专利名称：载脂蛋白e2和阿尔采默氏病的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组DNA、蛋白纯化和阿尔采默氏病。
背景技术：
阿尔采默氏病有两个主要的神经病理学特征。第一个特征是有神经元内的神经原纤维纠结，其主要蛋白组分是高度磷酸化的Tau蛋白、一种微管相关蛋白。电子显微镜检查显示神经原纤维的纠结中含有成对的螺旋状细丝(“PHF”)(Selkoe(1991)Neuron 6:487-498)。
第二个主要特征是在脑中有细胞外的淀粉样沉积。淀粉样沉积中包含淀粉样多肽Aβ的多聚体，它是淀粉样前体蛋白(“APP”)经蛋白水解而产生的。
载脂蛋白E(“apoE”)是一种由肝脏和许多周围组织，包括肾脏、肾上腺、星形胶质细胞和网状内皮细胞合成的34.2kDa的蛋白质。载脂蛋白E是被合成为有一个18氨基酸信号肽的载脂蛋白E前体(“preapoE”)。信号肽在细胞内被去除之后，含唾液酸的糖链使载脂蛋白E糖基化并作为涎化载脂蛋白E被分泌出来。接下来是在血浆中去涎化。关于载脂蛋白E的生物合成过程和其他特点参见Zannis等，(1993)Adv.Hum.Genet.21;145-319；Zannis等.(1984).J.Biol.Chem.259:5495-5499；和Zannis等.(1986),J.Biol.Chem.261:13415-13421。
合成之后，载脂蛋白E被掺入到脂蛋白中，在与细胞表面受体识别和结合之后引导了脂蛋白的代谢。作为脂蛋白颗粒的一种成分，从血浆和HepG-2细胞的培养基中可以分离出载脂蛋白E。
在人类有三个常见的编码载脂蛋白E的等位基因。这三个命名为ε4、ε3和ε2的等位基因产生三种纯合表型(即E4/E4、E3/E3和E2/E2)和三种杂合表型(即E4/E3、E3/E2和E4/E2)(Zannis和Breslow(1981)Biochemistry20:1033-1041；Zannis等(1981)Am.J.Hum.Genet.33:11-24)。人类三种不同的载脂蛋白E异构蛋白载脂蛋白E4、载脂蛋白E3和载脂蛋白E2源自112位和158氨基酸残基的突变。载脂蛋白E4在112位和158位含精氨酸。载脂蛋白E3在112位含半胱氨酸，在158位含精氨酸。载脂蛋白E2在112位和158位含半胱氨酸。
载脂蛋白E中发生的影响它与LDL受体相互识别的突变与Ⅲ型高脂蛋白血症和过早形成的动脉粥样硬化有关。参见，如Goldstein等(1983)遗传性疾病的代谢基础(Stankbury等，编辑)，McGraw-Hill,New York,pp.672-712。载脂蛋白E中产生载脂蛋白E4表型的突变伴随着患迟发性阿尔采默氏病的病人频率增加(Corder等.(1993)Science 262:921-923)。
载脂蛋白E和阿尔采默氏病载脂蛋白E的合成在损害之后有所增加，并且参与发育过程中或损伤之后神经系统的生长和修复(Boyles等，(1989),J.Clin.Invest.83:1015-1031)。在周围神经系统，载脂蛋白E的合成在坐骨神经碾碎三周内增加了250-350倍，并且载脂蛋白E占全部胞外可溶性蛋白的5％。最近，在AD患者的脑病灶中发现了载脂蛋白E，在迟发性家族性AD患者中载脂蛋白E4表型占优势(Corder等，(1993)Science 262:921-923)。有人提出载脂蛋白E是一个风险因子，是疾病发病机理之一。有两个解释载脂蛋白E参与AD发病过程的假说已经被提出。第一个假说中包含了载脂蛋白E与长42个氨基酸的淀粉样多肽β(Aβ)的细胞外相互作用。