专利名称：用于产生耐温植物的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于产生具有新颖性质的植物的方法，更具体地说，一种用于产生对环境胁迫具有强抵抗力的耐温植物的方法。
现有技术许多有机体通过在它们的细胞质中合成和积累一种所谓的“相容溶质”的特异性化合物(其保护有机体自己免受这样的胁迫)，使自己适应重度的环境胁迫。有机体显示出能由上述机制使自已适应的环境胁迫包括盐类(Imhoff等，FEMS微生物学评论3957-66，1986；Mackay等，微生物遗传杂志1302177-2191，1984；Rhodes和Hanson，植物生理学植物分子生物学年鉴44357-384，1993)、脱水(Yancy等，科学2171214-1222，1982)和低温(Ko等，细菌学杂志176426-431，1994)。
在那些相容溶质中，甘氨酸甜菜碱(下文称作甜菜碱)广泛分布于高等植物(Robinson和Jones，澳大利亚植物生理学杂志13659-668，1986)、细菌(Csonka，微生物学评论53121-147，1989)和动物(Garcia-Perez和Burg，生理学评论711081-1115，1991；Lever等，生物化学生物物理学学报1200259-264，1994)中。如
图1所示，甜菜碱是一种在其分子上具有正电荷和负电荷的双极化合物(Rhodes和Hanson，植物生理学植物分子生物学年鉴44357-384，1993)。一篇关于甜菜碱的生理功能的长篇论述认为甜菜碱可以通过保持与环境之间的渗透平衡保护细胞(Robinson和Jones，澳大利亚植物生理学杂志13659-668，1986)，并且甜菜碱可以稳定蛋白质的高级结构(Bernard等，科学院科学111，30799-104，1988；Papageorgiou和Murata，光合研究44243-252，1995)。然而，甜菜碱不仅仅在盐胁迫或者脱水胁迫下的细胞中合成。因此，不能得出甜菜碱对使细胞免受上述胁迫的保护作用具有直接效应。
在大肠杆菌和菠菜属(菠菜)中，甜菜碱是经如图1所示的两步氧化从胆碱生物合成而得的。另一方面，获自革兰氏阳性土壤细菌球形节杆菌的胆碱氧化酶能够在一步氧化反应中把胆碱氧化成甜菜碱(Ikuta，S.等，生物化学杂志821741-1749，1977)。
在研究甜菜碱的直接效应的努力中，我们分离了编码新颖的胆碱氧化酶(其催化胆碱氧化成甜菜碱)的codA基因(日本植物生理学家学会，1994年年度会议第34届讨论会，1994三月28-30日召开)，并且把它整合到蓝细菌属菌株聚球蓝细菌属PCC7942与十字花科植物的细胞中，因此成功地获得了耐盐和/或耐高渗透(osmotolerant)植物(日本专利申请号106819/95)。这证实甜菜碱有保护有机体免受盐胁迫的功能。
然而，没有报告表明甜菜碱授予植物或者细菌以耐温性质。
本发明的目的就是由基因重组技术产生能够耐受环境变化(如高温或低温)的植物。
发明的公开作为悉心研究以解决上述问题的结果，我们通过整合和表达编码蓝细菌、十字花科植物和禾本科植物中的胆碱氧化酶的基因，成功地获得了耐温植物。
因此，本发明提供了用于产生耐温植物的方法，该方法包括用携带编码胆碱氧化酶的基因的重组载体转化植物。
本发明也提供了由上述方法产生的耐温植物或者其具有同样性质的后代。
附图简要描述图1显示从胆碱至甜菜碱的氧化过程的图解。
图2A显示用于转化聚球蓝细菌属PCC7942的构建体的图解。PAM指以pAM1044转化的聚球蓝细菌属PCC7942，PAMCOD指以携带codA基因的pAM1044转化的聚球蓝细菌属PCC7942。虚线箭头指示用于PCR的引物。三角形表示conII启动子。箭头指示基因的取向。
图2BSDS-PAGE(电泳照片)，显示壮观霉素抗性基因与聚球蓝细菌属PCC7942的DNA中的codA基因对染色体的完全置换。泳道aλ-HindIII/φx174-HaeIII片段；泳道b聚球蓝细菌属PCC7942的野生型菌株；泳道c菌株PAM；泳道d和e菌株PAMCOD(泳道b、c和d显示利用引物1和2的PCR结果，泳道e显示利用引物1和3的PCR结果)。
图3Western印迹分析(电泳照片)，显示在聚球蓝细菌属PCC7942菌株PAM和PAMCOD中的胆碱氧化酶的表达。泳道a菌株PAMCOD的蛋白质提取物；泳道b菌株PAM的蛋白质提取物；泳道c纯化的胆碱氧化酶。
图4在各种温度下在BG 11培养基(补加有1mM胆碱氯化物)中的琼脂平板上生长10天的聚球蓝细菌属PCC7942菌株的生长结果(照片显示有机体的形态学)。1和4PAM菌株；2和3PAMCOD菌株。
图5聚球蓝细菌属菌株PCC7942PAM(O)和PAMCOD(●)在照明之下在补加1 mM胆碱氯化物的BG11培养基中的生长。A在42℃下生长；B在20℃下生长。
图6在低温下，存在1mM NaHCO3(A)或者存在1，4-苯醌和1mMK3Fe(CN)6(B)时，聚球蓝细菌属菌株PCC7942PAM(○)和PAMCOD(●)的光合释氧水平。
图7显示codA基因的限制酶图的图解。
图8显示用于拟南芥属转化的二元载体质粒pGAH/codA的结构图解。
图9在拟南芥属野生型和转化植物的可溶性组分中的胆碱氧化酶的Western印迹分析(电泳照片)。泳道1来源于市售的球形节杆菌的胆碱氧化酶(Sigma化学公司，St.Louis，MO，美国)；泳道2野生型植物的可溶性组分；泳道3转化植物的可溶性组分。
图10低温对拟南芥属野生型和转化植物叶子的光化学系统II的影响。(○)野生型植物；(●)转化植物。
图11在拟南芥属野生型和转化植物叶子上，低温的光合抑制作用(A)和从低温光合抑制作用的恢复(B)。(○)野生型植物；(●)转化植物。
图12在拟南芥属野生型和转化植物叶子上的冻结抗性试验结果。(○)野生型植物；(●)转化植物。
图13在拟南芥属野生型和转化植物种子萌发的吸水阶段的低温影响(照片显示有机体的形态学)。A在吸水阶段未经低温处理萌发的种子；B在吸水阶段低温处理之后萌发的种子。在A和B中，左边的W显示野生型植物种子的结果，右边T显示转化植物种子的结果。
图14用于水稻转化的两个嵌合codA基因的结构，即35SINTPcodA和35SINcodA。
图15NMR图，图解表示野生型菌株在水稻植物上的甜菜碱积累量、不表达codA基因的转化体(A)以及表达codA基因的转化体(B)。图中，GB和Ch表示分别对应于甜菜碱和胆碱的峰值。
图16按照与最大活化值(假设为100％)之比的相对值，图解表示codA基因引入聚球蓝细菌属PCC7942对由光化学系统II介导的电子传递的影响。(○)照明下的PAM细胞；(●)照明下的PAMCOD细胞；(□)在暗处的PAM细胞；(■)在暗处的PAMCOD细胞。
图17当codA基因引入聚球蓝细菌属PCC7942时，电子传递(由光化学系统II介导的)从低温光抑制中的恢复。(○)照明下的PAM细胞；(●)照明下的PAMCOD细胞。
图18当codA基因引入聚球蓝细菌属PCC7942时，黑暗条件下的低温处理对光合释氧的影响。(○)照明下的PAM细胞；(●)照明下的PAMCOD细胞。
图19当codA基因引入聚球蓝细菌属PCC7942时，低温处理对脂相转变的影响。(○)照明下的PAM细胞；(●)照明下的PAMCOD细胞。
