的500mM CaCl2，混匀后备用(24hr至48hr使用最佳)；土壤农杆菌的转化(1)分别加入约1ug构建好的植物表达载体质粒DNA，轻轻混匀，于液氮中速冻5分钟，然后37℃温育5分钟；(2)加入600ul YEB液体培养基，28℃轻摇2-4小时；(3)取200ul菌液均匀涂布于含适当抗生素的YEB选择平板上，28℃倒置培养两天。挑几个菌落进行PCR检测，得到阳性菌株。
实施例5 烟草的遗传转化及植株再生烟草的遗传转化采用叶盘法。
叶盘法转化烟草及植株再生
(1)接种农杆菌单菌落于含适当抗生素的2ml YEB液体培养基中，28℃培养1-2天，转接入40ml YEB液体培养基中，28℃继续培养至OD600约0.5，8,000g离心10分钟，菌体用40ml MS液体培养基重新悬浮。
(2)取无菌烟草叶片和不含腋芽的茎段，于MS固体培养基中25℃预培养一天。
(3)重新取出材料，用剪刀切成小块放入无菌MS液体培养基稀释过的农杆菌中，浸泡15-20分钟，其间轻摇几次。
(4)用无菌滤纸吸去多余菌液，于烟草培养基[MS+BA(0.5)+NAA(0.1)+PPT(5.0)+Cb(500)，单位为mg/L]中25℃暗培养两天。
(5)把材料转入烟草培养基[MS+BA(0.5)+NAA(0.1)+PPT(5.0)，单位为mg/L]中，25℃光照培养至分化出愈伤组织，直至长出芽；每14-20天继代培养一次；(6)将长至3-5cm的芽转入烟草生根培养基[1/2MS培养基]上诱导生根；(7)约2-3周后根系形成，移栽于灭菌的土壤中培养。
PCR检测和Southern检测证明ODREB2B基因整合到烟草的基因组中，Northernboltting检测证明ODREB2B基因在转基因植物中正常转录，保水力测定显示转基因株系比未转基因对照保水力明显提高。离子渗漏的相对电导率测定也显示转基因株系耐寒性明显提高。
实施例6 对草坪草和牧草的遗传转化农杆菌介导法(1)成熟种子用0.1％升汞消毒后，先接于N6基本培养基上，让其萌动3天，露出小芽时，将胚纵切后转接于诱导愈伤组织培养基上，形成愈伤(约30天左右)后，每次挑选色泽鲜、增殖快、质地硬的愈伤组织继代培养。
(2)接种农杆菌单菌落于含适当抗生素的2ml YEB液体培养基中，28℃培养1-2天，转接入40ml YEB液体培养基中，28℃继续培养至OD600约0.5，8,000g离心10分钟，菌体用40ml MS液体培养基重新悬浮。
(3)重新取出材料，用剪刀切成小块放入无菌MS液体培养基稀释过的农杆菌中，浸泡15-20分钟，其间轻摇几次。
(4)用无菌滤纸吸去多余菌液，于烟草培养基[N6+BA(0.5)+NAA(0.1)+PPT(5.0)+Cb(500)，单位为mg/L]中25℃暗培养两天。
(5)把材料转入烟草培养基[N6+BA(0.5)+NAA(0.1)+PPT(5.0)，单位为mg/L]中，25℃光照培养至分化出愈伤组织，直至长出芽；每14-20天继代培养一次；(6)将长至3-5cm的芽转入烟草生根培养基[1/2MS培养基]上诱导生根；(7)约2-3周后根系形成，移栽于灭菌的土壤中培养。
基因枪法转化过程包括种子或幼穗(包括草坪植物如早熟禾、高羊茅、黑麦草、紫羊茅、剪股颍、结缕草、狗牙根以及牧草如苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草、冰草)诱导愈伤组织、基因枪轰击、抗性愈伤筛选、苗的分化、植株鉴定。
种子诱导愈伤的步骤成熟种子用0.1％升汞消毒后，先接于MS基本培养基上，让其萌动3天，露出小芽时，将胚纵切后转接于诱导愈伤组织培养基上，形成愈伤(约30天左右)后，每次挑选色泽鲜、增殖快、质地硬的愈伤组织继代培养，继代愈伤可供基因枪转化；幼穗诱导愈伤的步骤取长约0.2～1cm左右的幼穗，用70％乙醇表面消毒后，在超净台内剥出幼穗，接种于诱导诱导培养基上，形成愈伤后，每20天继代培养一次，供基因枪转化；基因枪的转化及苗的分化质粒提取的质粒浓度调整为1μg/μL。子弹配制30mg金粉或钨粉加1mL 100％乙醇旋涡洗涤15分钟，无菌水洗3次，加500μL 50％甘油备用。取上述钨或金粉悬液50μL，加5μL DNA，加50μL 2.5M CaCl2，加20μL 0.1M亚精胺，旋涡，冰上静置15分钟，离心数秒，70％乙醇142μL洗一次，离心数秒，100％140μL乙醇洗一次，离心数秒，加50μL 100％乙醇，供5枪用。
供试基因枪PDS-1000/He(美国伯乐公司)基因枪可裂膜用1350Psi可裂膜，真空度25 InHg，6cm射击距离，每皿射击一枪。枪击前的愈伤组织在含0.4M甘露醇的继代培养基上培养4～8小时，枪击16小时后移入正常继代培养基。枪击后的愈伤组织一周后转至含除草剂2-5mg/L的继代筛选2～4轮，每轮20天。筛选后得到的抗性愈伤组织转入含50g糖的培养基中，光照培养20天，然后转入去掉2，4-D的分化培养基中分化成苗。当小苗长到4-5片叶时，取少量叶片提取植物总DNA，进行PCR检测。小苗长至5～10cm大小时，移入蛭石松针土为1∶1的土中，塑料袋保温一周后，苗即成活。
