专利名称：通过高细胞密度发酵在大肠杆菌中制备重组蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及使用特殊的大肠杆菌宿主/载体系统以有效地生成重组蛋白质，特别是重组抗体分子，最好是抗体片段如小抗体的补料分批发酵方法。
在按照本发明的条件下，大肠杆菌细胞能够以最大比生长速度生长至很高的细胞密度。产物的重组生成开始后，只有生成的产物对生长产生限制作用，而底物或代谢副产物不限制生长。以这种方式，并与特别适合于这一目的并表现有高稳定性的新的表达载体结合起来，有可能使表现高生物学活性的重组蛋白质达到很高的空间-时间产率，特别是在生产抗体片段的情况下。
大肠杆菌细胞培养物达到高细胞密度是重组蛋白质有效生成的基本要求。下述培养方法是为此目的的现有技术状况在分批发酵期的无限制生长(μ=μmax)后，通常在继后的补料分批培养期以限制的方式量入碳源(葡萄糖或甘油)，从而避免生成生长抑制性副产物如乙酸盐，结果是生长过程能以一种仅受底物限制的方式(μ＜μmax)继续进行，直到达到高细胞密度(如参见Riesenberg等，1991,J.Biotechnol.,Vol.20,17-28；Strandberg等.，1994,FEMS Microbiol.Rov.,Vol.14,53-56；Korz等.，1995,J.Biotechnol.39,59-65；EP-B-0511226)。以降低的生长速率生长自然导致发酵时间延长，而且也降低了空间-时间产率。由于即时的消耗，使这些发酵中培养溶液内的碳源浓度几乎为零。重组产物开始生成后，没有改变底物限制的条件。
使用大肠杆菌的补料分批培养也是已知的，其中不连续地以相对长的时间间隔并以相对大的量加入碳源，同时通常用于指示继后碳源加入的底物耗竭指征pO2值升高(如参见Eppstein等，1989,Biotechnol.7,1178-1181)。这就意味着不断地从相对长时间的底物过量条件转变为底物限制条件，并因而暗示代谢不平衡。
在下述补料分批培养中，细胞可以在补料分批生长期以最大比生长速度(μ=μmax)生长。在补料分批培养中，为避免底物限制的目的，按离机检测结果以相对长的间隔期向培养物中加入相对大量的碳源，这种方法在实验上是很复杂的，并有在整个发酵过程不断地改变碳源浓度的缺点(例如Pack等.,1993,Biotechnol.,Vol.11,1271-1277；Hahm等.,1994,Appl.Microbiol.Biotechnol,42,100-107)。
也已描述了机内检测并调整碳源浓度从而避免限制的补料分批培养，但这些培养物特别是高细胞密度区的培养物存在下述的缺点。近年已描述了可在搅拌的罐式发酵器中进行微生物发酵使用的可加压加热的葡萄糖生物传感器(M.R.Phelps等.,1995,Biotechnol.Bioeng.,Vol.46,514-524)。其被用于大肠杆菌培养物。该原位传感器在培养物溶液中提供时间延迟约2分钟的当前观测值。由葡萄糖传感器提供的信号特别取决于pH和pO2。没有在高细胞密度区(X＞80g/L)试验过这种传感器。根据经验，可知当使用大肠杆菌时在原位探测器上生长所导致的在很高细胞密度下的其他错误值。此外，在发酵进行期间不可能精确地重新校准传感器。代替使用原位传感器进行检测的其他方法是基于使用联机流动注射分析(FIA)来检测碳源，或使用联机HPLC来检测从发罐器中半连续地取出并经过滤或微量离心而除去细胞的培养物溶液(Kleman等.,1991,Appl.Environ.Microbiol.57,910-917和918-923；Turner等.,1994,Biotechnol.Bioeng.44,819-829)。