一开始的观察表明来自脑脊液的载脂蛋白E与Aβ有高度亲合力(Wisniewski等，(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.192:359-365；Strittmatter等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:1977～1981)。体外实验显示载脂蛋白E能与Aβ多肽形成一种复合物，这种复合物在2％SDS中煮5分钟仍保持稳定。与载脂蛋白E3与Aβ形成复合物的过程相比，载脂蛋白E4与Aβ形成稳定复合物的过程很快。
电镜研究显示载脂蛋白E4与Aβ的结合导致直径为7nm的单原纤维的形成。由载脂蛋白E4形成的单原纤维基质要比由载脂蛋白E3形成的单原纤维基质密实得多(Sanan等，(1994)J.Clin.Invest.94:860-869)。
第二个假说是载脂蛋白E3与Tau蛋白相结合，使它结合微管的功能区免于磷酸化；而载脂蛋白E4不与Tau蛋白相结合(Strittmatter等，(1994)Exper.Neurol.125:63-171)。结果，Tau蛋白被高度磷酸化；不再能有效地结合微管并使之稳定，导致神经元内的神经原纤维纠结的形成。
发明概述我们已经发现糖基化的载脂蛋白E2有一种与它的天然构象相同或极其相似的构象，这种天然构象即不是经变性然后复性后的构象，以不含脂类或与脂类相结合的形式存在，与载脂蛋白E3和E4相比结合合成的多肽淀粉样多肽Aβ的亲合力更高。
据此，本发明主要涉及一种经分离的与载脂蛋白E3或E4相比以更高的亲合力特异性结合淀粉样多肽Aβ的载脂蛋白E2；通过(a)用编码载脂蛋白E2的DNA转化真核宿主细胞(优选哺乳动物细胞)；(b)培养宿主细胞；和(c)在非变性条件下分离载脂蛋白E2可制备载脂蛋白E2。如此处所用，“载脂蛋白E2”既指蛋白质自然存在的氨基酸序列，也指发生了基本上不改变分子的构象或其他特点的一个或多个氨基酸替代的变异体。E2像这样的突变形式的例子列在下面的表1中；当在哺乳动物宿主细胞中表达的时候这些突变体不仅保持了天然的构象，而且与天然序列相比，它们表现出更强的结合特性。
在非变性条件下可以分离载脂蛋白E2，方法是通过对培养表达重组载脂蛋白E2的哺乳动物细胞生长所用培养基进行阳离子交换色谱分析可制备富含载脂蛋白E2的阳离子交换蛋白组分；接着，对得到的富含载脂蛋白E2的阳离子交换组分进行阴离子交换色谱分析，这样就制备出高度富含载脂蛋白E2的阴离子交换组分。
本发明还涉及一种通过在患者脑部使用有效剂量的糖基化的、以不含脂类或与脂类相结合的形式存在、其构象是脑细胞所产生的天然构象或与天然构象接近的载脂蛋白E2，抑制患早发性阿尔采默氏病病人的阿尔采默氏病的进展或抑制遗传方面有患阿尔采默氏病风险的病人阿尔采默氏病的发病的方法。
在下面对本发明的优选实施方案的描述和权利要求中，本发明的其他特点和益处将一目了然。
附图简述
图1是制备本发明所用质粒的步骤的图解说明。
图2是本发明所用细胞分泌的载脂蛋白E2的一系列凝胶电泳和放射自显影图片。
图3是说明使用塞姆利基森林病毒表达系统的各种类型细胞表达载脂蛋白E2、E3和E4的一系列图片。
图4是说明在生物反应器环境中表达载脂蛋白E的两幅图。
图5是表示从离子交换柱上洗脱载脂蛋白E的洗脱曲线的一组图片。
图6是表示从真核细胞的表达中获得的载脂蛋白E与Aβ的结合情况的一组图片。载脂蛋白E的实验表明由真核细胞产生的载脂蛋白E与Aβ的结合能力遵循下列顺序载脂蛋白E2＞载脂蛋白E3＞载脂蛋白E4。
