真菌毒素降低的耐旱玉米的制作方法

专利名称：真菌毒素降低的耐旱玉米的制作方法
技术领域：
本发明公开了提供真菌感染抗性和在缺水应激下产量提高的转基因植物，以及产 生和使用这样的植物的方法。
背景技术：
需要提供产量提高、具有耐旱性和真菌毒素(mycotoxin)抗性的玉米植物。发明概述本发明提供真菌抗性转基因作物，其中，真菌抗性由表达一种或多种提供缺水耐 受性或耐热性的蛋白质的重组DNA赋予。这些蛋白质选自冷激蛋白、冷结合因子、NF-YB 转录因子(Hap3 CAAT盒DNA结合转录因子)或其组合。本发明的一方面提供黄曲霉毒 素(aflotoxin)抗性玉米种子。本发明的另一方面提供一种通过由具有表达一种或多种 提供缺水耐受性或耐热性的蛋白质的重组DNA的转基因植物产生玉米种子，而减少在含有 空气传播的曲霉属(Aspergillus)、链格孢属(Alternaria)、镰孢属(Fusarium)和青霉属 (Penicillium)真菌孢子的环境中生长的所述玉米种子中的真菌抗性的方法。本发明还提供了玉米细胞中的非天然玉米DNA，所述玉米细胞包含表达两种或多 种选自细菌冷激蛋白、冷结合转录因子和NF-YB转录因子的蛋白质的构建体。在一个实施 方案中，非天然玉米DNA包含表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) cspB蛋白的重组DNA 和表达玉米NF-YB转录因子蛋白的重组DNA。优选实施方案详述本文使用的“缺水”是指植物所需的水不能以植物所消耗的速度补充的时期。长期 缺水俗称为干旱。如果有适应于植物的生长速度的地下水储备，缺乏雨水或灌溉可能不会 立即产生水应激。在具有充足的地下水的土壤中生长的植物可以在没有雨水或灌溉的情况 下存活，而对于产量没有任何不良影响。在干燥土壤中生长的植物很可能会受到最短的缺 水期的不利影响。严重缺水应激可能会导致枯萎和植物死亡；中度干旱可以导致产量下降、 生长受阻或发育延迟。植物可以从某些水应激时期中恢复，而不会显著影响产量。然而，授 粉时期的水应激可具有不可逆转的降低产量的影响。因此，在玉米的生长周期中观察水应 激耐受性的有用时期是在抽穗前的营养生长阶段后期。水应激耐受性需要与对照植物进行 比较。例如，本发明的植物可以在缺水情况下存活而具有比对照植物更高的产量。在实验 室和田间试验中，可以通过给予本发明植物和对照植物比最佳浇水的对照植物更少的水来 模拟干旱，并检测性状的差异。合适的对照植物可以是用于产生本发明转基因植物的亲本系的非转基因植物。对 照植物在某些情况下可以是包含空载体或标记基因，但不包含在被评估的转基因植物中表 达的本发明重组多核苷酸的转基因植物系。在其它情况下，对照植物是表达具有组成型启动子的基因的转基因植物。在一般情况下，对照植物是与所测试的转基因植物相同的株系 或品种的植物，但缺乏表征转基因植物的赋予性状的特定重组DNA。这种缺乏赋予性状的特 定重组DNA的祖先植物可以是天然的野生型植物、优良的非转基因植物或没有表征转基因 植物的赋予性状的特定重组DNA的转基因植物。缺乏赋予性状的特定重组DNA的祖先植物 可以是具有赋予性状的特定重组DNA的转基因植物的亲缘种(sibling)。这种祖先亲缘植 物可以包含其它重组DNA。转基因“植物细胞”是指例如通过土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化，或通过 使用重组DNA包覆的微粒轰击，用稳定整合的、非天然重组DNA转化的植物细胞。本发明的 植物细胞可以是作为微生物或作为后代植物细胞存在的原始转化的植物细胞，该后代植物 细胞再生为分化组织，例如，再生为具有稳定整合的、非天然重组DNA的转基因植物，或从 后代转基因植物产生的种子或花粉。“转基因”植物或种子是指其基因组已经通过掺入重组DNA而改变的植物或种子， 该重组DNA的掺入例如是通过转化、由转化的植物再生，或通过培育转化的植物而实现的。 因此，转基因植物包括从转化过程获得的原植物的后代植物，包括用野生型植物或其它转 基因植物培育的转基因植物的后代。