专利名称：抗微生物蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及可从甜菜分离的抗微生物蛋白质。
根据本发明，提供了一种抗微生物蛋白质，包含一种具有序列-Gln／Cys-AA2-Pro／Ile-Asn／Thr／Leu-AA5-AA6-Cys-Cys-Ala／Asn-Gly／Lys-AA11-AA12-AA13-AA14-AA15-的肽，其条件是AA2和AA14不是半胖氨酸，且当AA1是Cys时AA4是Leu。技术人员将认识到缩写AAx指20个常见氨基酸之一。
抗微生物蛋白质包括在任何环境中对包括细菌(尤其是革兰氏阳性细菌)、病毒且特别是真菌的任意微生物有毒性或生长抑制力的蛋白质(单独或与另一物质组合)。该抗微生物蛋白质包括在与微生物接触时表现出抗微生物活性的那些蛋白质和作为其同化作用或呼吸作用的后果而抗微生物的那些蛋白质。
根据本发明，提供了一种具有在SEQ ID Nos．3，5或6中任一项所述之序列的抗微生物蛋白质。
还包括具有SEQ ID No．3的抗微生物蛋白质的同工型，其中80位的Val是Ala。
本发明还进一步包括基本上相似于上述任一蛋白质的纯蛋白质。
“基本上相似于”是指包含与上面给定的肽序列有至少95％的相似性的氨基酸序列的纯蛋白质(也如权利要求1所限定)和／或具有至少65％相似，优选75％相似，更优选85％相似，特别优选95％相似于下面SEQID Nos 3，5或6所述蛋白质之序列的氨基酸序列的纯蛋白质。在本发明说明书中，互相间具有给定百分数相似性的两个氨基酸序列当任选引入高达2个缺口且对于每个缺口而言总共影响不超过2个氨基酸残基来进行序列比较时在相似位置具有至少该百分数的相同或保守取代的氨基酸残基。
为达到本发明的目的，保守取代可在下列各组内的氨基酸之间作出(ⅰ)丝氨酸和苏氨酸；
(ⅱ)谷氨酸和天冬氨酸；(ⅲ)精氨酸和赖氨酸；(ⅳ)天冬酰胺和谷氨酰胺；(ⅴ)异亮氨酸，亮氨酸，缬氨酸和甲硫氨酸；(ⅵ)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸(ⅶ)丙氨酸和甘氨酸。
本发明还进一步包括与根据本发明的抗微生物蛋白质具有至少90％相同的纯蛋白质，以及具有其至少90％的比活的纯蛋白质。为达到本申请的目的，比活是由限定量的蛋白质对限定量的特定微生物产生生长或复制抑制的量的测量值。
本发明还进一步包括所说的纯蛋白质与选自SEQ ID Nos．7至12和14中所述的至少一种蛋白质组合。该组合的蛋白质可进一步与一种或多种已知的“致病相关性蛋白质”组合。用真菌或病毒病原体感染植物可在营养组织中诱导系统合成大约10个家系的同源致病相关性蛋白质(PR蛋白质)。该PR蛋白质被分成5组。PR-2，PR-3和PR-5蛋白质分别是β-1，3-葡聚糖酶，几丁质酶和奇异果甜蛋白类蛋白质。对于PR-1和PR-4组的蛋白质尚未确定其具体功能。PR-4蛋白质相似于橡胶蛋白原的C-末端区域和推断的土豆伤口诱导性WIN蛋白质，因此缺乏N-末端橡胶蛋白区。特别优选的是根据本发明的蛋白质与一种或多种作为PR-4组蛋白质的基本相对部分的蛋白质组合，该相对部分指相似于橡胶蛋白原的C-末端区域和推断的土豆伤口诱导性WIN蛋白质的蛋白质基本相对部分。特别优选的是，所说的致病相关性蛋白质的基本相对部分是几丁质结合WIN蛋白质，特别是由大麦粒或应激的大麦叶所产生的该蛋白质。
本发明还进一步包括含有编码具有上文所公开的抗微生物蛋白质的氨基酸序列的蛋白质之序列的重组DNA。特别是该DNA可编码至少一种其序列在SEQ-ID Nos．3，5和6中描述的蛋白质，另外任选编码至少一种其序列在SEQ ID Nos．7至12和14中描述的蛋白质。优选的是，编码具有在SEQ ID No．3，5或6中所述之氨基酸序列的蛋白质的序列具有SEQ ID No．1(编码具有SEQ ID No．6的蛋白质，相应于IWF5)，SEQID No．2(编码具有SEQ ID No．3的蛋白质，相应于IWF6)或SEQ IDNo．4(编码具有SEQ ID No．5的蛋白质，相应于IWF7)中所述的cDNA序列。该重组DNA可进一步编码具有除草剂抗性，植物生长促进，抗真菌，抗细菌，抗病毒和／或抗线虫特性的蛋白质。如果该DNA将被导入异源生物中，可对它进行修饰以去掉已知的mRNA不稳定性基序(如富含AT的区域)和多聚腺苷酸化信号(如果存在的话)，和／或使用将要插入重组DNA的生物所优选的密码子以使由此修饰的DNA在所说的生物中的表达产生基本上相似于未修饰的重组DNA在根据本发明的抗微生物蛋白质是内源性的生物中表达所获得的蛋白质。