提前和反馈控制减少了生长至X=65g/L期间葡萄糖浓度的波动(Kleman等.,1991,Appl.Environ.Microbiol.,Vol.57,910-917)。在很高细胞密度的区域(大约80g/L至150g/L)，分离细胞和营养溶液的难度越来越大，而且耗时增加，这样便也以生物量依赖方式增加了测定当前葡萄糖值的时间，并使之难以或不可能保持葡萄糖水平恒定。相反，使用不需进行这种细胞分离的装置，以恒定和短暂的滞后检测葡萄糖浓度(Pfaff等，1995,p6-11，摘自“Proceedings of the 6th International Conference on Computer Appl.inBiotechnol.Garmisch-Partenkirchen,FRG)。按照Pfaff等人的方法，在已用生长抑制剂稀释培养物后，于加样部位附近使用具有酶-电流计葡萄糖传感器的FIA。
在通气培养期间，没有受剂量范围制约的大肠杆菌细胞以通常的底物限制性方式生长产生更多代谢副产物乙酸盐(Riesenberg,1991,Curr.Opinion Biotechnol.,vol.2,380-384)，该乙酸盐在营养溶液中积聚，并且当以相对大量存在时便具有生长抑制作用(Pan等.，1987.Biotechnol.Lett.,Vol.2,89-94)。为此，以前只有使用借助特异性遗传学改变降低了乙酸盐积聚量、而耐受与此相关的其他缺点的特异大肠杆菌菌株，才可能进行补料分批培养达到高细胞密度。但大肠杆菌K12的子代包括磷酸转乙酰酶阴性突变体(Bauer等.，1990,Appl.Environ.Microbiol.,Vol.56,1296-1302；Hahm等.，1994,App.Microbiol.Biotechnol.,Vol.42,100-107)，但其在葡萄糖/矿物盐培养基中的生长能力均明显降低。Pbelps及其合作者(见上述引文)使用大肠杆菌菌株TOPP5作为宿主进行非底物限制性培养，使生物量达到X=85g/L。但这种显然不明显积聚乙酸盐的大肠杆菌菌株并不是K12菌株。大肠杆菌TOPP5产生溶血素，因此为安全起见，不适于将这样一个病原菌株作为工业规模生产重组DNA产物的宿主。可用含有乙酰乳酸合成酶(ALS)编码基因的质粒转化大肠杆菌细胞，特异性地重新定向中间代谢途径以减少乙酸盐积聚(San等.,1994，摘自Ann.N.Y.Acad.Sci.,Vol.721,257-267)。但这种方法的缺点是，当编码ALS的质粒与携带“生产”基因的第二个质粒合用时，在高细胞密度条件下常常存在稳定性差的问题。重组产物生成的效率常常因质粒不稳定而降低，这样就使那些与很高细胞密度下培养有关联的副产物含量增加。
抗体片段，如Fab′、F(ab′)2、小抗体或单链Fv，在医学生物技术领域中的重要性越来越大。在下文中，按照本发明，小抗体应理解为一种借助假铰链区连接的双价或双特异性单链Fv片段。因此得到大量抗体(约1g/剂)，例如在肿瘤治疗中其可能是很重要的。在这个方面，可在大肠杆菌中特别容易地和令人满足地制备单价抗体片段、这些片段的融合蛋白质，或其多聚体或多特异性变异体。这些片段或变异体是与高特异性结合能力相关的小的片段或变异体(如参见Plückthun A.,1992,Immunol.Rev.130,151-188；Pack等.，1995,J.Mol.Biol.246,28-34)。但这些蛋白质，特别是抗体必须正确折叠才能是生物学上和功能上有活性的。当考虑到每个细胞产生的抗体片段的产率时，必须注意与细胞密度相关联的这一问题。此外，抗体的一级序列在决定体外产率和体内折叠中是很重要的(Knappik A和Plückthun A.,1995,Protein Engin.8,81-89)。因此，例如Fab片段是作为不溶性胞浆或周质集聚物被表达，并在体外重新折叠的。已有报导指出当在低细胞密度时产率约为0.14g/L(Condra等.，1990,J.Bio.Chem.265,2292-2295)，并且在中等细胞密度时不溶性抗体的量达到约1-2g/L(Shibui等.，1993,Appl.Microbiol.Biotechnol.38,770-775)。也可以在大肠杆菌中以大约0.2g/L的产率得到生物学功能形式的双价小抗体(Pack等.，1993,Biotechnol.11,1993,1271-1277)。这些产物中平均约5-45％被正确重新折迭。