可以通过将具有赋予性状的重组DNA的转基因植物中 的性状属性与祖先植物中的性状水平进行比较来检测理想性状的提高。可以使用表达蛋白 质以提供水应激耐受性和/或产量提高的重组DNA有利地转化各种植物。具有水应激耐受 性的尤其有用的转基因植物包括玉米(玉蜀黍)、大豆、棉花、油菜(芸苔)、小麦、水稻、苜 蓿、高粱、草类、蔬菜和水果。“表达蛋白质”指的是细胞转录重组DNA为mRNA并翻译mRNA为蛋白质的过程。重 组DNA通常包括5'调控元件(如启动子和增强子内含子)以及3'聚腺苷酸化位点、内含 子、转运肽DNA、标记和本领域技术人员普遍采用的其它元件。“重组DNA”是指通过组合两个以另外方式分离的DNA片段制备的DNA分子，例如， 通过化学合成或通过利用基因工程技术操作分离的核酸片段。重组DNA可以包括外源DNA 或只包括操作的天然DNA。在植物中表达蛋白质的重组DNA通常提供为具有启动子的表达 盒，所述启动子在植物细胞中有活性，可操作地连接至编码提供缺水耐受性或耐热性的蛋 白质(例如，冷激蛋白、冷结合因子蛋白或NF-YB蛋白质)的DNA，该DNA与提供聚腺苷酸化 位点和信号的3' DNA元件连接。有用的重组DNA还包括表达一种或多种赋予除草剂耐受 性和/或抗虫性的蛋白质的表达盒。表达冷激蛋白的有用的表达盒包含连接至编码枯草芽 孢杆菌冷激蛋白B(B. subtilis cspB)的DNA上的水稻微管蛋白A启动子和水稻微管蛋白 A聚腺苷酸化元件。表达NF-YB蛋白的有用的表达盒包含连接至编码玉米NF-YB蛋白质的 DNA上的水稻肌动蛋白启动子和土壤杆菌转录物7 3'聚腺苷酸化元件。表达草甘膦除草 剂选择性标记的有用的表达盒包含连接至编码草甘膦抗性EPSPS蛋白质上的水稻肌动蛋 白启动子和土壤杆菌转录物nos 3'聚腺苷酸化元件。美国专利申请公开2005/0048566A1 公开了水稻微管蛋白A启动子和3'元件；美国专利5，641，876公开了水稻肌动蛋白启动 子；美国专利6，090, 627公开了土壤杆菌3'聚腺苷酸化元件。植物病原体包括真菌，例如，引起白粉病(powdery mildew)、锈病(rust)、叶 斑病(leaf spot)和枯萎病(blight)、立枯病(damping-off)、根腐病(root rot)、冠 腐病(crown rot)、棉铃腐烂病(cotton boll rot)、茎黑腐病(stem canker)、枝黑腐病(twig canker)、脉管枯萎病(vascularwilt)、黑粉病(smut)或霉病(mold)的真 菌，包括但不限于镰孢属的种(Fusarium spp.)、层锈菌属的种(Phakospora spp.)、 丝核菌属的种(Rhizoctonia spp.)、曲霉属的种(Aspergillus spp.)、赤霉属的种 (Gibberella spp.)、 _ ffi M 白勺禾中(Pyricularia spp.)、 ffi M 白勺禾中(Alternaria spp.)和疫霉属的种(Phytophthora spp.)。真菌植物病原体的更具体的例子包括 Phakospora pachirhizi (亚沙|、|大豆 秀病)、高梁柄 秀菌(Puccinia sorghi)(玉米普通 秀 病)、多堆柄锈菌(Pucciniapolysora)(玉米南方锈病)、尖镰孢(Fusarium oxysporum) 和其它镰孢、链格孢属的种、青霉属的种、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)和其它 腐霉(Pythium)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、黄曲霉(Aspergillus flavus) (曲霉穗腐病)、Exserohilum turcicum(北方玉米叶枯病)、Bipolaris maydis (南方 玉米叶枯病)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)(玉米黑粉病)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)(玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae) )、Fusarium