图7是表示从杆状病毒表达系统中获得的载脂蛋白E3和E4与Aβ的结合情况的一组图片。以此种方式获得的载脂蛋白E3和载脂蛋白E4的形式与Aβ的结合能力与真核细胞表达的载脂蛋白E与Aβ的结合能力不同(图6)。
图8是表示VLDL、载脂蛋白E3和载脂蛋白E4与Aβ结合情况的一组图片。以此种方式获得的载脂蛋白E3和载脂蛋白E4的形式与Aβ的结合能力与真核细胞表达的载脂蛋白E与Aβ的结合能力不同(图6)。
图9是表示由C127细胞分泌的载脂蛋白E分别表达分不含脂类的形式和与脂类结合的形式。
图10预计由真核细胞获得的载脂蛋白E2衍生物与Aβ的结合不同于天然存在的载脂蛋白E3、E4和天然序列E2的结合。
发明详述本发明提供具天然构象的重组载脂蛋白E2。由于它的天然构象，本发明的载脂蛋白E2以比载脂蛋白E3或载脂蛋白E4更高的亲合力与Aβ多肽结合。表达载脂蛋白E2、载脂蛋白E3和载脂蛋白E4的C127细胞细胞系的建立我们建立了一种分泌载脂蛋白E2的重组C127细胞株。这种细胞株的建立过程如下从最初的质粒中用核酸酶AatⅡ和DraⅡ切出我们以前分离到的(Zannis等，(1984),J.Biol,Chem.259:5495)、通过PCR进行过扩增和诱变的载脂蛋白E的cDNA，亚克隆到pUC19质粒中的SmaⅠ位点制备出pUC-E3衍生质粒。接下来用BamHⅠ和BglⅡ切出载脂蛋白E的DNA。如图1A所描述的那样，通过使用一套5′和3′扩增引物和一套诱变引物，以PCR法对pUC-E3质粒进行扩增和诱变。诱变引物设计成用精氨酸替代112位的半胱氨酸，用半胱氨酸替代158位的精氨酸。
5′外在扩增引物在载脂蛋白E基因上从223位核苷酸延伸到241位核苷酸(Karathanassis,Haddad,Salmon和Zannis的序列计数，血浆脂蛋白的生物化学和生物学，1985,pp.475-493)。3′外在引物在cDNA的3′区域1102-1182位核苷酸之间延伸。为了制备载脂蛋白E2，一套诱变性有义和反义寡核苷酸覆盖了154-161位的密码子(核苷酸576-595位)以使158位精氨酸改变为158位半胱氨酸。为了制备载脂蛋白E4，另一套诱变性有义和反义寡核苷酸覆盖了108-113位的密码子(核苷酸438-457位)以使112位的半胱氨酸改变为112位精氨酸。
为使158位精氨酸变为半胱氨酸，分别使用两种扩增方法。第一种扩增方法使用5′外在引物和覆盖密码子158的反义诱变性引物。第二种扩增方法使用3′外在引物和覆盖密码子158的有义诱变性引物。每次反应有4％的产物被混和，利用5′和3′外在引物进行扩增。经扩增的包含158位从精氨酸到半胱氨酸突变的片段用来替代pUC-E3质粒中的相应区域，如图1A中所示的那样，产生了pUC-E2质粒。同样地，经扩增的包含112位从半胱氨酸到精氨酸突变的片段用来替代pUC-E3质粒中的相应区域，如图1A中所示的那样，产生了pUC-E4质粒。
从pUC-E2衍生质粒中获得的DNA插入片段一开始被克隆到CMV pcDNA启动子控制下的pcDNA的BamHⅠ位点或塞姆利基森林病毒载体(pSFV)的BamHⅠ和BglⅡ位点以制备pcDNA-E2衍生质粒和pSFV-E2衍生质粒。然后，从pUC-E2衍生质粒中切出载脂蛋白E2插入片段，用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段平化末端，连接到用XhoⅠ消化的XhoⅠ接头上，克隆到pBMT3X载体的XhoⅠ位点以制备表达载体pBMT3X-E2(图1B)。使用同样的方法制备pBMT3X-E3和E4质粒。
pBMT3X是一种以牛乳头瘤病毒为基础的载体，其中感兴趣的基因是在小鼠金属硫蛋白Ⅰ启动子的控制下被转录。此载体也包含人金属硫蛋白Ⅰ基因，使之对10μM CdCl2有抗性(Cladaras等，(1987),J.Biol.Chem.262:2310-2315)。