实施例7 转基因植株的鉴定与检测植物基因组DNA的制备(1)称取0.1g植物叶片或茎组织，于研钵中快速用液氮研至粉末并转入1.5ml离心管中，立即加入500ul的提取缓冲液(500mM NaCl，50mM Tris-Cl PH8.0，50mM EDTA，1％(V/V)β-巯基乙醇)，轻轻混匀；(2)解冻后放置于冰上，加入冰冷20％存贮液PVP(存于-20℃)至终浓度为6％。
(3)加入50ul 20％SDS，轻轻混匀后于65℃水浴10分钟；(4)加入250ul 5M KAc于冰上反应30分钟，离心(15000rpm，10分钟，4℃)。
(5)取上相转入一新的离心管，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀三次，再置于冰上10分钟。离心(15000rpm，10分钟，4℃)，弃去上清；(6)沉淀物抽真空或室温吹干后，溶解于500ul 1×TE(pH8.0)。用1倍体积的饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一至两次，取上相；(7)离心(12000rpm，10分钟，20℃)，取上相转入一新的离心管；(8)加入1倍体积的异丙醇(20℃，5分钟)，并将管至少颠倒5次；(9)离心(15000rpm，10分钟，4℃)，用70％乙醇冲洗沉淀物，抽真空或吹干，最后溶于适量TE(pH8.0)中。
转基因草坪草和牧草的PCR鉴定得到抗生素筛选阳性的转基因草坪草和牧草(早熟禾、高羊茅、黑麦草、紫羊茅、剪股颍、结缕草、狗牙根、苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草、冰草)后，在生长初期，取转基因植株叶片并用SDS法提取植株的总DNA进行PCR鉴定，以合成的ODREB2B基因特异性引物P15’-GAAG G/A AGATGGC A/T GT T/A TATGA T/A CA-3’P25’-AT GAGCTC CTCAAATATCCAGAGAACTC-3’进行PCR扩增，可以得到约1Kb的条带，说明ODREB2B基因已整合至转基因植株的基因组。(见图5转基因草坪草和牧草的PCR鉴定)实施例8转基因植株的Southern检测酶切及电泳提取植物总DNA，取10ug用限制性内切酶消化过夜，电泳检测是否酶切完全，以3V/cm恒压电泳4-6小时。
转膜(1)将凝胶的加样孔及不含样品的多余部分切掉，在0.25M HCl中浸泡10分钟；(2)用蒸馏水稍冲洗后，浸于变性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)中室温变性2次，每次15分钟，其间轻摇数次；
(3)用蒸馏水稍冲洗后，浸于中和液(0.5M Tris.Cl，pH7.4，1.5M NaCl)中于室温中和2次，每次15分钟，其间轻摇数次；(4)用蒸馏水稍冲洗后，浸于10×SSC缓冲溶液中10分钟，其间轻摇数次；(5)在一个较大可以密封的容器中进行转膜；(6)在该容器底部铺上4-7cm的吸水纸，在上面铺三层被10×SSC缓冲溶液微微蘸湿的Whatman 3MM滤纸；(7)凝胶块切除一角作记号正面朝上放于滤纸上，赶除气泡；(8)上面铺五张完全浸润10×SSC缓冲溶液的Whatman 3MM滤纸，密封容器转膜约4小时；(9)转膜结束后将尼龙膜在空气中晾干，用紫外交联仪进行交联。
探针的标记和制备在50ul反应体系中加入5ul 10×PCR buffer，各50pmol引物，1ul dNTP，1ul Taq酶，0.1ul DIG-labeled-dUTP，100pg模板DNA。反应条件根据不同的模板稍有变动。反应结束后电泳检测，标记后的探针比没有标记的产物分子量大。95℃煮5分钟，迅速移至冰水中，-20℃保存备用。
杂交和检测(1)将转移后的尼龙膜置于杂交袋中，放于预杂交液中(10ml/100cm2膜)，赶尽气泡，68℃保温4小时；(2)弃去预杂交液，按2.5ml/100cm2膜的量加入杂交液，杂交液中含DIG标记的探针(2ulDIG探针/1ml杂交液)，68℃杂交16小时；(3)用2×漂洗液(2×SSC，0.1％SDS)洗膜2×5分钟；(4)用0.1×漂洗液(0.1×SSC，0.1％SDS)68℃洗膜2×15分钟；(5)将膜在Buffer I(0.15M NaCl，0.1M马来酸，调pH＝7.5)中平衡1分钟；(6)在Buffer II(Buffer I中加入1％封闭剂)中室温轻摇30分钟；(7)取anti-DIG-AP，13000rpm离心5分钟，按1∶2000稀释于Buffer II中，取20ml该溶液浸泡尼龙膜，室温轻摇30分钟。