图20电泳图谱，显示当codA基因引入聚球蓝细菌属PCC7942时可溶性组分和膜组分中的蛋白质变化。泳道1胆碱氧化酶；泳道2PAM细胞的原生质膜；泳道3PAMCOD细胞的原生质膜；泳道4PAM细胞的类囊体膜；泳道5PAMCOD细胞的类囊体膜；泳道6PAM细胞的可溶性组分；泳道7PAMCOD细胞的可溶性组分。箭头表示胆碱氧化酶。
发明的最好实施方案如本文所使用的，耐温性意指转化植物能够在比非转化植物的正常生长温度高或者低的温度下生长的能力。
编码用于本发明的胆碱氧化酶的基因是编码能够在一步反应中把胆碱转变为甜菜碱的蛋白质的并且可以得自节杆菌属的革兰氏阳性土壤细菌的基因。例如，它可以优选得自球形节杆菌和滋养节杆菌，尤其是球形节杆菌。
我们克隆了编码胆碱氧化酶(得自球形节杆菌)的codA基因，并且测定了它的核苷酸序列。codA基因包含一个1641bp的开放读框，该开放读框编码547个氨基酸。codA基因的核苷酸序列和氨基酸序列如序列表的SEQID NO1所示。
这样的编码胆碱氧化酶的基因可以整合到适当载体中以转化植物。然后，在特征表达中所涉及的一个适当启动子或者一段序列可以引入上述载体以在植物中表达基因。
编码胆碱氧化酶的基因不仅可以包括编码序列表中的SEQ ID NO1氨基酸序列的核苷酸序列，而且可以包括这样一种核苷酸序列，当其编码具有胆碱氧化酶活性的蛋白质时，一个或多个氨基酸加入到上述氨基酸序列中，和/或上述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被缺失和/或取代。
本发明方法可以将耐温性状授予从蓝细菌到高等植物范围的各种植物。蓝细菌广泛地用作为高等植物的模型有机体，因为它们具有与高等植物基本上相同的光合机理，同时它们易于转化从而在短时间内给出结果。一些易于转化的蓝细菌容易接受胞外DNA进入它们的细胞中以产生有效的重组。这样的蓝细菌包括聚球蓝细菌属PCC7942、聚球蓝细菌属PCC6301(ATCC 27144)和集胞蓝细菌属PCC6803(ATCC 27184)(蛋白质，核酸，酶，35卷，14期，pp.2542-2551，1991；微生物学关键评论，13卷，1期，pp.111-132，1985)。
高等植物包括双子叶植物和单子叶植物。在下面描述的例子中，高度耐温植物能够从作为双子叶植物的十字花科植物中获得，但是这并不是限制性的，可以利用其它科和属的双子叶植物。本发明方法也可以应用于单子叶植物。人们发现单子叶植物水稻(其原来缺乏合成甜菜碱能力)在用本发明方法转化之后获得了这一能力。
可以整合入编码胆碱氧化酶的基因中的载体、转化方法以及转化植物的选择都是可以适当地选择的，这取决于被转化植物的性质(包括植物细胞)。
例如，诸如pUC303的质粒可以用于蓝细菌。然后，具有所需性质的转化体可以由插入到质粒中的抗生素抗性基因选择。按照本发明，通过用编码胆碱氧化酶(得自球形节杆菌)的codA基因转化蓝细菌属聚球蓝细菌属PCC7942，成功地获得了显示耐高温和低温性的植物。
当在BG11培养基(补加有胆碱氯化物)中培养用codA基因转化的聚球蓝细菌属PCC7942时，发现转化聚球蓝细菌属接受外源供给的胆碱从而把它转化成甜菜碱，并且积累甜菜碱至高达大约80mM的水平。然而，这样的积累在缺乏codA基因的聚球蓝细菌属菌株的对照组中没有观察到。
当在BG11培养基(补加有胆碱氯化物)中在42℃下培养用codA基因转化的聚球蓝细菌属菌株和非转化菌株的对照组以检查它们对高温的反应时，转化聚球蓝细菌属停止生长一天，然后又开始生长。非转化的对照组在42℃下完全不生长。当在20℃下培养以检查它们对低温的反应时，转化菌株缓慢生长4天但是然后开始迅速生长。然而，非转化的对照组即使在4天之后仍然缓慢生长。利用固体培养基的生长试验也显示与非转化菌株比较，转化菌株在高温和低温都生长良好。这些结果揭示在高温和低温下，用codA基因转化的聚球蓝细菌属菌株都比非转化菌株生长得好得多。
人们已经指出甜菜碱不仅充当渗透保护剂而且也在光自养有机体的光合机理保护中起着重要作用(Murata等，FEBS Lett.296187-189，1992)。因此，在各种低温下，在暗处培养照本发明转化的聚球蓝细菌属菌株和非转化菌株以检测光合作用的耐温性。结果是，在低温下，在光合释氧水平和由细胞光化学系统II介导的电子传递的灭活方面，转化菌株和非转化菌株之间存在着极大的差异。换句话说，转化菌株的光合释氧水平比非转化菌株的更耐低温。以转化菌株的细胞光化学系统II介导的电子传递活性也比非转化菌株的更耐低温，即非转化菌株的活性在5℃下降低至原来水平的50％，而转化菌株的活性在5℃下几乎仍然保持原来的水平并且在低于5℃时开始降低。
人们以前已经知道，聚球蓝细菌属PCC7942生长的最佳温度在30-38℃范围内。因此，人们推论出在如42℃一样的高温下，通过一些蛋白质结构的变性使非转化菌株的细胞生长受阻。然而，携带codA基因的转化菌株能够生长，可能是因为在细胞上积累的大约80mM甜菜碱阻止了蛋白质的变性。在20℃下，非转化菌株不能生长，但是转化菌株(其中codA基因已被整合)能够生长。这也是甜菜碱积累引起的。此外，人们也认为细胞质中甜菜碱的积累提高了蓝细菌属细胞在暗处的耐低温能力。然而，本发明并不限于上述作用机理。
这些结果意味着，极好的耐高温和耐低温能力已经授予按照本发明方法由编码胆碱氧化酶的基因转化的聚球蓝细菌属。
可以利用原生质体或一部分组织由基因转移技术转化双子叶植物。在利用组织片段的基因转移的情况下，可以利用土壤杆菌属的Ti质粒。愈伤植物的组织片段可以用土壤杆菌属(编码胆碱氧化酶的基因已整合入其中)感染，可以由对抗生素如卡那霉素的抗性选择，然后在芽中分化以产生转化植物。
在本发明中，通过用如下的编码胆碱氧化酶的基因转化十字花科植物拟南芥，可以获得耐高温植物。
制备携带codA基因的二元载体质粒pGAH-codA并将其整合入携带Ti质粒的根癌土壤杆菌EHA 101。用所产生的土壤杆菌属EHA101(pGAH/codA)(掺入codA基因)感染拟南芥属的下胚轴愈伤组织，然后形成芽并由卡那霉素和潮霉素抗性选择该芽以诱导根和形成种子。得自所产生的杂合T2种子的植物自育地产生纯合T3个体，播种该个体从而形成转化植物。
这样获得的转化植物显示胆碱氧化酶已经转运至叶绿体。当测量叶片中的胆碱和甜菜碱水平时，在野生型植物中仅仅观察到胆碱，而在转化植物中胆碱和甜菜碱都能观察到，这暗示在经过codA基因转移的植物上有甜菜碱积累。与野生型植物相比，转化植物显示了显著的耐温性。
单子叶植物水稻(Oryza sativa L.cv.Nippon bare)可以由例如两个在质粒pUC119上制备的嵌合codA基因(在花椰菜花叶病毒35S启动子的转录控制下的翻译之后，该基因定位在胞质溶胶或者质体中)转化。两个嵌合基因包括水稻衍生的、在5′非翻译序列上以便提高表达水平的内含子。
通过下列步骤能够产生一种转化水稻。换句话说，通过用基因枪装置把上述嵌合codA基因与选择标记潮霉素抗性基因一道引入水稻种子的盾片愈伤组织的悬浮培养细胞中，然后基于抗生素抗性选择转化愈伤组织并把它们再分化成植物，能够获得一种转化水稻。