为了建立表达载脂蛋白E2的稳定细胞株，以磷酸钙DNA共沉淀法用pBMT3X-apoE2表达质粒转染细胞(Graham和van der Eb(1973)Virology 52:456)。根据对10μM CdCl2的抗性选择永久性细胞株。用克隆柱分离有抗性的集落，长至90％汇合。
为鉴定此细胞株所分泌的蛋白质，用35S-甲硫氨酸将细胞株标记两小时。将培养基和细胞溶解物用兔抗载脂蛋白E进行免疫沉淀反应，再与15μg含载脂蛋白E3的HDL混和，用双向凝胶电泳(PAGE)和放射自显影的方法进行分析，在此分析中，蛋白质根据电荷的不同通过等电聚焦被分离，根据大小的不同通过SDS-PAGE被分离。
此分析中获得的凝胶显示了作为标记的血浆载脂蛋白E3的位置(图2A,B,C)；放射自显影照片显示了新合成的载脂蛋白E2蛋白质的位置(图2A′,B′,C′)。将凝胶放在放射自显影的照片上确立了血浆载脂蛋白E3和新合成的蛋白质之间有电荷和大小的不同(图2A″,B″,C″)。表示在图2A-C″中的这种分析确立了新合成的载脂蛋白E2与载脂蛋白E3和载脂蛋白E4相比分别因一个和两个阳性电荷而酸性更强。这种分析还表明分泌的蛋白质被广泛修饰，与肝脏和其他类型细胞合成的蛋白质相象(Zannis等，(1986),J.Biol.Chem.261:13415-13421)。
我们还在Cos-1细胞中使用pcDNA载体在CMV启动子控制下表达了载脂蛋白E2。使用塞姆利基森林病毒表达系统表达载脂蛋白EcDNA除了上述的在C127细胞中表达载脂蛋白E2之外，我们还以塞姆利基森林病毒(SFV)复制子为基础，使用了其他的表达载脂蛋白E2、载脂蛋白E3和载脂蛋白E4的真核表达系统。这些系统包括两种质粒-pSFV1和pSFV-辅助病毒2。第一种质粒代表了除去编码病毒结构蛋白的一个亚基因组(26S)编码区的塞姆利基森林病毒基因组的cDNA拷贝，在所有三个读码框架中其下都接着一个多接头盒(BamHⅠ-XmaⅠ-SmaⅠ)和翻译终止密码子。人载脂蛋白E2的cDNA在pSFV的多接头区用BalⅡ和BamHⅠ切出，通过一个BamHⅠBglⅡ位点插入，制备成载体pSFVapoE2。在这个载体中，载脂蛋白E2cDNA的表达是通过SFV基因组中的26S启动子驱动。第二种质粒是pSFV-辅助病毒2，它包含RNA复制所需的5′和3′信号，以及包括启动子在内的完整结构区域，但它缺乏将SFV RNA包装成核蛋白壳所需的一个区域。
建立pSFV表达系统的关键步骤是辅助病毒催化的pSFVcE2 RNA的包装。这个系统允许载脂蛋白E2 cDNA突变体的迅速的、暂时的表达，从而允许对它们的功能、物理化学特性和神经元毒性作快速检测。
一开始，质粒pSFV apoE2或pSFV-辅助病毒2在体外在SP6启动子的控制下进行转录。接着，SFV apoE2和SFV-辅助病毒2的RNA都通过电穿孔转染到BHK细胞中。在电穿孔的细胞中，SFV apoE2RNA编码负责RNA复制(扩增)和转录的酶，而SFV辅助病毒2通过它的亚基因组区支持结构蛋白的产生。由于辅助病毒缺乏RNA包装所需的区域，来自这个载体的RNA将不会被包装。因此，用重组RNA和辅助RNA共转染只产生携带重组RNA的病毒颗粒。