(8)用20mlBuffer I洗膜2×15分钟。
(9)在Buffer III(0.1M Tris-HCl pH9.5，0.1M NaCl，0.15M MgCl2)中平衡2-5分钟；(10)按1∶500把检测底物稀释于Buffer III中，把膜在室温下暗处静置反应，当预期条带显现后，立即用Buffer I终止反应。
实施例9 转基因株系的保水力测定称取0.2g转基因和对照样品置于干燥器中，每3小时(3hr，6hr，9hr)测定其重量，24小时再测定重量。
计算保水力值(1-失水量/鲜重)×100％选取具有除草剂抗性、PCR鉴定和Southern阳性的转基因植株及未转基因对照进行保水力测定。结果显示不同的转基因株系在离体条件下保水力均高于对照(见表1)，6小时后保水力提高14～38％，9小时后保水力提高24～56％。
实施例10 不同转基因草坪草和牧草株系的节水性试验将不同转基因草坪草和牧草株系以及未转基因对照均置于旱棚中(防止天然降雨，可通过人工灌溉控制对试验植物的给水量)，经过7～10天的炼苗后同时浇足一次水，之后不再接受天然和人工降水，直到植物叶片开始出现中度萎蔫。测定不同株系萎蔫的天数，节水百分比＝[(转基因株系萎蔫天数-对照株系萎蔫天数)/对照株系萎蔫天数]×100％。统计不同转基因株系的节水百分比，发现转基因株系比未转基因对照能节水26％～41％。(见表2)
表1不同转ODREB2B基因植物株系在3、6、9、24小时的保水力3小时 6小时 9小时 24小时CK84.2％57.3％43.8％19.9％不同株系 94.3％70.2％61.7％24.6％不同株系 97.4％78.8％68.5％30.3％不同株系 91.1％65.3％54.3％23.2％表2不同转基因株系的节水百分比

表3农杆菌YEB培养基配方成分 每升含量(克)牛肉膏提取物 5.0酵母提取物1.0蛋白胨5.0蔗糖 5.0MgSO4·7H2O 0.5琼脂(固体培养基用)10
表4烟草组织培养用MS培养基成分 每升含量(分化培养基)10xMS大量元素母液100ml100x MS微量元素母液10ml100x 铁盐母液 10ml100x 维生素母液10ml1mg/ml 6-苄基腺嘌呤 1.0ml1mg/ml 萘乙酸0.1ml琼脂 9克PH5.8(生根培养基)10xMS大量元素母液100ml100x MS微量元素母液10ml100x 铁盐母液 10ml100x 维生素母液10ml琼脂 9克PH5.8表5草坪草和牧草组织培养用N6培养基单位mg/L(毫克每升)

六、专利菌种说明此专利涉及的菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，单位地址中国北京中关村，该微生物分类名称为大肠埃希氏菌(Escherichia coli(DH5α))，保藏代号为pT-ODREB2B，保藏编号为CGMCC NO.0839，保藏日期为2002年11月22日。
总之，本发明克隆了一个新的编码区为978bp的干旱相关转录因子基因(ODREB2B)，并且利用此基因构建了多个植物表达载体，通过农杆菌介导和基因枪法遗传转化获得了耐旱节水转基因植物。PCR检测和Southern检测证明该基因整合到转基因植株基因组中，Northern和Western Dot Bolt检测证明该基因能在植物中高效表达，保水力测定和节水性试验均证明转基因株系比对照显著提高了耐旱耐寒性，在草坪和牧业中具有重要意义，并且能够大规模放大生产。
序列表<110>林忠平<120>诸葛菜ODREB2B基因在培育耐旱植物中的应用<150>CN02153275.3<151>2002-11-26<160>1<210>1<211>978<212>DNA<213>诸葛菜(Orychophragmus violaceus)<220>
<221>CDS<222>(1)...(978)<400>1atggctgttt atgaacaaac cggaaccaac acttcatcaa agataaggaa atctaggcct 60cgagcagacg gtacaactgt ggctgatagg ttaaagagat ggaaagagtc caaccagaat 120gttgatgaga aaccgcggcg gaaagttcat gctaaagggt cgaagaaagg ctgtatgaaa 180ggtaaaggtg gaccagataa ttctcactgt agttttagag gagttagaca aagggtttgg 240ggtaaatggg ttgcagagat ccgggaacct aataatagag aaagtaggct ttggcttggc 300actttcgata cagcggaaga agctgcttct gcttatgatg aagcggctaa ggttatgtat 