虽然野生型水稻缺乏合成甜菜碱能力，但是用本发明方法转化的水稻获得了合成甜菜碱能力。在耕作和水培条件下，表达codA基因的转化水稻与非转化植物同样地生长而不显示任何明显的异常。由此可以得出作为甜菜碱合成的副产物形成的过氧化氢在细胞中有效地解毒了。考虑到蓝细菌和双子叶植物的甜菜碱合成能力获得和耐温性之间的关系，可以预期由本发明方法获得的转化水稻也已获得耐温性。这是第一例，其中水稻通过基因工程技术获得了甜菜碱合成能力。
当在实验中利用聚球蓝细菌属比较转化的和非转化的植物(在黑暗条件下放置之后)的光化学系统II的恢复能力时，转化植物恢复更迅速，这表明甜菜碱的存在加速了光化学系统II的恢复。这也显示转化植物的光合作用比非转化植物的更耐低温。考虑到在转化植物和非转化植物之间的膜脂和蛋白质方面没有发现任何大的差异，在低温下在转化植物中观察到的光化学系统II的保护似乎是甜菜碱的效应。
本发明范围不仅覆盖如上描述所产生的耐温植物或者其具有同样性质的后代，而且也覆盖得自上述植物的植物细胞(例如愈伤组织培养细胞)和植物器官(例如花、种子、果实、块茎等)以及其后代。
按照本发明，能够获得对环境胁迫具有高度抵抗力的耐温转化植物。本发明方法能够用来产生在高温或低温条件下(在该条件下植物通常不能生长)能够生长的植物。能够由本发明方法授予耐温性的植物的范围是非常广泛的，从光合细菌到高等植物。尤其是，本发明是在工业上十分有用的，因为它是第一例，其中稳定的转化植物得自包括绝大多数主要农作物在内的单子叶植物并且为它们的甜菜碱合成能力所证实。
按照本发明用于产生耐温植物的方法是十分有用的，因为它能够用来产生能耐高温和耐低温的植物。下列实施例将更详尽地说明本发明，但是这些实施例不应该理解为是对本发明范围的限制。实施例实施例1携带codA基因的蓝细菌属聚球蓝细菌PCC7942的转化(1)codA基因的克隆按照日本植物生理学家学会1994年年度会议第34次讨论会上发表的口头报告的摘要中描述的方法，从球形节杆菌中分离得到胆碱氧化酶基因。简言之，1)用溴化氰片段化胆碱氧化酶，2)测定适当片段的N末端氨基酸序列，3)适当部分选自上述氨基酸部分序列以合成与之相应的寡核苷酸，4)利用上述寡核苷酸作为引物由PCR(聚合酶链反应)扩增胆碱氧化酶基因的部分序列，5)扩增的胆碱氧化酶基因部分序列用作为探针以筛选球形节杆菌的基因组DNA文库。
将这样获得的阳性克隆亚克隆到质粒pBluescript(SK+)(Stratagene)中以分离阳性克隆，使之易于进行Southern印迹分析。将3.6kbp与上述探针杂交的XbaI-XhoI片段亚克隆到pBluescript中，并且作出限制酶图。测定从第一个SalI位点到XhoI位点范围内的核苷酸序列(大约2.5kbp)。
结果显示胆碱氧化酶基因包含1641bp的开放读框，其编码有547个氨基酸残基的多肽。胆碱氧化酶编码基因的氨基酸序列和核苷酸序列如序列表的SEQ ID NO1所示。
(2)携带codA基因的聚球蓝细菌PCC7942的转化用限制酶BstEII(在从翻译起点开始的-40位置处)和SmaI(终止密码子的下游)消化质粒pBluescript(携带codA基因)。BstE II-粘性末端填补了Klenow片段(Takara，东京，日本)。把包含codA基因编码区和推定的核糖体结合位点的平端片段插入到质粒pAM1044的SmaI位点。基因(其似乎在pAM1044的conII启动子控制下得到表达)的正确取向由限制酶分析确认。conII启动子是大肠杆菌启动子的共有序列，包含核苷酸序列TTGGACA(-35)与TATAAT(-10)。
质粒pAM1044和包含codA基因的质粒用来转化聚球蓝细菌PCC7942(通过Elhai等方法)。所产生的转化体指定作为菌株PAMCOD。作为对照，聚球蓝细菌PCC7942以pAM1044单独转化并指定作为菌株PAM。
选择转化体在包含30μg/ml壮观霉素的BG11琼脂平板上完成。在从单一菌落到包含壮观霉素的新鲜BG11平板的几次继代移植之后，壮观霉素抗性基因和codA基因完全插入所有染色体拷贝中，这可由利用图2A所示的引物的PCR(聚合酶链反应)证实。壮观霉素抗性基因和codA基因完全插入聚球蓝细菌染色体中，这可由联合利用引物1和2的PCR证实。
在通气(30℃、含1％CO2)和70μE m-2s-1的白炽灯照明条件下，在BG11培养基(Stanier等，细菌学评论35171-205，1971)中完成PAMCOD与PAM菌株的培养，该培养基补加有1mM胆碱氯化物(KitayamaChemical)。在下述所有实验中均利用对数生长的细胞。在叶绿素浓度调至5-10μg/ml的细胞密度条件下测定光合活性。实施例2插入转化体中的基因的确认以得自聚球蓝细菌PCC7942的野生型、PAM和PAMCOD菌株的DNA作为PCR模板，用SDS-PAGE分析所扩增的产物。结果如图2B所示。
野生型菌株DNA的PCR产生一种大约400bp的扩增产物(图2B，b泳道)。利用PAM菌株DNA作为模板的PCR产生大约2.4kb的条带，表明pAM1044已经插入到染色体中。不存在在野生型菌株中观察到的大约400bp的条带，表明在菌株PAM中天然染色体已完全由突变染色体取代。
当PAMCOD的DNA用作为模板时，观察不到与野生型染色体相对应的条带(图2B，c泳道)。然而，预知的大约4.1kb的条带也没有扩增，有可能是因为插入体的尺寸大和codA序列中GC含量高。因此，将与codA基因编码区对应的引物3(图2A)与引物1结合使用。大约2.6kb的预知条带得到扩增(图2B，d泳道)，表明在菌株PAMCOD染色体中存在codA基因。实施例3聚球蓝细菌PAMCOD菌株中的codA基因的表达利用针对纯化胆碱氧化酶的多克隆抗血清，由Western印迹分析，检验实施例1所获得的PAMCOD菌株中的codA基因的表达。结果如图3所示。在PAMCOD菌株的蛋白质提取物(a泳道)和纯化胆碱氧化酶(c泳道)中在60kDa时检测到信号。而在PAM菌株的蛋白质提取物(b泳道)中没有检测到该信号。这一结果证明在conII启动子控制下codA基因在聚球蓝细菌PCC7942中得到表达。实施例4细胞中甜菜碱浓度的分析转化细胞在1升补加有5mM胆碱氯化物的培养基中生长。通过加入不同浓度NaCl给以盐胁迫。在25℃下用1M H2SO4处理所获得的细胞20小时，由高碘酸盐沉淀技术从混合物中回收甜菜碱(Wall，J.S.等，分析化学32870-874，1960)。将甜菜碱高碘酸盐溶解在1ml包含2mM 2-甲基-2-丙醇(Wako)的甲醇-d4(Wako)中作为内标。在NMR管中利用Bruker AMX360 Wb测量该溶液的1H NMR光谱。通过与标准曲线比较总峰值来量化甜菜碱。
基于从负染色细胞的电子显微照片中估算的细胞体积，测定PAMCOD菌株的细胞中的甜菜碱浓度。单细胞的胞质为长2.14μm、直径0.82μm的圆柱形，细胞体积估计为大约1.13μm3。
结果计算得到PAMCOD菌株细胞中的甜菜碱浓度为大约80mM。然而，在缺乏codA基因的PAM菌株中未发现甜菜碱的任何痕迹。实施例5高温和低温胁迫下的生长(1)在固体培养基中的生长试验在高温下生长把聚球蓝细菌PAM、PAMCOD菌株转移到BG11培养基(补加有1mM胆碱氯化物)中的琼脂平板上，分别在40℃、42℃和44℃下观察其生长。结果如图4A所示。在40℃下两种菌株的生长几乎完全相同。在44℃下两种菌株都不生长。在42℃下，PAM菌株生长十分缓慢而PAMCOD菌株长势很好。