制得的病毒可提供供一次使用的贮存病毒。用重组病毒感染细胞之后，细胞只表达异源性蛋白(载脂蛋白E2)。此贮存病毒用来感染BHK细胞或从载脂蛋白E缺陷小鼠获得的原代星形胶质细胞。为了进行分析，汇合的BHK细胞或载脂蛋白E缺陷的小鼠原代星形胶质细胞培养物用重组的SFV apoE2感染12小时，病毒感染复数约为每个细胞三个感染单位，并在无血清的BHK培养基中生长24小时。病毒的滴度估计在107～108感染单位/ml。移出50μl培养基，通过SDS-PAGE和免疫印迹进行分析(图3)。以上所述说明重组的糖基化载脂蛋白E2在许多真核细胞中能有效产生。从染色条带的密度估计出的表达水平约在5-10μg载脂蛋白E/106细胞/1ml/24小时。使用SFV表达系统以类似的方法表达载脂蛋白E4和载脂蛋白E3在生物反应器(Verax System10)中产生载脂蛋白E2的细胞的大规模生长Verax生物反应器包括一个含悬浮微球的垂直柱(图4A)。这些微球由胶原蛋白组成，中空，其孔径允许细胞粘附和生长。细胞的密度可达到108细胞/ml。通过进入的培养基的流动使微球保持悬浮状态。一个气体交换装置提供所需的氧气，除去多余的二氧化碳。温度控制装置使培养基保持在37℃。通过一个泵使培养基在生物反应器和气体交换装置中循环。使用Verax System-10生物反应器，培养基中含30-50μg载脂蛋白E/ml(图4B)。
表达载脂蛋白E2、载脂蛋白E3或载脂蛋白E4的C127细胞的培养基通过使用葡聚糖硫酸酯琼脂糖柱和DEAE琼脂糖柱分级分离的方法进行纯化。
简而言之，用20mM Tris-HCl、0.2M NaCl,pH7.4平衡的20ml葡聚糖硫酸酯琼脂糖柱。总量为1升的含载脂蛋白E的培养基调整至含0.2M NaCl，以～80ml/hr的流量装柱。以同样流速的200ml的20mMTris-HCl、0.2M NaCl,pH7.4洗柱。以同样流速用120ml溶于20mMTris-HCl,pH7.4的0.2-1.0M NaCl梯度对柱子进行洗脱；2ml为一组份进行收集。从葡聚糖硫酸酯琼脂糖柱上洗脱下来的含载脂蛋白E的样品以20mM Tris-HCl pH7.4进行稀释调至含50mM NaCl，装在10mlDEAE柱上。用70ml溶于20mM Tris-HCl pH7.4中的0.05-0.75M NaCl梯度对柱子进行洗脱。由哺乳动物细胞或其他途径产生的载脂蛋白E3、E4和E2的特点由细胞培养物产生的载脂蛋白E2、载脂蛋白E3和载脂蛋白E4与合成的淀粉样多肽Aβ的结合。
为进行分析，用9μl不含或含4μMAβ(长度40个氨基酸残基)溶于20mM pH8.0的tris缓冲液中的水稀释1μl的载脂蛋白E2或载脂蛋白E3或载脂蛋白E4，在25℃孵育12小时。通过加入等体积的2×Laemmli缓冲液(不含β-疏基乙醇的4％ SDS)终止孵育，煮沸5分钟。通过在两种凝胶中(10％聚丙烯酰胺-2％SDS)进行凝胶电泳和Western印迹分析这种混和物。印迹后，一张滤膜(图片A)是用小鼠抗Aβ的单克隆抗体进行处理(图6A)，另外两张图片(图片B和C)是用羊抗载脂蛋白E的多克隆抗体进行处理。
这项实验表明重组的载脂蛋白E2、载脂蛋白E3和载脂蛋白E4在溶液中与Aβ形成稳定的弥散性复合物(图6A)。每一个这样的复合物在2％ SDS中煮沸后保持稳定。此复合物弥散性的特点可能是由于由这些细胞株产生的载脂蛋白E被含唾液酸的糖链高度修饰。不与任何一种同工型形成高分子量复合物。在图6B前三道中也可以看到复合物的形成，在第4道中不含Aβ。在此实验中，对所有的同工型均使用了等量的载脂蛋白E(1μg)和Aβ(4μg)。图6A-C的分析表明这些细胞产生的载脂蛋白E与Aβ的结合能力遵循载脂蛋白E2＞载脂蛋白E3＞载脂蛋白E4的顺序。使用前述的经不同的表达系统产生的载脂蛋白E可获得类似的结果。这种载脂蛋白E的结合行为与由杆状病毒表达系统(图7)或VLDL(图8)产生的载脂蛋白E的结合行为不同(Strittmatter等.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8098-8102)。