在已知的大肠杆菌系统中，作为一种规律，在达到适当的细胞密度后，由相应于表达系统的可调节的启动子系统以适当方式启动外源蛋白质的表达。可提到的启动子系统的例子是(ⅰ)于AraC阻竭子存在下的araBAD启动子(可由阿拉伯糖诱导)(如Better等.，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90,457-461),(ⅱ)phoA启动子(可经去除磷酸盐而诱导)(如参见Carter等.，1992,Biotechnol.10,163-167)及(ⅲ)lac启动子系统(可用IPTG诱导)(Pack等.，1993，引文同前)。虽然通常lac系统可引起好的表达效果，但也存在某些缺点一方面是在诱导启动子之前观察到不希望有的基础表达；另一方面是发现在用IPTG诱导后质粒不稳定。
在本发明的一个特定实施方案中，描述了一个特殊的载体(pHKK)，其含有编码鼠或人源化抗体Mab425的序列作为外源基因。Mab425(ATCC HB 9629)是从已知的人A432肿瘤细胞系(ATCCCRL1555)中分离的，并与人表皮生长因子受体(EGFR，一种约170kD的糖蛋白)的抗原表位结合而抑制天然配体EGF结合的鼠单克隆抗体。已证明Mab 425对肿瘤细胞有细胞毒性作用，并且能够损害这些细胞的生长(Rodeck等.，Cancer Res.1987,47:3692)。WO92/15683公开了人源化和嵌合形式的Mab425，包括它们的轻和重链的DNA和氨基酸序列。
本发明的目的是提供一种在高细胞密度条件下(HCDC=高细胞密度培养)，在重组大肠杆菌细胞中以高空间-时间产率制备外源蛋白质，特别是抗体片段的方法，其中没有因底物或代谢产物对生长引起的实质性损害，并且没有显著的质粒丢失或质粒不稳定性，而又确保被表达的蛋白质表现出高度有效的生物学活性(结合能力和正确折叠)。
本发明的方法是一种主要突出点在于细胞能够在整个分批发酵期以最大速率生长的(μ=μmax)多步骤分批方法。因此，能使用所描述的方法最终达到100-150g/L(生物量干重)的细胞密度。再者，没有因乙酸盐积聚而在很大程度上抑制生长，这是因为所说的乙酸盐积聚在所选择的条件下并不显著，特别是当使用在任何情况下倾向于在发酵期只生成较低量乙酸盐的大肠杆菌菌株时，这也可与一系列其他附加手段相关，但首先也主要由于在分批培养期后插入的分批补料期间保持培养基中碳源浓度恒定在限定的范围内，而保持细胞不受限制的生长。通过以适当方式设计相关表达载体，也可在借助可调解的启动子系统启动蛋白质合成之前基本消除不希望有的蛋白质的基础表达，也可消除质粒丢失，后者有时是很显著的，并且如前所述在所用强启动子如lac启动子系统的表达系统中可正常观察到。
在经过大约25至30小时的总培养时间之后，可达到平均3-5g/L的蛋白质产率。在表达抗体片段特别是小抗体的情况下(其折叠标准严格)，合成材料的约80％是有生物学活性和正确折叠的。