在低温下生长把聚球蓝细菌PAM、PAMCOD菌株转移到BG11培养基(补加有1mM胆碱氯化物)中的琼脂平板上，分别在22℃、20℃和18℃下观察其生长。结果如图4B所示。在22℃下两种菌株的生长几乎完全相同。在20℃下PAMCOD菌株生长速度快于PAM菌株。在18℃下两种菌株生长状况都不好。
(2)在液体培养基中的生长试验在高温下生长将预先在30℃下在BG11培养基(补加有1mM胆碱氯化物)中生长的聚球蓝细菌PAM与PAMCOD菌株细胞转移到42℃下生长，通过监测在730nm波长处的浊度来评估其生长状况。结果如图5A所示。在第一天，PAMCOD菌株细胞停止生长，但随后又恢复生长。然而，PAM菌株细胞则完全不生长。
在低温下生长将在30℃下预先生长在BG11培养基(补加有1mM胆碱氯化物)中的聚球蓝细菌PAM与PAMCOD菌株细胞转移到20℃下生长，通过监测在730nm波长处的浊度来评估其生长状况。结果如图5B所示。PAMCOD菌株细胞在四天内生长缓慢，但随后迅速生长。而PAM菌株细胞在四天后仍然生长缓慢。实施例6低温胁迫下的光合活性对低温胁迫引起的光合释氧灭活进行检测。使预先在30℃下生长的菌株PAM与PAMCOD细胞转移至暗处在不同温度条件下生长。之后，在30℃下在存在1mM NaHCO3或存在1，4-苯醌和1mM的K3Fe(CN)6的条件下，利用Clark型氧电极测定光合释氧活性。
在低温条件下的光合活性在0℃至20℃的不同温度下在暗处使细胞生长1小时，然后在30℃生长5分钟。在生长之后，用上述方法测定光合释氧活性。当存在CO2时，菌株PAM与PAMCOD的细胞显示了分别为387±23和379±19μmoleO2/mg叶绿素/小时的绝对光合释氧活性；当存在1，4-苯醌和K3Fe(CN)6时，则显示了分别为802±36和740±82μmole O2/mg叶绿素/小时的绝对光合释氧活性。
结果如图6所示。(A存在NaHCO3；B存在1，4-苯醌和K3Fe(CN)6)。如图6A所示，菌株PAMCOD的光合释氧活性与菌株PAM相比对低温更具耐受性。如图6B所示，菌株PAMCOD的以光化学系统II为介导的电子传递活性与菌株PAM相比，也更耐低温，即在5℃时菌株PAM的活性降低至初始水平的50％，而菌株PAMCOD在5℃时几乎仍保持初始水平的活性，低于5℃时开始降低。实施例7携带codA基因的二元载体质粒的制备利用5′CTGTCTAGATGTAATTAACAATGGCT3′和5′CCACATATGCATGCATTGCACTCT3′作为引物，由PCR扩增来源于烟草(野烟草)的rbcS(核酮糖1，5-二磷酸羧化酶小亚基)转运信号XbaI-NdeI片段(大约200 bp)，同时引入XbaI和NdeI位点。
然后，利用5′AACCATATGCACATCGACAACATC3′和5′GCTCCATCCAGCGGTCCAGC3′作为引物，由PCR扩增codA基因的N-末端-BamHI片段(大约100bp)，然后引入NdeI位点。codA基因的BamHI-SmaI片段(大约1.6kbp)由限制酶制备。最后，利用5′GAAACAGTCCTGCTTCCACAC3′和5′GCGAGCTCTGCCTACACCGCCAT3′作为引物，由PCR扩增codA基因的SmaI-C-末端片段(大约80bp)，同时引入SacI位点。
由这些片段取代二元载体质粒pBI221中的GUS(β-葡糖苷酸酶)基因。
codA基因的限制酶图显示在图7。
将包含花椰菜花叶病毒35S启动子和NOS(胆脂碱合酶)终止子的HindIII-EcoRI片段引入到二元载体质粒pGAH中以制备质粒pGAH/codA(图8)。该质粒包含卡那霉素抗性和潮霉素抗性基因。实施例8二元载体质粒引入土壤杆菌属把携带Ti质粒的根癌土壤杆菌EHA 101与实施例7中获得的二元载体质粒pGAH/codA混合，然后冻结和熔化，并在包含四环素和卡那霉素的LB平板上筛选。所产生的土壤杆菌属(其中codA基因已被整合)指定为EHA101(pGAH/codA)。实施例9拟南芥属的转化使拟南芥菌株WS发芽以制备下胚轴节段。使该下胚轴在包含0.05mg/l细胞分裂素(Wako)和0.5mg/l 2，4-D(Wako)的B5培养基(ICN Biochemicals)(pH5.7)中培养，以形成下胚轴愈伤组织。
然后，用实施例8中制备的、包含codA的土壤杆菌属EHA101(pGAH/codA)感染愈伤组织并共培养该愈伤组织。在用B5培养基(包含250mg/l万古霉素、500mg/l羧苄青霉素和200mg/L Claforan)除去土壤杆菌属之后，将培养物转移到包含卡那霉素和潮霉素的分化培养基(包含25mg/l卡那霉素和15mg/l潮霉素的B5培养基)上，以形成芽。因此，选择卡那霉素抗性和潮霉素抗性的芽以诱导根并形成种子。所产生的T2种子是杂合个体，其中仅转化了一个上述染色体。
然后，使得自T2种子的植物自体受精，并由卡那霉素与潮霉素选择以给出纯合T3种子。
野生型与转化菌株的植物在22℃下、在由蛭石和珍珠岩组成的水或土壤上、在包含0.1％HYPONEX(Hyponex公司，Marysville，OH，USA)的培养基(pH5.2)中生长30天(一天内在75μmol m-2s-1照明下生长16小时并在暗处保存8小时(除非指明以其它方式))后，将它们用于实验。实施例10表达的胆碱氧化酶的免疫学研究按照由本发明发明者在文献中所描述的方法(Deshniumu，P.等，植物分子生物学29897-907，1995)，制备抗胆碱氧化酶的抗体。
把得自生长20天的拟南芥野生型与转化菌株植物的叶片放在的微量离心机中在0℃下研磨，同时在10,000xg下离心分离匀浆10分钟以制备可溶性组分。由SDS-PAGE分离上清液的可溶性蛋白质，并且将其转移到尼龙膜(Immobilon PVDF；Millipore，Bedford，MA，美国)上。用上述抗胆碱氧化酶的抗体培养上述膜，并用由生物素化的次生抗体、抗生物素蛋白和生物素化的辣根过氧化物酶组成的系统(ABC试剂盒；Vectastain，Burlingane，CA，美国)检测该膜。
Western印迹分析的结果如图9中所示。证实了与胆碱氧化酶对应的64kDa免疫反应性蛋白质的存在。也发现了少量与胆碱氧化酶前体对应的70kDa蛋白质和rbcS转运肽。这些结果表明codA基因在染色体中得到正确整合和表达，并表明所表达的前体被加工成肥料蛋白质。
然后，按照文献(Mustardy，L.等，植物生理学94334-340，1990)中所描述的方法，用上述抗胆碱氧化酶的抗体检测所表达抗胆碱氧化酶在植物中的定位。在0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.2)中，用1％戊二醛固定一小片植物嫩叶一小时。在用相同的缓冲液冲洗之后，样品以乙醇脱水，放置在Lowicryl K4M树脂(TAAB实验设备有限公司，Berkshire，U.K.)中。按照文献(Mustardy，L.等，同上)中所描述的方法进行金免疫(Immuno-gold)标记。