verticilliodes (串珠赤 霉(Gibberella moniliformis)) > F. proliferatum(G. fujikuroi var.intermedia)、 F. subglutinans (G. subglutinans) > Diplodia maydis> Sporisorium holci-sorghi、禾 生束ll 盘 f包(Colletotrichum graminicola)、玉 f 大斑病菌(Setosphaeria turcica) > Aureobasidium zeae、.病疫霄(Phytophthora infestans)、大豆疫霄(Phytophthora sojae)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)。人类和其它动物的食品是真菌的主要潜在营养来源。多种真菌的孢子在空气中是 常见的，如果条件适合，真菌可以寄居在食品上。真菌从其环境中摄取用于其成长和发育的 营养。当能源耗尽时，次级代谢产物的产生增加，包括多种导致人类和其它食草动物中毒的 化合物。当这些被称为真菌毒素的化合物被意外地随食物摄入时，它们是危险的。常见的 毒素包括生物碱类、环肽类和香豆素类。这些化合物在极低的浓度时就具有活性，并具有快 速的效应。这些毒素可能导致死亡。在亚致死量时，这些毒素还可能引发癌症，并影响食用 者的生理学。许多化合物是热稳定的，在烹调或处理食品后仍保持活性。损害潜力对于在 加强条件(intensive conditions)下保存的人类食物和牲畜食物特别重要。空气传播的已知产生极高毒性化合物的一些常见真菌包括曲霉属、链格孢属、镰 孢属和青霉属。特别是在湿度高时，这些真菌可以在储存的谷物和动物饲料上生长。它 们还可以在活的棉花、花生和玉米植物中生长，其中，宿主植物的群集(colonization)可 以在种子成熟前发生。昆虫或环境损伤导致的应激可以促进活植物的真菌感染。参见， Cassel 等人， “Aflatoxins-Hazards in Grain/Aflatoxicosis and Livestock “， SouthDakota State University Cooperative Extension Service, FS 907，其中J艮告 “也已发现低于正常的土壤水分(干旱应激)增加空气中的曲霉孢子的数量。所以，当 干旱应激在授粉过程中发生时，增加的接种负荷(空气中的孢子)大大增加了感染的机 会。另外，在授粉过程中影响植物生长的干旱应激、氮应激和其它应激可以增加曲霉真菌 产生的黄曲霉毒素(aflatoxin)的水平。通常，曲霉在穗的未填充部分生长。”参见Xu等 人，2003，“ Progress toward developing stress-tolerant and low-aflatoxincorn hybrids for the southern states “[摘要]，16th Annual AflatoxinElimination Workshop Proceedings,第63页，其中报告“耐旱和耐热的玉米在干旱应激下具有较少的 玉米粒霉菌。，，参见 Anderson 等人，“Managing Drought-Drought Advisory for CornProduction" , NorthCarolina Cooperative Extension Service, AG 519-13,其中描述 “当作物遭受干旱时，曲霉实际上沿玉米穗丝向下移动，感染内核并产生毒素。 任何防止 玉米遭受干旱应激的行动会降低玉米粒中的黄曲霉毒素浓度。”Diener等人，Epidemology of Aflatoxin Formation by Aspergillusflavus, Ann. Rev. Phytopathol. 