360ggaccgttgg ctcggcttaa cttccctcca cagtgtgttg gctctgagtt tacaagttca 420tcaagtcagt ctgaggtgtg tacggttgag gataaggcgg ttcttggtgg tgatgtttgt 480gtgaagcaag aggatgctca tggtgaatct agaccagtta gtgaacatcg agatgtgaat 540agtaggctga gtcacgatgg aatgattgag tttgagcagg attattggag caaagtagcc 600aaggagatgg agttagagat agagatagag atagaggagg aggaggaaga agaaaaggtt 660atacagccac cgtcggagcc gcttactgta gagataccga tggaggaaga agaagaagag 720aaggttatac agccgcagtc ggagccactt actgttgggg attatggttg gctacaaaac 780gggcaggatt tatgggatcc agatgatttt tttgatgttg atgaactcct tggcgatatg 840gatgcaggcc tgttaactgg tcctgaaccg agccaaaaca aaaaccaggt acagcctggt 900ggtaatgatt cacatcctct tcagctggag ccacacgatg gtgatgagtt cttggacttg 960agttctctgg atatttga 978
权利要求
1.从诸葛菜中克隆的如序列表所述的编码区为978bp的干旱相关转录因子基因ODREB2B、部分如序列表所示的核苷酸序列和同源序列、以及利用这些核苷酸序列获得耐旱转基因植物的方法。
2.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于该基因编码一条由325个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白的16-169位氨基酸为含有能与DRE顺式作用元件结合的AP2domain。
3.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于该基因与拟南芥中相应基因(DREB2B)在核苷酸水平上有69％的同源性，在氨基酸水平上有46％的同源性。
4.适合在植物细胞中表达ODREB2B基因的植物表达载体。
5.根据权利要求4所述的植物表达载体，其中包括说明书中提到的pAHC-ODREB2B载体、p3ubiODREB2B载体。
6.根据权利要求4和5所述的植物表达载体，pAHC-ODREB2B载体的特征在于驱动ODREB2B基因的启动子为Ubiquitin，终止子为Tnos，筛选标记为bar基因，启动子为Ubiquitin，终止子为Tnos。
7.根据权利要求4和5所述的植物表达载体，p3ubiODREB2B载体的特征在于驱动ODREB2B基因的启动子为Ubiquitin，终止子为Tnos，筛选标记为bar基因，启动子为Ubiqittuin，终止子为Tnos，目的基因和筛选标记基因两侧有左边界(Left Border，LB)和右边界序列(Right Border，RB)。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于利用克隆的干旱相关转录因子基因ODREB2B构建了植物表达载体，将这些植物表达载体直接通过基因枪法或通过农杆菌介导法导入植物细胞，生长出含有目的基因ODREB2B的转基因植株。
9.根据权利要求1和8所述的方法，所指的植物是指烟草、早熟禾、高羊茅、黑麦草、紫羊茅、剪股颍、结缕草、狗牙根、苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草、冰草。
全文摘要
本发明克隆了诸葛菜(Orychophragmus violaceus，又称二月兰)的一个978bp的干旱相关转录因子的编码基因(ODREB2B)全序列。该基因编码产物为新的干旱诱导的DREB类转录因子，具有AP2 DNA结合区，能与一些干旱相关下游基因的启动子区域的干旱反应元件相结合，从而调控耐旱、耐寒相关基因的转录，是植物耐旱机制的上游开关。该基因与拟南芥中DREB2B基因的核酸序列相似性为69％，氨基酸序列相似性为46％。我们构建了该基因的植物表达载体，并将此耐旱基因导入各类植物中，提高了植物的耐旱耐寒性。
文档编号C12N5/10GK1508252SQ20031011505
公开日2004年6月30日 申请日期2003年11月24日 优先权日2002年11月26日
发明者林忠平, 倪挺, 胡鸢雷 申请人:林忠平