结果观察到所表达的胆碱氧化酶被定位在叶绿体基质中，这表明胆碱氧化酶已转运至叶绿体。实施例11确定转化植物中的甜菜碱和叶绿素水平植物叶片中甜菜碱含量通过测量季铵化合物的NMR光谱计算(Wall，J.等，分析化学32870-874，1960)。5g野生型和转化植物叶片，在液氮里经陶瓷发动机磨成粉。此粉状物悬浮在25ml1.0M H2SO4溶液中，并在25℃下培养2小时。在除去不溶物质后，通过10分钟在1000xg下的离心回收上清液。用10ml KI-I2溶液在0℃下培养上清液2小时。通过30分钟在1000xg下的离心回收由高碘化物修饰的甜菜碱和胆碱，并将其溶解在包含0.5mM 2-甲基-2-丙醇(Wako)作为测量1H NMR光谱的内标的0.5mlCD4OH(Wako)中。观察到与甜菜碱和胆碱对应的两个主要峰，甜菜碱的总峰用于确定浓度。
叶片中叶绿素通过下列步骤测定。用陶瓷发动机在液氮里将1g叶片磨成粉。粉状物悬浮在10ml丙酮和水混合液(丙酮∶水＝4∶1，v/v)中。培养30分钟后除去不溶物，上清液用分光光度法(Arnon，D.I.植物生理学241-15，1949)测定。
结果在转化植物中观察到甜菜碱和胆碱，而在野生型植物中仅观察到胆碱。甜菜碱含量是1.0μmol/g新鲜叶片，叶绿素含量是0.3μmol/g新鲜叶片。实施例12转化拟南芥属对低温胁迫的耐受性进行一个试验以确定在低温胁迫条件下，codA基因的引入和甜菜碱的积累是否能给予耐受性。
野生型及转化植物在5℃和250μmol m-2s-1连续照明条件下培养7天。肉眼观察不到野生型及转化植物之间有任何显著差异。当这些植物在22℃条件下再培养2天时，野生型植物的叶片开始下垂和变白。然而，转化植物明显地不受这种处理的丝毫影响。实施例13在低温下光化学系统II活性的灭活通过监测叶绿素的荧光，评估低温胁迫对转化植物叶片的光化学系统II活性的影响。利用脉冲强度可调荧光计测量(PAM-2000；Walts，Effeltrich，德国)，将光化学系统II活性测定为一个可变叶绿素荧光对最大叶绿素荧光的比值(Fv/Fm)(植物生理学植物分子生物学年鉴42313-349，1991)。
结果如图10所示。在5℃和250μmol m-2s-1连续照明条件下培养7天之后，野生型和转化植物光合系统II的活性均降低。在野生型和转化的两种植物中，该活性在第一天降低十分迅速，而后渐渐放慢。然而，转化植物在每一时刻均显示了比野生型植物更慢的灭活。在培养5天后，野生型植物几乎完全失去活性，而转化植物仍保持原活性水平的大约30％。然而，在10℃到15℃之间观察不到两者光合系统II活性的显著差异。实施例14光合作用受低温的抑制作用及其恢复，以及抗冻性(1)检验低温对光合的抑制作用及从光合抑制中的恢复在低至1℃的温度下测定光合抑制程度。结果如图11A所示。转化植物叶片比野生型植物叶片更能耐受低温对光合的抑制作用。也就是说，在2.5小时之后野生型植物叶片就灭活大约75％的光合系统II活性，而转化植物的叶片光合系统II活性灭活到相同程度则需要3.5小时或更多。
图11B显示了从低温引起的光合抑制中恢复的检验结果。在上述低温检验之后，在17℃下和70μmol m-2s-1条件下培养叶片。野生型和转化植物叶片均显示出能从低温引起的光合抑制状态恢复。然而，转化植物显示了比野生型植物高的恢复程度。培养4小时后，野生型植物叶片恢复原活性的25％至50％，而转化植物叶片恢复原活性的25％至75％。
(2)叶片抗冻性检验拟南芥属的野生型植物和转化植物叶片，在3℃/分钟降温速率的温度条件下被撕裂并浸渍在水中。当温度降低至-3℃时，将液氮冷冻过的针应用于叶片使它们冻结。然后，以1℃/小时降温速率将叶片冷冻至-2℃到-12℃范围内的不同测量温度。移去叶片并使之在4℃下保存一整夜以便它们融化。第二天，温度返回到室温并测定叶片光化学系统II活性。结果如图12所示。在任一温度下，转化植物都显示了比野生型植物更高的活性。实施例15低温处理对吸水阶段的种子萌发的影响野生型植物种子和转化植物的T3种子在冰水(大约0℃)中保存2小时并消毒，然后在包含2％蔗糖和0.5％gellan树胶的MS(Murashige-Skoog)培养基上发芽。在22℃条件下使种子发芽20天(每天16小时有光照，8小时在暗处)。
结果如图13所示。从图中可明显看出，当野生型和转化植物种子在吸水阶段未进行冷冻处理时，它们均可发芽(图13A)。当两种植物种子在吸水阶段均进行冷冻处理时，野生型植物种子不发芽，而转化植物种子发芽并且其生长状况与未处理种子相同(图13B)。实施例16用于水稻转化的嵌合codA基因的制备由实施例6所描述的方法在质粒pUC119上制备两个嵌合codA基因(分别指定为35SINcodA和35SINTPcodA)，该基因在由花椰菜花叶病毒35S启动子的转录控制之下的胆碱氧化酶基因(codA)(得自球形节杆菌)翻译之后定位于胞质溶胶或者质体中(参见图14)。考虑到水稻中基因的高水平表达要求内含子存在(例如，参见Tanaka，A.等，核酸研究186767-6770，1990)，将在水稻超氧化物歧化酶基因的5′非翻译序列中的内含子(SodCc2Sakamoto，A.等，FEBS Lett.35862-66，1995)引入上述两个嵌合基因中。另外，为了将codA蛋白质转移到叶绿体中，把由豌豆的rbcS转运肽(Coruzz，G.等，EMBO J 31671-1679，1984)衍生的DNA序列添加到35SINTPcodA中。实施例17水稻的转化由基因枪设备将实施例16中制备的两个嵌合codA基因的每一个都与选择标记潮霉素抗性基因一道引入悬浮培养细胞(得自水稻种子的角质愈伤组织)中。基于抗生素抗性，选择转化愈伤组织并将其再分化形成植物体。在转化愈伤组织或显示潮霉素抗性的转化/再分化个体上，进行聚合酶链反应(PCR)，以便用Northern印迹技术评估进入核基因组的codA基因的整合和转录，并为每一个codA基因选择80至100或者更多的转化体。实施例18转化水稻中的codA基因表达的分析用Western印迹技术筛选实施例17所获得的转化体以获得转化水稻(第一代)，该转化水稻在蛋白质水平上表达codA基因，最后包括6个携带定位于质体的基因的个体和10个携带定位于胞质溶胶的基因的个体。
水稻缺乏内生的胆碱氧化酶活性，但是从转化体叶片或根制备的可溶性组分显示了胆碱氧化酶活性。与期望相反，发现质体型转化体的所有个体表达的胆碱氧化酶蛋白质数量比胞质溶胶型的少，尽管所用的表达启动子相同。
当进一步用Northern印迹技术检测codA基因的表达时，未发现有在转录水平上表达的两种基因的数量上显著差异。当通过反转录PCR检测内含子的加工过程时，从自质体型基因转录的mRNA中检测到大量的、包含不同的3′受体位点(其不能正常翻译成蛋白质)的剪接变体。这暗示由质体型基因转化的植物的低水平蛋白质表达可能是由于mRNA前体的反常加工所致。这一现象似乎与下列事实有关编码用于胆碱氧化酶的质体导向的转运肽的序列来源于双子叶植物(豌豆rbcS基因)。因此，可能易于期望如果编码转运肽的序列得自如rbcS水稻的单子叶植物，那么水稻叶绿体中的codA的表达更有效，所产生的转化水稻将更能耐受温度胁迫。实施例19转化水稻中的甜菜碱生物合成通过质子NMR检测到甜菜碱在表达胆碱氧化酶的转化体的组织中的积聚。图15显示了野生型菌株的NMR结果，一种不表达codA基因的转化体(图15A)和一种表达codA基因的转化体(图15B)。