187,25 249~70 也讨论了玉米通过穗丝的感染。公布的专利申请US 2005/0097640 A1公开了用于转化植物细胞以提供缺水耐 受性的包含启动子和冷激蛋白的DNA构建体。美国专利5，892，009公开了用于转化植物 细胞以提供缺水耐受性的包含启动子和冷结合因子的DNA构建体。公布的专利申请US 2005/0022266A1公开了用于转化植物细胞以提供缺水耐受性的包含启动子和NF-YB转录 因子(也称为Hap3转录因子)的DNA构建体。公布的申请也公开了将DNA构建体引入植 物细胞的转化方法、从转化的细胞再生植物的方法和将重组DNA从再生植物渗入到其它植 物系中的方法。本发明的植物可以用堆叠性状(stacked traits)进一步增强，例如，具有由本 发明公开的DNA表达产生的增强的农学性状结合除草剂抗性和/或害虫抗性性状的农作 物。例如，本发明的基因可以与具有农学益处的其它性状如提供除草剂抗性或昆虫抗性的 性状堆叠，例如使用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的基因以提供对鳞翅目 (lepidopteran)、鞘翅目(coleopteran)、同翅目(homopteran)、半翅目(hemiopteran)禾口 其它昆虫的抗性。植物对其的抗性有用的除草剂包括草甘膦除草剂、麦草畏除草剂、草胺膦 (phosphinothricin)除草剂、碘苯腈(oxynil)除草剂、咪唑啉酮类(imidazolinone)除草 剂、二硝基苯胺除草剂、吡啶类除草剂、磺酰脲类除草剂、双丙氨膦(bialaphos)除草剂、磺 胺除草剂和草铵膦(glufosinate)除草剂。本领域普通技术人员参考U. S. 2003/0106096A1 和 2002/0112260A1 及美国专利 5，034，322、5，776，760、6， 107，549 和 6，376，754 能 够提供堆叠的性状，参考美国专利5，250，515,5, 880，275,6, 506，599,5, 986，175和 U. S. 2003/0150017A1还能够提供昆虫/线虫/病毒抗性。许多用重组DNA转化植物细胞的方法是本领域已知的，且可以用于本发明。两 种常用的植物转化方法是土壤杆菌介导的转化和微粒轰击。美国专利5，015，580 (大 豆)、5，550, 318 (玉米)、5，538，880 (玉米)、5，914，451 (大豆)、6，160, 208 (玉米)、 6，399，861 (玉米)和6，153，812 (小麦)说明了微粒轰击方法，且美国专利5，159，135 (棉 花)、5，824，877(大豆)、5，591，616(玉米)和6，384，301 (大豆)描述了土壤杆菌介导的 转化，本文引入所有这些文献作为参考。对于基于根癌土壤杆菌的植物转化系统，转化构建 体上存在的另外的元件包括T-DNA左和右边界序列，以便于将重组多核苷酸掺入植物基因 组中。一般来说，将重组DNA随机地(S卩，在非特定位置)引入目标植物系的基因组中是 有用的。在特定情况下，以下可能是有用的靶向重组DNA插入以实现位点特异性的整合， 例如，取代基因组中已有的基因，使用植物基因组中已有的启动子，或在已知对于基因表达 具有活性的预定位点插入重组多核苷酸。存在一些已知在植物中起作用的位点特异性重组 系统，包括美国专利4，959，317公开的cre-lox和美国专利5，527，695公开的FLP-FRT。本发明的转化方法优选地在培养基上和在受控环境中在组织培养中实施。“培养 基”是指许多营养物质的混合物，用于在体外(即在完整活生物体外)培养细胞。受体细胞目标包括但不限于，分生组织细胞、愈伤组织、不成熟的胚和配子细胞，如小孢子、花粉、精 子和卵子细胞。可以预期，可以再生为能育植物的任何细胞可用作受体细胞。愈伤组织可 以从以下组织来源开始，包括但不限于不成熟的胚、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够作 为愈伤组织增殖的细胞也是用于遗传转化的受体细胞。美国专利6，194，636和6，232，526 公开了实际用于制备本发明的转基因植物的转化方法和材料，例如，各种培养基和受体靶 细胞，不成熟胚细胞的转化和随后能育转基因植物的再生，本文引入这两篇专利作为参考。