因此本发明涉及借助有分批发酵和分批补料阶段的高细胞密度发酵，在已用携带外来基因和可诱导性启动子的质粒转化的大肠杆菌细胞中制备外源蛋白质的方法，其中没有底物或代谢副产物对细胞生长的任何限制，并从培养基中分离和纯化所表达的蛋白质，使用连续的、自动或半自动分析法及加料系统控制分批补料期的底物浓度，并且在分批补料期使(ⅰ)培养基中碳源的浓度稳定在0.1g/L至25g/L，而保持细胞不受限制的生长(μ=μmax),(ⅱ)在所说的分批补料期内经细胞密度为10-80g/L时经诱导启动子而开始外源蛋白质的生产，并且(ⅲ)还在诱导产物合成过程发生后，连续供入可利用的氮和磷酸盐以及微量元素的盐，其中(ⅳ)在整个分批补料期，以适当方式向发酵液内通入氧气以将pO2值调到5-25％之间。
根据本发明，在分批补料期所需的碳源浓度为0.1-25g/L。优选的浓度范围为0.5-15g/L，特别是1.0-5g/L，或1.0-3g/L。特别优选的浓度是1.5g/L。可提到的优选碳源为葡萄糖或甘油或这两种化合物的混合物。根据本发明，使用自动或半自动加入和分析系统以连续方式(联机)加入碳源。最好使用联机流动注射分析系统(FIA)。
供入可利用的氮，最好是铵氮和磷酸盐，例如磷酸氢二铵或磷酸二氢铵，以及微量元素，例如可溶于培养基中的硼、锰、铜、钼、钴、铁或锌盐。在插入在分批培养期后的补料分批期，最好在用可调节的启动子开启蛋白质合成之后，当细胞密度为50-80g/L(生物量干重)，最好约70g/L，总生长速度为100-150，最好140g/L时进行上述供料。
根据本发明，当细胞密度为10-80g/L，较好20-60g/L，最好40-50g/L时，经激活可调节的启动子系统来启动蛋白质合成。
在补料分批培养期，氧分压为5-25％，较好为15-25％，最好为20％。
根据本发明，在整个分批培养期间，必须将发酵培养基的pH调整到6.5至7.0之间，较好6.7至6.9之间，最好调到6.8。
本发明进一步涉及一种相应的方法，其中使用具有表达盒的表达载体，所说的表达盒含有外来基因并侧接有两个终止子序列。这些终止子序列，特别是位于上游的终止子序列，可在由启动子系统启动表达之前成功地阻止不需要的蛋白质表达。虽然终止子thp(Nohno等.，1998,J.Bacteriol.170,4097-4102)是特别适用的，但也可使用其他已知的终止子序列。
本发明还涉及一种利用含有自杀系统的附加表达载体的方法。在质粒不存在于细胞中的情况下，该自杀系统产生对细胞有毒性的蛋白质。文献中已描述过适当的自杀系统。特别适用于本发明的自杀系统是nok-sok系统(如参见Gerdes.K.,1988,Biotechnol.6,1402-1405)。因此，对于一种有效地生成重组蛋白质，特别是抗体分子的方法来说，使用特征在于在高细胞密度区有高质粒稳定性、低重组基础表达和高产物生成率的宿主/载体系统是很重要的。在这方面，与侧翼接有终止子的重组表达盒组合的自杀系统是载体特异性的。
本发明进一步涉及一种其中利用表达抗体片段，特别是小抗体的外源基因的相应方法。
本发明还涉及一种其中利用具有下述附加特征之表达载体的方法。
原则上，已知的并适用于重组技术和进行工业规模生产的大多数大肠杆菌菌株均可使用。最好使用那些在生长至高细胞密度期间较少积聚乙酸盐的菌株。特别适用的是那些乙酸盐富集量少于5g/L的菌株。令人惊奇的是，使用根据本发明的方法选择的条件，可使乙酸盐积聚量保持在特别低的水平。就这一点而言，已知的和可从市场上购得的大肠杆菌菌株RV308(ATCC 31608)及其具有同样效应的变异体是特别适宜的。
因此本发明具体地涉及一种相应的方法，其中利用了表现出在发酵期间培养基中乙酸盐积聚量少于5g/L的大肠杆菌菌株。
本发明还涉及适于在高细胞密度发酵条件下表达外源蛋白质，并表现有下列特征的大肠杆菌表达载体(ⅰ)上游终止子序列和下游终止子序列，(ⅱ)lac启动子/操纵子系统，(ⅲ)T7g 10 Shine-Delgarno序列，(ⅳ)pelB或ompA信号序列，(ⅴ)外源基因序列，并且在一优选实施方案中，还带有适当的自杀系统，特别是hok-sok自杀系统。