本发明还进一步包括与上面所述“相似”的重组DNA。“相似DNA”指互补于能与本发明的重组序列杂交的试验序列的序列。当试验和发明序列是双链时，组成试验序列的核酸优选TM在发明序列TM的20℃内。如果试验和发明序列混合起来且同时变性，这些序列的TM值优选彼此在10℃内。更优选的是，杂交在严格条件下进行，优选试验或发明DNA在支持物上。因此，优选变性的试验或发明序列首先结合到支持物上，在50至70℃之间的温度下在含0．1％SDS的双倍浓度柠檬酸盐缓冲溶液(SSC)中在限定的一段时间内实现杂交，随后在相同温度下但用SSC浓度减少的缓冲液漂洗支持物。根据所需的严格程度，且由此得到序列的相似程度，在某一具体温度(如60℃)下，浓度减小的缓冲液典型地是含0．1％SDS的单强度SSC，含0．1％SDS的半强度SSC和含0．1％SDS的1／10强度SSC。具有最大相似程度的序列是其杂交受浓度减小的缓冲液洗涤的影响最小的那些序列。最优选的是试验和发明序列非常相似，以致于它们之间的杂交基本上不受在含0．1％SDS的1／10强度柠檬酸钠缓冲液中洗涤或培养的影响。
本发明还进一步包括互补于在严格条件下与根据本发明的重组DNA杂交的序列的DNA序列。
本发明还包括含有能在植物中表达的并与植物可操纵的启动子和终止子连接的上面公开的DNA的载体；用该DNA转化的植物；含有稳定插入并能以孟德尔方式遗传的DNA的该植物的后代，和／或该植物和该后代的种子。转化的植物可用已知方法制备且包括用本发明的DNA根据各种已知方法(土壤杆菌Ti和Ri质粒，电穿孔，显微注射，微粒枪等)转化的植物细胞或原生质体的再生。转化的细胞可在适当情况下再生成完整植物，其中核物质稳定地掺入基因组。以这种方式可获得单子叶和双子叶植物。根据本发明的转化植物的例子包括水果，其中包括西红柿，芒果，桃，苹果，梨，草莓，香蕉和甜瓜；野外庄稼，如canola，向日葵，烟草，甜菜，小粒谷类，如小麦，大麦和水稻，玉米和棉花，以及蔬菜，如土豆，胡萝卜，莴苣，甘蓝和洋葱。优选的植物是甜菜和玉米。
本发明还进一步包括由所说的DNA表达产生的蛋白质，和由重组DNA在用其转化的植物内表达产生的抗微生物蛋白质。
本发明还进一步包括含有一种或多种根据本发明的蛋白质的抗微生物组合物；包括将它们与该蛋白质接触的抵抗真菌的方法，以及从含有抗微生物蛋白质的生物材料中获得抗微生物蛋白质的提取方法，包含对该材料(优选以微生物的形式)进行离析并用溶剂提取。可预料到的是该抗微生物蛋白质对作为上面所称之生物材料的来源的微生物表现出很小(如果有的话)的抗微生物效应。
从下面的描述和有关附图及序列表将使本发明更显而易见。
图1显示了从CM琼脂柱的胞间洗涤液的典型洗脱图谱；图2显示了图1所示的0．3M NaCl馏份从Mono S FPLC柱的典型洗脱图谱；图3显示了图2中峰4所代表的蛋白质从RP-HPLC柱的典型洗脱图谱；图4显示了图3中峰4．4所代表的蛋白质从RP-HPLC柱的典型洗脱图谱；图5显示了图3中峰4．3所代表的蛋白质从RP-HPLC柱的典型洗脱图谱；图6显示了图2中峰5代表的蛋白质从RP-HPLC柱的典型洗脱图谱；图7显示了图6中峰5．4代表的蛋白质从RP-HPLC柱的典型洗脱图谱；图8和9显示了不同量的图4中峰4．4所代表的蛋白质(SEQ ID No．6)的抗真菌活性；图10显示了图5中峰4．3(SEQ ID No．3，其中80位的Val是Ala)所代表的蛋白质的抗真菌活性；图11显示了图7中峰5．4(SEQ ID No．5)所代表的蛋白质的抗真菌活性。
SEQ ID No．6显示了图4中峰4．4所代表的蛋白质的氨基酸序列；其中80位Val是Ala的SEQ ID No．3显示了图5中峰4．3所代表的蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID No．5显示了图7中峰5．4所代表的蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID No．7至12和14显示了已知抗真菌蛋白质的氨基酸序列。抗性诱导用25ppm 2，6-二氯异烟酸(INA)以2天的间隔处理6周龄甜菜(betavulgaris Lcv，=．Monova，Danisco Seed)4次。经过喷洒近轴叶表面至饱和点施用悬浮于0．05％Tween 20中的INA。最后一次处理2天后，按下面所述分离胞间洗涤液(IWF)。从未接触INA的叶中分离的胞间洗涤液也含有根根据本发明的蛋白质。胞间洗涤液的分离经过浸入20mM HAC(pH4．5)中从500-700克甜菜叶中分离出IWF。然后将由此浸入的叶放入脱水器中并以4乇(最大值)真空浸润5分钟。空气干燥叶表面后，在500ml离心管中以500g离心15分钟收集IWF。阳离子交换色谱经过在起始缓冲液(20mM HAC(pH4．5))中预先平衡的10ml CM琼脂糖柱(Pharmacia LKB)上进行阳离子交换色谱分离由此获得的IWF。在4℃下以25ml／h的流速进行分离。收集每份3ml馏份。经过用起始缓冲液充分洗柱去掉未结合于柱上的蛋白质。经过对柱使用含逐步增加盐浓度即，0．1M NaCl，0．3M NaCl和0．5M NaCl的另一起始缓冲液洗脱结合的蛋白质。测量洗脱液在280mm处的吸光率，使用以前描述的微量滴定平板生物测定(PCT专利申请号PCT／DK 92／00108，
发明者K·K·奈尔森, A·科洛尔克里斯藤森, J·布伦斯泰德 申请人:诺瓦提斯公司