转基因植物的种子可以从能育转基因植物收获，且可以用于培育本发明的转化植 物的后代，包括杂种植物系，用于选择具有增强的性状的植物。除了用重组DNA直接转化植 物以外，还可以通过将具有重组DNA的第一植物与缺乏该DNA的第二植物杂交来获得转基 因植物。例如，可以将重组DNA引入适于转化的第一植物系以产生转基因植物，所述转基因 植物可与第二植物系杂交以将该重组DNA渗入到第二植物系中。带有提供增强的性状(如 产量提高)的重组DNA的转基因植物可以与具有赋予另一种性状(例如，除草剂抗性或害 虫抗性)的其它重组DNA的转基因植物系杂交，以产生具有赋予这两种性状的重组DNA的 后代植物。通常，在这种对于组合性状的培育中，贡献出另外的性状的转基因植物是父系， 而携带基础性状的转基因植物是母系。这种杂交的后代将会分离，致使某些植物携带两种 亲本性状的DNA，某些植物携带一种亲本性状的DNA ；这些植物可以通过与亲本重组DNA相 关的标记来鉴定，例如，通过分析重组DNA的标记鉴定，或者，在选择性标记与重组体连锁 的情况下，通过应用选择剂如用于除草剂耐受性标记的除草剂，或通过选择增强的性状。携 带两种亲本性状的DNA的后代植物可以与母系回交多次，例如，通常为6至8代，以产生除 了具有另一转基因亲本系的重组DNA以外，具有与一个原始转基因亲本系基本上相同的基 因型的后代植物。在转化实践中，在任何一个转化实验中，典型地只将DNA引入一小部分目标植物 细胞中。标记基因用来提供用于鉴定那些通过接收并整合转基因DNA构建体到其基因组中 而稳定转化的细胞的有效系统。优选的标记基因提供选择性标记，其赋予对选择剂(如抗 生素或除草剂)的抗性。本发明的植物可以耐受的任何除草剂是对于选择性标记有用的试 齐U。转化细胞可能暴露于选择剂。存活细胞的群体中是那些通常整合有赋予抗性的基因， 并以足以允许细胞存活的水平表达该基因的细胞。可以进一步测试细胞以证实外源基因的 稳定整合。常用的选择性标记基因包括那些赋予对于如卡那霉素和巴龙霉素(nptll)、潮霉 素B(aph IV)和庆大霉素(aac3和aacC4)等抗生素的抗性的基因，或对于如草铵膦(bar或 pat)和草甘膦(aroA或EPSPS)等除草剂的抗性的基因。美国专利5，550，318、5，633，435、 5，780，708和6，118，047说明了这种选择性标记的例子。也可以采用提供可视化鉴定转化 体能力的选择性标记，例如，表达彩色或荧光蛋白如萤光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)的基 因或表达β-葡糖醛酸酶(glucuronidase)的基因或uidA基因(⑶S)，它们的各种显色底 物是已知的。接触选择性试剂后存活的植物细胞，或已在筛选试验中被评分为阳性的植物细 胞，可以在再生培养基中培养，并允许其发育成熟为植物。从转化的植物细胞再生的发育的 小植物，在转移到温室或生长室成熟之前，可以转移到植物生长混合物中，并且例如在大约 85%的相对湿度、600ppm的CO2和25-250微爱因斯坦(microeinsteir^nTY1光照的环境 控制室中逐步适应(harden off)。取决于初始组织，在鉴定转化体之后再生植物大约6星期至10个月。可以使用本领域技术人员已知的常规植物育种方法对植物授粉，并且结籽， 例如，转基因玉米通常采用自花授粉。可以检测再生的转化植物或其后代种子或植物的重 组DNA的表达，并根据增强的农学性状的存在进行选择。培育由本发明的植物细胞产生的转基因植物，以产生与对照植物相比具有增强的 性状的转基因植物，并产生本发明的转基因种子和单倍体花粉。通过针对增强的性状选择 转化的植物或近交或杂交后代植物鉴定这些具有增强的性状的植物。为了更加 有效，将选 择方法设计为评估多个具有重组DNA的转基因植物(事件)，例如，2至20个或更多转基因 事件的多个植物。从本发明的转基因种子长成的转基因植物证明有提高的农学性状，该性 状导致产量提高或缺水耐受性增强或这两者。