根据本发明，可用例如上文提到的其他适当的系统取代启动子系统。同样，本发明也包括具有同样作用的其他信号序列和控制序列。
最后，本发明涉及结构限定的表达载体pHKK(图2)，其含有衍生于Mab425的小抗体的序列，并涉及作为特定实施方案的特定重组大肠杆菌宿主RV308〔pHKK〕。
图1用于在高细胞密度条件下制备蛋白质的生物反应器的实验装备。该系统配有测量装置、显示装置、控制装置和计量装置。
图2最佳化表达载体pHKK和其构建的组成部分。该载体基本是由已知载体pASK40、pAK100和pKG1022的组成部分构成的。
图3(a-d)使用实例大肠杆菌RV308〔pHKK〕的重组大肠杆菌的HCD培养生物量、葡萄糖、铵氮、磷酸盐、乙酸盐、搅拌速度、pO2排出气体中的O2和CO2、质粒稳定性(表示为β-内酰胺酶阳性集落的百分数)及蛋白质(此处为scFv425 dhlx)生成的时序过程。将分批发酵和补料期分为5个亚期。IPTG箭头指示蛋白质生产的开始。
本发明的方法使用被转化的大肠杆菌宿主细胞。依据待表达蛋白质的性质选择质粒构建体。以下描述这些质粒构建体的特别有利的特征。质粒构建和宿主细胞转化所用的技术和方法都是已知的，并在文献(如Sambrook等，1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor)中作过详细描述。此外，在实施例中都对本发明的特定实施方案作了解释。可经商业途径购得或使用基于已知构建程序的常规方法比较容易地构建起始质粒或质粒部分。
根据本发明，将被转化大肠杆菌细胞典型发酵的在先分批期分为两个亚期。在接种适当的初级培养物后，在以延迟期为特征的亚期Ⅰ中，细胞经过适应后生长速度μ增加到μmax。在亚期Ⅱ中，细胞以μ=μmax的速率呈指数生长。当pO2从100％饱和降到小于5-15％后，经控制pO2搅拌器的速度调整pO2值，使之在15至25％之间，最好为大约20％(图3c)。这种调整(通入富含纯氧的空气)应在主培养物开始发酵后约6至12小时进行。开始时最好为20-35g/L的葡萄糖浓度逐渐降低直到亚期Ⅱ终止，这也构成分批补料期之前的分批发酵期的终止。对此，葡萄糖浓度无论如何都不应低于0.1g/L。从此时起，应适当地供入葡萄糖以防止这种葡萄糖浓度的过度减少(亚期Ⅲ，图3a，分批补料期的开始阶段)。根据本发明，应使葡萄糖值保持在0.1-25g/L之间，但最好是在1-3g/L之间。为此目的，例如可使用营养培养基FS1(表1)。因为这一葡萄糖浓度范围足以远在葡萄糖的Ks值以上(Bergter,1983,“Wachstum von Mikroorganismen(微生物的生长)”，p.41,GustavFischer Verlag,Jena)，所以细胞能以μmax值继续生长。根据本发明，使用自动或半自动系统监测并调整葡萄糖浓度。特别适用的是联机操作的流式注射分析系统。已发现纯手工的或主要以手工操作的系统是不适宜的。虽然分批补料期开始于大约15至22小时之间，但这最终还要取代于温度、培养基组成、培养基浓度及反应器大小等不同的个别因素，特别是要取决于所利用的大肠杆菌的性质。最好在分批补料期开始后约4至8小时开启外源蛋白质的合成。但精确时间最终要取代于这个时间所达到的培养物的细胞密度。如果欲达到100至150g/L的最终细胞密度，则这个时间的细胞密度在10-80g/L，尤其20-60g/L是特别有利的。因此，如果在诱导时存在欲达到的最大细胞密度的10-60％，总地说来对开始蛋白质合成是有利的。