图6A-C的实验表明重组载脂蛋白E2、载脂蛋白E3和载脂蛋白E4与Aβ形成稳定的复合物。这些复合物在含Aβ的图6A、B的前三道中可见，但在不含Aβ的图6C相应的道中看不到。此分析明确确定新合成的分泌到细胞中的主要含经修饰形式的载脂蛋白E与Aβ的结合遵循载脂蛋白E2＞载脂蛋白E3＞载脂蛋白E4的顺序。
在其他的实验中我们通过密度梯度超速高心和免疫印迹的方法分析了由细胞培养物分泌的载脂蛋白E。此分析表明约45％的载脂蛋白E分布在漂浮在d=1.08-1.20g/ml的HDL区的脂蛋白颗粒中，40％的载脂蛋白E分布在漂浮在d=1.22-1.28g/ml区的脂类贫乏的颗粒中，而15％载脂蛋白E分布在d＞1.33g/ml的不含脂类的部分(图9)。这些不同类型的颗粒参与和Aβ形成复合物的程度不同。
根据流行病学资料(Corder等，(1993)Science 262:921)和图6A-C的发现，载脂蛋白E同工型与Aβ结合的增强与患阿尔采默氏病的风险呈负相关。通过在体外基本上不改变分子的构象或其他特点的一个或多个氨基酸的替代突变而产生的载脂蛋白E2的衍生物与Aβ的结合能力或许会超过自然存在的载脂蛋白E2形式与Aβ的结合能力。这些衍生物(例子在表1中列出)将提供一系列用于评估载脂蛋白E的结合行为的实验点(图10)。考虑到已报道的在制备AD动物模型方面的进步(Gomes等.(1995)Nature373:523)，下面的方法可以进一步确立载脂蛋白E与Aβ的结合和AD之间的关系用有一种载脂蛋白E缺乏背景的表达自然或突变形式的载脂蛋白E的小鼠与Athena Neuroscience制备的有AD倾向的小鼠(Gomes等，(1995),Nature,373:523)进行交配。对子代的分析将会提供与亲代小鼠相比一种特殊的载脂蛋白E变异体是防止了还是加速了子代中AD表型的发展的信息。例如，将有AD倾向的小鼠与EX1或EX6小鼠进行杂交将会确定载脂蛋白E与Aβ的强结合是有益的而弱结合是有害的。如果强结合是有益的，我们会预计到当给有AD倾向的小鼠应用EX6的时候它将防止AD的发展，而应用EX1将促进AD的发展。配制和使用为能起作用，本发明的载脂蛋白E2应与脑的神经元细胞相接触，或与紧邻这样的细胞的生理性液体相接触。在那样的环境中，载脂蛋白E2与Aβ-淀粉样多肽或与β-淀粉样前体蛋白相结合；当它与前体蛋白相结合的时候，它防止了前体蛋白进入下一阶段，即发生断裂形成阿尔采默氏病特征性的β-淀粉样蛋白。当载脂蛋白E2与Aβ-淀粉样多肽结合的时候，这种结合通过防止胞外淀粉样斑块的形成而抑制了阿尔采默氏病的进展。
通常，有几种方法能使载脂蛋白E2与脑细胞相接近或从脑中除去Aβ。
有研究表明载脂蛋白E与卵磷脂的非共价连接导致盘状颗粒的形成(Innerarity等.(1979).J.Biol.Chem.254:4186-4190)。载脂蛋白E也可以和富含甘油三酯的磷脂乳剂相连接(Derksen和Small(1989)Biochemistry 28:900-906)。
一种方法是由真核细胞产生的载脂蛋白E2被注入脑室，再进入脑脊液，在那儿它与Aβ相结合。
另一种方法是将载脂蛋白E2磷脂颗粒或甘油三酯磷脂乳剂注入脑室。Aβ将与颗粒或乳剂结合而被从脑中清除掉。
第三种方法是静脉注射载脂蛋白E2磷脂颗粒或甘油三酯磷脂乳剂。复合物通过与血/脑屏障上的载脂蛋白E受体相结合而穿过血/脑屏障。