并非所有的转基因事件都处于根据如重组DNA的位置和完整性、拷贝数、其它DNA 的意外插入等因素使植物和种子具有增强的或需要的性状的转基因植物细胞中。因此，通 过针对增强的缺水应激耐受性和产量筛选转化的后代植物，来鉴定本发明的转基因植物细 胞。为了更加有效，将筛选程序设计为从2个或更多转基因事件中评估优选地具有单拷贝 重组DNA的多个转基因植物。下面的实施例说明本发明的实施方案。实施例1本实施例描述了用于转化在本发明的各个方面有用的植物细胞的植物表达载体 的构建。如us 2005/0097640A1所公开地制备具有表达细菌冷激蛋白的重组DNA (即cspB) 的转基因玉米，并确认其赋予缺水耐受性。该转基因玉米系用于产生一种转基因玉米近交 系，该近交系与另一种玉米近交系杂交以产生具有该重组DNA的后代杂种玉米种子。该杂 种种子用于产生具有转基因植物细胞的玉米植物，该植物在缺水环境中生长，并且用黄曲 霉(Aspergillus flavus)孢子接种。与对照玉米植物相比，该转基因杂种植物的玉米粒具 有较低的可检测的黄曲霉毒素。实施例2本实施例说明了制备包含表达两种或多种选自细菌冷激蛋白、冷结合转录因子和 NF-YB转录因子的蛋白质的构建体的玉米细胞中的非天然玉米DNA，和包含这种非天然玉 米重组DNA的转基因玉米细胞，和包含这种具有非天然玉米重组DNA的细胞的转基因玉米 种子，以及使用这种种子减少在含有空气传播的曲霉属、链格孢属、镰孢属或青霉属真菌孢 子的环境中生长的玉米植物的玉米种子中的真菌群集的方法。在田地中，在交替的行中种植具有不同的雌性和雄性种质背景的两个不同转基 因玉米植物的种子。在奇数行，种植第一转基因近交雄性种质玉米植物的种子，该植物具 有包含表达枯草芽孢杆菌的细菌冷激蛋白的稳定整合的、非天然重组DNA的细胞，S卩，如 W005033318所公开的。本文引入该申请，尤其是其中提供的公开的冷激蛋白序列，作为参 考。在偶数行，种植第二转基因雌性种质玉米植物的种子，该植物具有包含表达NF-YB转 录因子的稳定整合的、非天然重组DNA的细胞，即，如US20080104730所公开的。这些植物 生长至成熟，在授粉前除去种植雌性种质转基因玉米植物种子的行中的玉米植物的雄花穗 (tassel)，而使种植雄性种质转基因玉米植物种子的行中的玉米植物的花粉对所有行的植 物授粉。授粉后，砍倒产生花粉的植物，而使剩余的植物结出包含具有表达细菌冷激蛋白和 NF-YB转录因子的稳定整合的、非天然重组DNA的细胞的杂种种子。该杂种种子生长至成熟，收获并保存用于再种植。在一块田地中种植保存的具有表达细菌冷激蛋白和NF-YB转录因子的稳定整合 的、非天然重组DNA的细胞的转基因玉米种子，以长成耐受缺水应激的玉米植物作物。在 一块单独的田地中种植通过将非转基因雌性种质玉米植物与非转基因雄性种质玉米植物 杂交而获得的非转基因杂种玉米种子，作为对照。在生长季节中授粉时和在灌浆(grain fill)过程中，使这两块田地都遭受缺水应激。在从灌浆到 收获的期间，这两块田地都遭受 空气传播的包括曲霉属、链格孢属、镰孢属和青霉属的天然真菌的真菌孢子。收获时，分析 每块田地的玉米中是否存在真菌群集，从转基因植物收获的玉米具有明显较低的真菌群集 以及明显较高的产量。在类似条件下，经过几个月的隔离储存，从转基因植物收获的玉米具 有明显较低的真菌群集。实施例3本实施例说明了以替代方式制备包含表达两种或多种选自细菌冷激蛋白、冷结合 转录因子和NF-YB转录因子的蛋白质的构建体的玉米细胞中的非天然玉米DNA，和包含这 种非天然玉米重组DNA的转基因玉米细胞，和包含这种具有非天然玉米重组DNA的细胞的 转基因玉米种子，以及使用这种种子减少在含有空气传播的曲霉属、链格孢属、镰孢属或青 霉属真菌孢子的环境中生长的玉米植物的玉米种子中的真菌群集的方法。通过土壤杆菌介导的转化，使用包含选择性标记的转录单元、表达枯草芽孢杆菌 的细菌冷激蛋白的转录单元和表达NF-YB转录因子(其中，转录因子具有上面段落W011] 所述的元件)的转录单元的质粒载体，转化来自可转化的玉米品种的愈伤组织。