通过Western印迹技术检测到表达胆碱氧化酶生物合成甜菜碱的转化体及与胆碱氧化酶量显示正相关的甜菜碱积聚量。叶片中甜菜碱积聚量大于根部，在高水平表达codA基因的个体中达到4μmol/g新鲜叶片。这是第一例，其中水稻通过基因工程技术获得甜菜碱合成能力。实施例20低温照明条件下的光合作用灭活为了检查是否由于甜菜碱的存在或其它因素使转化植物获得耐温性，利用由用质粒(包含codA基因)转化聚球蓝细菌PCC7942制备的转化体和由用PAM1044(在实施例1中)单独转化聚球蓝细菌PCC7942制备的PAM，进行了下列检验。
使PAM和PAMCOD细胞(预先在30℃下和存在1mM胆碱氯化物条件下生长)在20℃下在照明或黑暗条件下生长。在黑暗条件下，光化学系统II活性得到保持。然而，在500μEm-2s-1下培养120分钟后，PAM细胞的光化学系统II活性降至原来水平的35％(图16A)。PAMCOD细胞的光化学系统II活性也降低，但降低程度比PAM细胞小(图16A)。这揭示了PAMCOD细胞的光化学系统II对光抑制的耐受性强于PAM细胞。
D1蛋白质的光诱导灭活与通过吸收新合成的D1蛋白质所致的光化学系统II恢复之间的竞争，是造成光化学系统II的光抑制的原因(Aro，E.-M.等，生物化学生物物理学学报1019269-275，1990；Aro，E.-M.等，生物化学生物物理学学报1143113-134，1993)。为了检测在低温下PAMCOD细胞对光胁迫的耐受性是否是由于D1蛋白质灭活的抑制或是由于D1蛋白质合成的促进，在存在蛋白质合成抑制剂linomycin(400mg/ml)条件下诱导光抑制。在黑暗条件下，linomycin对PAM和PAMCOD细胞的光化学系统II活性没有任何影响。在照明条件下，在两转化体细胞中光化学系统II复合体以相同的速度灭活(图16B)。这一结果表明，在低温下PAMCOD细胞对光胁迫的耐受性的提高并不是由于D1蛋白质灭活的抑制引起的。甜菜碱的存在似乎促进了光化学系统II的恢复。实施例21光抑制的恢复通过测定释氧活性检验PAM和PAMCOD细胞光化学系统II从光抑制的恢复。将细胞暴露在3500μEm-2s-1的光强下以抑制光化学系统II复合体至原水平的15％。然后，在20℃或30℃和70μEm-2s-1照明下培养细胞。结果如图17所示。
20℃时，PAM细胞仅显示光化学系统II复合体从光抑制的轻微恢复。而PAMCOD细胞在2小时后恢复至原水平的60％(图17A)。30℃时，2小时后两种菌株的细胞都完全恢复光化学系统II的活性。然而，与PAM细胞相比，PAMCOD细胞恢复的快得多(图17B)。实施例22低温黑暗条件下光合作用的灭活在低温黑暗条件下比较PAM和PAMCOD细胞对低温胁迫的耐受性。不同低温处理对两种细胞中的净光合和电子传递(以光化学系统II为介导)的灭活的影响显示在图18中。PAMCOD细胞的光合释氧活性比PAM细胞对低温的耐受性强(图18A)。对以光化学系统II为介导的电子传递也获得类似的结果。在5℃时，PAM细胞的活性降至原水平的50％，而PAMCOD细胞的活性在5℃时几乎保持与对照相同的水平，低于5℃时开始下降(图18B)。这些结果表明PAMCOD细胞光合作用比PAM细胞更耐低温。实施例23原生质膜的相变曾有报道(Murata，N.，J.Bioenerg.Biomembr.2161-75，1989)报道过，由于原生质膜的脂相由液晶状态变化为相分离状态，暴露在低温下的蓝细菌细胞降低了生长或光合活性。进行一个试验以检测PAMCOD细胞对低温的耐受性的增强是否与膜的脂相变化有关。
原生质膜的脂相转变，可由玉米黄质的凝集作用通过监测聚球蓝细菌PCC7942和PCC6301(以前称为巢组囊藻)在388nm处的吸光率的变化检测(Brand，J.，植物生理学杂志59970-973，1977；Gombos，Z.等，植物生理学80415-419，1986；Murata N.，J.Bioenerg.Biomembr.2161-75，1989；Ono，T.等，植物生理学67176-181，1981；Wada，H.等，自然347200-203，1990；Yamamoto，H.Y.等，生物化学生物物理学学报507119-127，1978)。图19显示了用类似方法检测PAM细胞和PAMCOD细胞的结果。图19表明，PAM细胞膜脂的相变在10℃时出现，在2℃时终止，中间温度是6℃。另一方面，PAMCOD细胞膜脂的相变在5℃时开始。这意味着PAMCOD细胞的原生质膜的脂相变在较PAM细胞低5℃的温度下发生。实施例24膜脂和蛋白质的变化已知蓝细菌膜脂的转变温度取决于脂肪酸的不饱和程度及脂质的性质(Murata，N.，J.Bioenerg.Biomembr.2161-75，1989)。因此，检验了PAMCOD细胞的膜脂。表1和2显示了PAM和PAMCOD细胞的原生质膜和类囊体膜中的脂肪酸与甘油脂(glycerolipid)组分。表1显示了在30℃下和有1mM胆碱氯化物存在时培养的细胞中的脂质组合物。表2显示了在30℃下和有1mM胆碱氯化物存在时培养的细胞中的甘油脂组合物。表1脂 肪 酸14∶0 14∶1 16∶0 16∶1 18∶0 18∶1(9)18∶1(11)(摩尔％)原生质膜PAM1 1 54 36 32 2PAMCOD 2 2 53 38 22 2类囊体膜PAM1 2 52 40 22 2PAMCOD 1 2 50 40 22 2缩写14∶0肉豆蔻酸14∶1Δ9-肉豆蔻酸16∶0棕榈酸16∶1Δ9-棕榈酸18∶0硬脂酸18∶1(9)Δ9-硬脂酸
18∶1(11)Δ11-硬脂酸所有双键都是顺式的。表2类囊体膜 原生质膜膜脂类别PAM PAMCODPAM PAMCOD(摩尔％)(摩尔％)MGDG545356 55DGDG222319 19SQDG141415 15PG 101010 11缩写 MGDG单半乳糖二酰甘油酯DGDG双半乳糖二酰甘油酯SQDG磺基异鼠李糖(sulfoquinovosyl)二酰甘油酯PG磷脂酰甘油酯如表1和2所示，观察不到两者之间有显著差异。
图20显示了膜蛋白质以及PAM和PAMCOD细胞可溶性组分的电泳型。可观察到膜组分间的轻微差别。也就是说，PAMCOD细胞显示出14kda蛋白质数量的增加以及16kda蛋白质数量的减少。除PAMCOD细胞显示出与胆碱氧化酶对应的条带外，没发现可溶性组分中有其它差异。
因此，在PAM和PAMCOD细胞之间的膜脂或蛋白质中没有发现有显著差异，表明低温时在PAMCOD细胞中观察到的光化学系统II保护是甜菜碱的作用。