启动可调节的启动子系统以引起蛋白质合成。依据所使用的系统的不同，一般是通过加入某种物质或改变物理量而完成这种启动的。在使用优选的lac系统(启动子、操纵子或诱导子)的情况下，经加入IPTG(异丙基硫代-β-半乳吡喃糖苷)完成启动。此时细胞的进一步生长只受积聚的产物的限制。为此，根据本发明，重要的是在诱导之前没有可能对总生长进而对总产率造成不利影响的显著基础表达。根据本发明，这一点是通过设法在质粒中的表达盒上侧翼连接有效的终止子序列而实现的。
从开始供入葡萄糖时，发酵培养基中氮和磷酸盐便开始贫乏(图3a,b)。为了避免任何天然需求的限制，最好借助适当的连续方法同样供入氮和磷酸盐。最好以铵盐的形式提供氮，因为这样也可同时对pH(6.5至7.0，最好6.8)产生影响。例如可选用溶液FS2(表1)。根据本发明，亚期Ⅳ的特征是提供可溶性盐形式的微量元素(如硼、锰、铁、钴、铜和锌)。通常，可以以恒定速率连续加入。亚期V的特征是主要由于产物积聚造成的生长速度降低。此外，可观察到乙酸盐浓度稍有增加。但培养基中乙酸盐的积聚量和乙酸盐浓度是惊人地低的。这也将归因于特定的工艺条件。在发酵期间表达＜5g/L的最大乙酸盐富集量的大肠杆菌显著地进一步加强了这种作用。
依据蛋白质的性质，蛋白质的平均产率在2至6g/L之间。同样依据蛋白质的性质，其中50％至95％是有生物学活性的。就抗体片段来说，所得到的80％以上的蛋白质是重新折叠的。这些数据显著超过了以前本技术领域中描述过的相似方法中得到数据。
优选使用已描述的相应工艺用于有效地制备抗体片段、特别是小抗体，其中包括已特殊构建并为这一目的而改造的表达质粒。但也可能使用本发明的工艺有利地制备许多其他蛋白质、融合蛋白质或酶。这些蛋白质的例子是杂合体链激酶和葡萄糖脱氢酶，或对凝血有作用的蛋白质，如水蛭素、凝血酶、hementin或theromin。
表1培养基的组成；FS1、FS2和FS3构成在分批补料期的不同亚期使用的供料培养基
实施例1使用原养型大肠杆菌K12菌株RV308(lac 74-gal ISII::OP308strA)(Maurer等.，1980,J.Mol.Bio.139,147-161；ATCC 31608)制备重组大肠杆菌宿主。除非另有解释，均使用标准方法用适于表达的载体进行转化，以及所有其他必要的DNA操作。在相应的高细胞密度发酵中，使用无质粒大肠杆菌RV308细胞作为对照。
按下述方法构建载体pHKK(图2)将得自pAK100(Krebber和Plückthun,1995)的含有处于lac p/o之上游区的强转录终止子tHp(Nono等，文献同上)的小MluⅠ片段插入到质粒pASK40(Skerra等，1991,Biotechnol.9,273-278)中。借助另外两个克隆步骤插入nok-sok DNA用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切从pKG1022(Gerdes,1988，引文同上)中切出aphA基因，用DNA聚合酶(Klenow片段)填充并重新连接。在第二步骤中，将得自pKG1022的修饰的BamHⅠ片段克隆到第一个克隆产物的单一BamHⅠ裂解位点上。从单链ab片段产生小抗体，在所说的小抗体中呈VH-VL方向的可变区连接到柔性接头(gly4ser)3上，然后是富含组氨酸的铰链区及经过修饰的螺旋-转角-螺旋区(helix-turn-helix domain)(dhlx)(Pack等，1993,Biotechnol.11,1271-1277)。WO92/15683中详细描述了鼠/A源化Mab 425的轻和重链的DNA序列、引物、扩增及克隆。为了确保scFv425dhlx片段分泌到周质中，将VH区域以N末端融合到pelB信号序列上。使用PCR方法，将T7g10核糖体结合位点(Shine Dalgarno)克隆到pEG1(Strittmatter等，1995)的XbaⅠ和SfiⅠ切割位点中。将最后构建完成的scFv425dhlx表达盒克隆到XhaⅠ和HindⅢ切割位点之间。如此得到图2中图示的表达载体pHKK。