在培养基中培养转化的细胞，以促进其生长成为玉米植物，使其结出种子，该种子 具有包含表达枯草芽孢杆菌的细菌冷激蛋白的稳定整合的、非天然重组DNA和表达NF-YB 转录因子的转录单元的细胞。将重组DNA渗入到优良玉米近交系中，以产生具有包含表达 枯草芽孢杆菌的细菌冷激蛋白的稳定整合的、非天然重组DNA和表达NF-YB转录因子的转 录单元的细胞的种子。在田地中，在交替的行中种植转基因玉米植物的种子和非转基因玉米植物的种 子。在奇数行，种植转基因近交玉米植物的种子，该植物具有包含表达枯草芽孢杆菌的细菌 冷激蛋白和NF-YB转录因子的稳定整合的、非天然重组DNA的细胞。在偶数行，种植非转基 因的种子。这些植物生长至成熟，在授粉前除去种植转基因植物种子的行中的玉米植物的 雄花穗，而使非转基因玉米植物的花粉对所有行的植物授粉。授粉后，砍倒产生花粉的植 物，而使剩余的植物结出包含具有表达细菌冷激蛋白和NF-YB转录因子的稳定整合的、非 天然重组DNA的细胞的杂种种子。该杂种种子生长至成熟，收获并保存用于再种植。在一块田地中种植保存的具有表达细菌冷激蛋白和NF-YB转录因子的稳定整合 的、非天然重组DNA的细胞的转基因杂种玉米种子，以长成耐受缺水应激的玉米植物作物。 在一块单独的田地中种植具有同样的遗传背景的非转基因杂种玉米种子，作为对照。在生 长季节授粉时和在灌浆过程中，使这两块田地都遭受缺水应激。在从灌浆到收获的期间，这 两块田地都遭受空气传播的包括曲霉属、链格孢属、镰孢属和青霉属真菌的天然真菌的真 菌孢子。收获时，分析每块田地的玉米是否存在真菌群集，从转基因植物收获的玉米具有明 显较低的真菌群集以及明显较高的产量。在类似条件下，经过几个月的隔离储存，从转基因 植物收获的玉米具有明显较低的真菌群集。
实施例4本实施例说明了如实施例2所述的玉米细胞中的非天然玉米DNA的制备，其中，表 达的蛋白质包括枯草芽孢杆菌CspB蛋白和玉米NF-YB转录因子。通过使具有不同玉米雄性和雌性种质背景的纯合近交系杂交产生杂种玉米种子， 其中的每一种包含表达细菌冷激蛋白或NF-YB转录因子蛋白的非天然玉米DNA。同样的雄 性和雌性种质用于产生所有的转基因和非转基因系。在田地中，在交替的行中种植包含表 达冷激蛋白的重组DNA的雄性种质的转基因纯合近交玉米植物的种子。在其它行种植包含 表达NF-YB转录因子蛋白的重组DNA的雌性种质的转基因纯合近交玉米植物的种子。因 此，在奇数行，种植具有包含表达枯草芽孢杆菌的细菌冷激蛋白的稳定整合的、非天然重组 DNA的细胞的转基因纯合近交雄性种质玉米植物的种子，即，如W005033318所公开的；在偶 数行，种植具有包含低水平表达玉米NF-YB转录因子的稳定整合的、非天然重组DNA的细胞 的转基因纯合近交雌性种质玉米植物的种子，即，如W008002480所公开的。这些植物生长至成熟，在授粉前除去种植NF-YB雌性种质转基因玉米植物种子的 行中的玉米植物的雄花穗，而使种植cspB雄性种质转基因植物种子的行中的玉米植物的 花粉对所有行的植物授粉。授粉后，砍倒产生花粉的植物，而使剩余的植物结出包含具有表 达细菌冷激蛋白和NF-YB转录因子的稳定整合的、非天然重组DNA的细胞的杂种种子。该 杂种种子生长至成熟，收获并保存用于再种植。重复上述步骤，以通过将不同的低水平表达NF-YB的转基因纯合玉米事件(在如上所用的同样的雌性种质中)与上述相同的表达cspB的纯合近交雄性种质玉米植物事件 杂交而产生另外几批杂种种子。种植保存的具有表达枯草芽孢杆菌cspB蛋白和玉米NF-YB转录因子的稳定整合 的、非天然重组DNA的细胞的杂种转基因玉米种子，并测试缺水应激的效应。在相同的田地 中种植对照杂种种子。对照种子1(杂种编号(Hybrid entries)2、4、6和8)来自通过将每 种低水平表达玉米NF-YB的转基因纯合近交雌性种质玉米植物事件与非转基因雄性种质 玉米植物杂交而获得的杂种植物。对照种子2 (杂种编号9)来自通过将表达枯草芽孢杆菌 cspB蛋白的转基因纯合近交雄性种质玉米植物与非转基因雌性种质玉米植物杂交而获得 的杂种植物。