序列表(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度2400个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(ix)特征(A)名称/关键词mat肽(B)位置361..2002(xi)序列描述SEQ ID NO1GGGAATATCC GTCGTCGTAG ACGAGCCCTT CGGCCCGTGT AAAGGTGGAG ACCTTCCACA 60CCGAGGACGA GGCCGTCGCG ACCGCCAACG ACACCAACTA CGGGCTGTCC GGCGCGGTCC 120TGGACCCAGG ACGCCGGCAA GACGCAGCGC GTGGCCGGCC GGCTGCGACA CGGCACCGTC 180TGGATCAACG ACTTCCACCC CTACCTCCCA CAGACCGAGT GGGGCGGCTT CGGCCAGTCC 240GGCGTCGGCC GCGAACTCGG CCCGACCGGC CTGGCCGAGT ACCAGGAGGC CAAGCACATC 300TACCAGAACA CCAGCCCGCA GGTCACCGGC TGGTTCGCTG ACCACGGCAA GGAGAACTAG 360ATG CAC ATC GAC AAC ATC GAG AAC CTG AGC GAC AGG GAG TTC GAC TAC 408Met His Ile Asp Asn Ile Glu Asn Leu Ser Asp Arg Glu Phe Asp Tyr1 5 10 15ATC GTC GTC GGC GGC GGG TCC GCC GGG GCC GCC GTC GCC GCC CGG CTG 456Ile Val Val Gly Gly Gly Ser Ala Gly Ala Ala Val Ala Ala Arg Leu20 25 30AGC GAG GAT CCC GCA GTG AGC GTG GCG CTG GTG GAG GCC GGC CCG GAT 504Ser Glu Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Val Glu Ala Gly Pro Asp3540 45GAC CGC GGC GTG CCC GAG GTG CTG CAG CTG GAC CGC TGG ATG GAG CTG 552Asp Arg Gly Val Pro Glu Val Leu Gln Leu Asp Arg Trp Met Glu Leu50 55 60CTG GAA TCG GGC TAC GAC TGG GAC TAC CCG ATC GAG CCG CAG GAG AAC 600Leu Glu Ser Gly Tyr Asp Trp Asp Tyr Pro Ile Glu Pro Gln Glu Asn65 70 75 80GGC AAC TCC TTC ATG CGC CAT GCC CGT GCC AAG GTC ATG GGC GGC TGC 648Gly Asn Ser Phe Met Arg His Ala Arg Ala Lys Val Met Gly Gly Cys85 90 95TCC AGC CAC AAC TCC TGC ATC GCC TTC TGG GCC CCG CGC GAG GAC CTG 696Ser Ser His Asn Ser Cys Ile Ala Phe Trp Ala Pro Arg Glu Asp Leu100 105 110GAC GAG TGG GAG GCC AAG TAC GGC GCC ACC GGC TGG AAC GCC GAG GCG 744Asp Glu Trp Glu Ala Lys Tyr Gly Ala Thr Gly Trp Asn Ala Glu Ala115 120 125GCC TGG CCG CTG TAC AAG CGG CTG GAA ACC AAC GAG GAC GCG GGC CCG 792Ala Trp Pro Leu Tyr Lys Arg Leu Glu Thr Asn Glu Asp Ala Gly Pro130 135 140GAC GCG CCG CAC CAC GGG GAC TCC GGC CCC GTG CAC CTG ATG AAC GTG 840Asp Ala Pro His His Gly Asp Ser Gly Pro Val His Leu Met Asn Val145 150 155 160CCC CCG AAG GAC CCG ACC GGC GTC GCG CTC CTG GAC GCC TGC GAG CAG 888Pro Pro Lys Asp Pro Thr Gly Val Ala Leu Leu Asp Ala Cys Glu Gln165 170 175GCC GGC ATC CCG CGC GCG AAG TTC AAC ACC GGC ACC ACC GTG GTC AAC 936Ala Gly Ile Pro Arg Ala Lys Phe Asn Thr Gly Thr Thr Val Val Asn180 185 190GGC GCC AAC TTC TTC CAG ATC AAC CGG CGC GCG GAC GGC ACC CGC TCC 984Gly Ala Asn Phe Phe Gln Ile Asn Arg Arg Ala Asp Gly Thr Arg Ser195 200 205TCC AGC TCG GTC TCC TAC ATC CAC CCG ATC GTC GAG CAG GAG AAC TTC 1032Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Pro Ile Val Glu Gln Glu Asn Phe210 215 220ACC CTG CTA ACC GGC CTG CGC GCC CGC CAG CTG GTG TTC GAC GCG GAC 1080Thr Leu Leu Thr Gly Leu Arg Ala Arg Gln Leu Val Phe Asp Ala Asp225 230 235 240AGG CGC TGC ACC GGC GTC GAC ATC GTG GAC TCC GCC TTC GGC CGC ACC 1128Arg Arg Cys Thr Gly Val Asp Ile Val Asp Ser Ala Phe Gly Arg Thr245 250 255CAT CGG CTG ACG GCG CGC AAT GAA GTC GTG CTC TCC ACC GGC GCG ATC 1176His Arg Leu Thr Ala Arg Asn Glu Val Val Leu Ser Thr Gly Ala Ile260 265 270GAT ACG CCG AAG CTG TTG ATG CTC TCC GGA ATC GGC CCC GCC GCC CAC 1224Asp Thr Pro Lys Leu Leu Met Leu Ser Gly Ile Gly Pro Ala Ala His275 280 285CTC GCC GAG CAC GGC ATC GAG GTC CTT GGT GGA CTC CCC CGG CGT GGG 1272Leu Ala Glu His Gly Ile Glu Val Leu Gly Gly Leu Pro Arg Arg Gly290 295 300CGA GCA CCT GCA GGA CCA CCC GGA AGG CGT GGT GCA GTT CGA GGC CAA 1320Arg Ala Pro Ala Gly Pro Pro Gly Arg Arg Gly Ala Val Arg Gly Gln305 310 315 320GCA GCC CAT GGT CGC CGA GTC CAC GCA GTG GTG GGA GAT CGG CAT CTT 1368Ala Ala His Gly Arg Arg Val His Ala Val Val Gly Asp Arg His Leu325 330 335CAC CCC CAC CGA GGA CGG CCT GGA CCG CCC CGA CCT GAT GAT GCA CTA 1416His Pro His Arg Gly Arg Pro Gly Pro Pro Arg Pro Asp Asp Ala Leu