实施例2表1中汇总了锥形培养瓶中初步发酵之培养基的组成、配有搅拌机械的罐式反应器(Biostat ED10,B.Braum,Biotech International,Melsungen,FRG)中主培养物的组成，以及供料培养基FS1、FS2和FS3的组成。参照Riesenberg等人(1991)(文献同上)的培养基改变主培养基(8L)组成。为了防止沉淀，按表1中给出的次序加入各成分。作为分别高压灭菌的溶液加入葡萄糖和硫酸镁。反应器工作温度为26℃，压力为0.15MPa,pH为6.8，平均通气速率为10L/分钟。用25％氨水调整pH。发酵期间借助传感器控制，分别加入用以调整pH和作为滑泡剂的氨和Ucolub N115(Fragol Industrieschmierstoffe GmbH,Mükleim/Ruhr,FRG)。FS1按如下制备将750g葡萄糖和22.2gMgSO4×7H2O分别溶于600ml水和50ml水中。高压灭菌后将各溶液彼此混合。将227g(NH4)2HPO4和169.5g(NH4)H2PO4溶解于水中以制备FS2，同时在高压灭菌前加入60ml25％NH3以将pH调到6.8。按下述顺序从储备溶液制备FS3:50ml柠檬酸铁(Ⅲ)水合物(6g/L)、0.5mlH3BO3(30g/L)、0.5mlMnCl2×4H2O(10g/L)、0.5ml EDTA×2H2O(84g/L)、0.5ml×CuCl2×2H2O(15g/L)、0.5ml×Na2MoO4×2H2O(25g/L)、0.5mlCoCl2×2H2O(25g/L)和10mlZn(CH3COO)2× 2H2O(4g/L)。
实施例3使用已于26℃下在LB琼脂平皿中生长的几个菌落过量接种20ml液体LB培养基。振摇(200rpm,26℃)5小时后，取1ml移到装于500ml培养瓶内的100ml初级培养基中，并继续保温。使用10ml初级培养物以过量接种100ml新的初级培养基。按这种方式，产生9份初级培养物，合用这些培养物过量接种发酵器中的8L主培养基以达到初始OD550≈0.2。
实施例4图1中图解显示了带有辅助和控制装置的10L生物反应器的模式结构。使用数字测量和控制单元(DCU)、多发酵器控制系统(MFCS)及气体流量控制单元进行基于高细胞密度发酵规模的培养。持续地测量CO2和氧气释放量。过量接种后，使用生物样品收集器MX-3(NewBrunswick Scientific,Watford,UK)取无菌样品并得以进行离机数据分析(Webb等，1990,Biotechnol.8,926-928)。控制单位维持给进气体，流速为10L/分钟、pH为6.8、温度为26℃，且压力为0.15MPa。控制环保证了pO2为20％的需氧生长条件。整个发酵期间显示所有的重要物理量并记录之。
在分批补制期，培养物中的葡萄糖浓度保持在1.5g/L。为此目的使用改进的流动注射分析仪(配有光度计和检测控制单元的FIAstar 5020分析仪，Tecator AB,Sweden)。现有技术中描述了该系统的详细结构及其操作模式(如参见Pfaff等，1995，摘自Munack A.and SchügerlK(编者)生物技术中的计算机应用，Elsevier Science Ltd.,Oxford,6-11)。
测550nm波长的光密度以计算细胞密度。用Pack等人(1993)(文献同上)的方法确定质粒的稳定性。