第四种方法是根据Partridge等.(1995).Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:5592-5596的方法将生物素化聚酰胺连接到已连有链亲合素的载脂蛋白E2上。静脉注射之后，复合物通过与血/脑屏障上的载脂蛋白E受体相互作用而穿过血脑屏障。
游离的载脂蛋白E2或结合了脂类的载脂蛋白E2可以通过商业途径能得到的定向装置被注入脑室。用一支无菌铅笔标记出颅骨上定向装置的插入点。在颅骨上打一个2-3mm的洞。用定向装置在硬脑脊膜上打洞并用盐水浸泡过的凝胶泡沫覆盖，一根细管被放入脑室中，并与灌注泵相连，这将把载脂蛋白E2以不含脂类或与脂类结合的形式输送到脑室中。
将载脂蛋白E2溶液或载脂蛋白E2磷脂颗粒或载脂蛋白E2甘油三酯磷脂乳剂装到脑室内泵中，此泵是通过已知技术植入病人体内的。每一种载脂蛋白E2制剂被不断灌入病人的脑室中，其速率足以每天给病人每75kg体重输送500～1000μg的蛋白质。
另一种给药方式是将溶于载体液体的蛋白质注射到病人的脊柱中，这样它就可以和病人的脑脊液相接触。
另一种给药方式是静脉注射溶于生理性液体的含2mg apoE2/ml的载脂蛋白E2磷脂颗粒或载脂蛋白E2甘油三酯磷脂乳剂或载脂蛋白E2和聚酰胺的连接物。每天注射两次10ml的含载脂蛋白E2的溶液。
通常情况下，本发明的载脂蛋白E2可应用于三类病人1．被诊断为患阿尔采默氏病并表现出本病一般到严重症状的病人。
2．表现出阿尔采默氏病早期症状的病人并因此而被怀疑患有本病的病人；以及3．年龄超过45岁并有阿尔采默氏病家族史的无症状的病人；像这样的病人中有一类是携带两份载脂蛋白E4基因的。
另一种可供选择的治疗方法是使用编码载脂蛋白E2的DNA而不是载脂蛋白E2蛋白。使用此基因治疗的方法优选使用悬浮在液体介质中的逆转录病毒载体或含载脂蛋白E2编码DNA的表达载体；此悬浮液以注入蛋白质溶液相同的方式注入到脑脊液或脑室中。适宜的质粒和逆转录病毒载体已众所周知，可通过商业途径公开地获得。
其他的实施方案包括在下面的权利要求中。
权利要求
1．结合淀粉样多肽Aβ或淀粉样β前体蛋白的重组载脂蛋白E2(apoE2)。
2．权利要求1的载脂蛋白E2，其中该载脂蛋白E2与载脂蛋白E3和E4相比对Aβ的亲合力更高。
3．权利要求1的载脂蛋白E2，含有表1所列的氨基酸序列中的一种。
4．权利要求3的载脂蛋白E2，其中该载脂蛋白E2与载脂蛋白E2的天然序列形式相比对Aβ的亲合力更高。
5．权利要求1的载脂蛋白E2，其中该载脂蛋白E2被糖基化，并通过以下方法制备(a)用编码载脂蛋白E2的DNA转化真核宿主细胞，(b)在生长培养基中培养该宿主细胞，和(c)在非变性条件下分离该载脂蛋白E2。
6．权利要求3的载脂蛋白E2，其中该真核宿主细胞是一种哺乳动物细胞。
7．权利要求1的重组载脂蛋白E2，其中天然分子中112位半胱氨酸被精氨酸代替。
8．表达重组载脂蛋白E2的重组哺乳动物细胞。
9．权利要求8的细胞，其中该载脂蛋白E2与载脂蛋白E3和E4相比结合淀粉样多肽Aβ的亲合力更高。
10．权利要求8的细胞系，其中该载脂蛋白E2有非天然的氨基酸序列，与天然序列的载脂蛋白E2相比，其与淀粉样多肽Aβ的亲合力更高。
11．有一种载脂蛋白E缺乏背景的转基因小鼠，其中该小鼠在脑中的神经元表达人载脂蛋白E2。
全文摘要
结合淀粉样多肽Aβ的重组载脂蛋白E2(apoE2)
文档编号C12N5/00GK1206421SQ96199444
公开日1999年1月27日 申请日期1996年10月31日 优先权日1996年10月31日
发明者V·I·赞尼斯, S·B·阿勒斯科夫 申请人:科斯药品公司, 波士顿大学信托人