340 345 350CGG CTC CGT GCC GTT CGA CAT GAA CAC CCT GCG GCA CGG CTA CCC CAC 1464Arg Leu Arg Ala Val Arg His Glu His Pro Ala Ala Arg Leu Pro His355 360 365CAC GGA GAA CGG GCT TCA GCC TCA CCC CGA ACG TCA CGC ACG CCC GCT 1512His Gly Glu Arg Ala Ser Ala Ser Pro Arg Thr Ser Arg Thr Pro Ala370 375 380CCC GCG GCA CTG TCC GGC TGC GCA GCC GCG ACT TCC GCG ATA AGC CCA 1560Pro Ala Ala Leu Ser Gly Cys Ala Ala Ala Thr Ser Ala Ile Ser Pro385 390 395 400TGG TCG ACC CGC GCT ACT TCA CCG ACC CAG AAG GGC CAT GAC ATG CGC 1608Trp Ser Thr Arg Ala Thr Ser Pro Thr Gln Lys Gly His Asp Met Arg405 410 415GTC ATG GTC GCC GGC ATC CGC AAG GCC CGC GAA ATC GCC GCC CAG CCC 1656Val Met Val Ala Gly Ile Arg Lys Ala Arg Glu Ile Ala Ala Gln Pro420 425 430GCC ATG GCG GAA TGG ACC GGC CGC GAG CTC TCC CCC GGC GTC GAG GCG 1704Ala Met Ala Glu Trp Thr Gly Arg Glu Leu Ser Pro Gly Val Glu Ala435 440 445CAG ACC GAC GAG GAG CTG CAG GAC TAC ATC CGC AAG ACG CAC AAC ACC 1752Gln Thr Asp Glu Glu Leu Gln Asp Tyr Ile Arg Lys Thr His Asn Thr450 455 460GTC TAC CAC CCC GTG GGC ACC GTG CGC ATG GGC GCG GTC GAG GAC GAG 1800Val Tyr His Pro Val Gly Thr Val Arg Met Gly Ala Val Glu Asp Glu465 470 475 480ATG TCC CCG CTC GAC CCC GAG CTG CGG GTC AAG GGC GTC ACC GGT CTG 1848Met Ser Pro Leu Asp Pro Glu Leu Arg Val Lys Gly Val Thr Gly Leu485 490 495CGC GTC GGC GAC GCC TCG GTC ATG CCC GAG CAC GTG ACC GTC AAC CCC1896Arg Val Gly Asp Ala Ser Val Met Pro Glu His Val Thr Val Asn Pro500 505 510AAC ATC ACC GTC ATG ATG ATC GGC GAG CGC TGC GCG GAC CTT ATC CGC1944Asn Ile Thr Val Met Met Ile Gly Glu Arg Cys Ala Asp Leu Ile Arg515 520 525TCC GCC CGC GCC GGT GAA ACA ACG ACG GCG GAC GCC GAG CTG AGC GCG1992Ser Ala Arg Ala Gly Glu Thr Thr Thr Ala Asp Ala Glu Leu Ser Ala530 535 540GCC CTC GCC TAAGCGGGAG CGGCCAGCCG CGGGGCCTGT CCGGAACCAC CTGGCGGGCC 2051Ala Leu Ala545 547CCGCATGGGG CCGGACACAA TGCCGGTAAC TAAGGGTGCG GAAGCAGTCC TGCTTCCACA 2111CCCGCGTTTT GCACGCCCGG GCCGGCAACT GGCCCGGCCG GCTAAGCCGA AGGTCTTCCG 2171GGGGCGGGCC GGATCGCTGC GGGCAGTCCG TCGGCCAGCC GCTGCAGCGT GCCGGCGGTA 2231ATGGCGGTGT AGGCAGGGAT CGCGTCGGGG TAGATGTACT CGTTGCGGGC GTGCGCGCCG 2291TCGCCCACCG CGCCCAGGCC GCACAGGACC GGGATGCCGA GGGCGGAGAC GAAGTTGGCG 2351TCGCTGCCCC CGCCCACCGA GGCGGTTTCC AGCTCCCGGC CCTGCTCCA 2400
权利要求
1.一种用于产生耐温植物的方法，该方法包括用携带编码胆碱氧化酶的基因的重组载体转化植物。
2.权利要求1的方法，其中编码胆碱氧化酶的基因来源于土壤细菌节杆菌属。
3.权利要求1或2的方法，其中编码胆碱氧化酶的基因是编码序列表中所显示的SEQ ID NO1氨基酸序列的核苷酸序列，或者是这样一种核苷酸序列，当其编码具有胆碱氧化酶活性的蛋白质时，一个或多个氨基酸插入到上述氨基酸序列中，和/或上述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被缺失和/或取代。
4.权利要求1-3之任一的方法，其中耐温植物是光合植物。
5.权利要求1-4之任一的方法，其中耐温植物是蓝细菌属。
6.权利要求1-4之任一的方法，其中耐温植物是高等植物。
7.权利要求6的方法，其中高等植物是双子叶植物。
8.权利要求7的方法，其中双子叶植物是十字花科植物。
9.权利要求6的方法，其中高等植物是单子叶植物。
10.权利要求9的方法，其中单子叶植物是禾本科植物。
11.一种由权利要求1的方法所产生的耐温植物，或者其具有同样性质的后代。
12.一种植物细胞或者植物器官以及其后代，它们均得自按照权利要求1的方法产生的耐温植物或者其具有同样性质的后代。
13.一种包含编码胆碱氧化酶的基因的耐温植物，或者一种其具有同样性质的后代。
14.利用编码胆碱氧化酶的基因产生耐温植物的用途。
全文摘要
一种用于产生耐温植物的方法,该方法包括用携带编码胆碱氧化酶的基因的重组载体转化植物,以及由上述方法产生的耐温植物或其具有同样性质的后代。
文档编号C12N9/04GK1207645SQ9619976
公开日1999年2月10日 申请日期1996年12月27日 优先权日1995年12月28日
发明者村田纪夫 申请人:三得利株式会社