对照种子3(杂种编号10)来自通过将雄性与雌性非转基因玉米种质植物杂 交而获得的非转基因杂种对照。因此，除了在cspB和NF-YB植物和表达cspB或NF-YB的 转基因对照中存在转基因以外，测试和对照植物具有相同的遗传背景。在重复产量试验(6个位置，每个位置有3个重复)中种植杂种玉米种子。以相同 的种植密度和重复数种植对照和转基因事件。为了提供缺水应激条件，在V8-R2发育阶段 阻止给玉米植物供水。在缺水事件中，监测植物的干旱应激严重程度的可见症状。一旦观 察到明显的AM叶卷曲，则“脉冲式”给予植物少量的水，以减轻应激严重程度。一旦作物达 到R2发育阶段，在整个余下的生长季重新开始浇水以全面恢复。一旦玉米作物达到生理成熟，即含有10-25%的玉米粒水分，则收获各个地块。将 得到的玉米粒产量对15. 5%的水分标准化，以蒲式耳/英亩(bu/英亩)表示，并在表1中报告。表 1 *优于单基因转基因和对照的事件上述数据表明，可以培育包含表达枯草芽孢杆菌cspB蛋白和低水平表达玉米 NF-YB转录因子蛋白的非天然重组DNA的杂种转基因玉米种子，以产生在缺水应激条件下 比包含单独表达枯草芽孢杆菌cspB蛋白或玉米NF-YB转录因子蛋白的非天然重组DNA的 玉米种子具有更大产量增加的玉米植物作物。从转基因玉米植物收获的玉米粒具有比在缺 水应激条件下生长的非转基因对照显著较少的真菌群集。根据上述公开内容，无需过多的实验就可以制备和使用本文公开并要求保护的所 有材料和方法。虽然在优选的实施方案和说明性的实施例中已经描述了本发明的材料和方 法，但本领域技术人员应当明白，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本 文所述的材料和方法进行变化。本领域技术人员清楚的所有这些类似的替代和修改被认为 是在所附的权利要求限定的本发明的精神、范围和概念之内。
权利要求
一种减少在含有空气传播的曲霉属、链格孢属、镰孢属或青霉属真菌孢子的环境中生长的玉米植物的玉米种子中的真菌群集的方法，其中，所述方法包括由具有表达两种或多种提供缺水耐受性的蛋白质的重组DNA的转基因植物产生所述玉米种子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述两种或多种蛋白质选自冷激蛋白、冷结合因 子、NF-YB转录因子或其组合。
3.根据权利要求2所述的减少在含有空气传播的曲霉属、链格孢属、镰孢属或青霉属 真菌孢子的环境中生长的玉米植物的玉米种子中的真菌群集的方法，其中，所述方法包括 由具有含有改变的基因组的细胞的缺水耐受性转基因植物产生玉米种子，所述改变的基因 组包含表达细菌冷激蛋白和NF-YB转录因子的稳定整合的、非天然重组DNA。
4.玉米细胞中的非天然玉米DNA，所述玉米细胞包含用于表达两种或多种选自细菌冷 激蛋白、冷结合转录因子和NF-YB转录因子的蛋白质的构建体。
5.根据权利要求4所述的玉米细胞中的非天然玉米DNA，其中，所述构建体表达枯草芽 孢杆菌cspB和玉米NF-YB转录因子。
6.根据权利要求5所述的非天然玉米DNA，其中，所述玉米NF-YB转录因子以低水平表达。
7.包含权利要求4所述的非天然玉米重组DNA的转基因玉米细胞。
8.包含权利要求5所述的非天然玉米重组DNA的转基因玉米细胞。
9.包含具有权利要求4所述的非天然玉米重组DNA的细胞的转基因玉米种子。
10.包含具有权利要求5所述的非天然玉米重组DNA的细胞的转基因玉米种子。
11.由权利要求5所述的转基因玉米种子长成的玉米植物作物，其中，与对照玉米植物 相比，所述玉米植物在缺水条件下产量提高并且真菌群集减少。
全文摘要
具有表达一种或多种提供缺水耐受性的蛋白质的重组DNA的转基因玉米植物，在缺水条件下产量提高并且真菌抗性改善，并且在从经受缺水耐受性的植物收获的玉米粒中显示较低水平的真菌毒素群集。
文档编号A01H1/00GK101842002SQ200880114472
公开日2010年9月22日 申请日期2008年10月10日 优先权日2007年10月11日
发明者B·哈蒙德, D·安斯特罗姆, J·希尔德, J·希德里克 申请人:孟山都技术公司