实施例5使用Pack等人(1993)(文献同上)的方法定量检测合成的小抗体。以ELISA法测定功能性小抗体的量，并按照Laemmli(1970)所述，在12％聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS-PAGE，然后经凝胶扫描测定小抗体的总量。为进行ELISA，用人EGFR受体(例如参见WO92/15683)包被微量滴定板。用抗scFv425兔血清和过氧化物酶连接的羊抗兔IgG(Jackson Immunoresearch Inc.,USA)检测结合的小抗体。使用从纯化的小抗体制备的稀释系列计算活性小抗体的产率。在一对照组中，证明抗scFv425兔血清没有显示出与大肠杆菌RV308的无质粒粗提物的其他成分有任何可检查到的交叉反应。此外，向从纯化形式的同样抗体制备的稀释系列中加入该粗提物没有影响ELISA信号。为了检测小抗体的总量，以光度测量法检测用考马斯亮兰染色的凝胶，并基于从已在同样凝胶上分级分离的纯化小抗体制备的稀释系列计算小抗体的浓度。以其中使用不产生小抗体的大肠杆菌细胞的类似混合物作为对照。
权利要求
1．借助有分批发酵和分批补料阶段的高细胞密度发酵，在已用携带外来基因和可诱导启动子的质粒转化的大肠杆菌细胞中制备外源蛋白质的方法，其中没有底物或代谢副产物对生长的限制，并从培养基中分离和纯化所表达的蛋白质，使用连续的、自动或半自动分析法及加料系统控制分批补料期的底物浓度，其特征在于在分批补料期中，(ⅰ)培养基中碳源的浓度保持恒定在0.1g/L至25g/L范围内，同时维持细胞不受限制的生长(μ=μmax),(ⅱ)当细胞密度为10至80g/L时经诱导启动子在所说的分批补料期中开始外源蛋白质的产生，和(ⅲ)在已诱发产物合成后，持续地供入可利用的氮和磷酸盐，以及微量元素的盐，及(ⅳ)在整个分批补料期内，经以适当方式向发酵液内通入氧气而将pO2调整到5至25％。
2．根据权利要求1的方法，特征在于在分期补料期间使碳源的浓度稳定在1至3g/L范围。
3．根据权利要求1或2的方法，特征在于在细胞密度为50至80g/L时加入氮、磷酸盐和微量元素。
4．根据权利要求1至3中任一项的方法，特征在于根据权利要求1第(ⅱ)条的细胞密度为20至60g/L。
5．根据权利要求1至4中任一项的方法，特征在于在分批补料期细胞密度可达到100至150g/L。
6．根据权利要求1至5中任一项的方法，特征在于使用带表达盒的表达载体，其中所说的表达盒含有外来基因并且侧翼接有两个终止子序列。
7．根据权利要求6的方法，特征在于所使用的表达载体还另外含有自杀系统，最好是hok-sok自杀系统。
8．根据权利要求6或7的方法，特征在于使用编码抗体片段，特别是小抗体的外源基因。
9．根据权利要求1至4中任一项的方法，特征在于使用根据权利要求12-16中任一项的表达载体。
10．根据权利要求1至9中任一项的方法，特征在于发酵期使用培养基中乙酸盐积聚量不超过5g/L的大肠杆菌菌株。
11．根据权利要求10的方法，特征在于使用大肠杆菌菌株RV308(ATCC 31608)。
12．适于在高细胞密度发酵条件下表达外源蛋白质的大肠杆菌表达载体，特征在于其包含下列特征性部分(ⅰ)上游终止子序列和下游终止子序列，(ⅱ)lac启动子/操纵子系统，(ⅲ)T7g10 Shine Dalgarno序列，以及(ⅳ)pelB或ompA信号序列，以及(ⅴ)外源基因的序列。
13．根据权利要求12的载体，特征在于其另外还含有自杀系统，特别是hok-sok自杀系统序列。
14．根据权利要求12或13的载体，特征在于上游终止子序列是tHp，且下游终止子序列是tLpp。
15．根据权利要求12至14中任一项的载体，特征在于外源基因含有编码小抗体之VH链和VL链的序列。
16．根据图2中所示构建程序构建的称为pHKK的表达载体。
17．可用根据权利要求14的表达载体转化RV308(ATCC 31608)得到的被转化的大肠杆菌表达宿主RV308〔pHKK〕。
全文摘要
本发明涉及用大肠杆菌的宿主－载体系统有效地生成重组蛋白质,特别是重组抗体分子,最好是抗体片段如小抗体的补料分批发酵方法。在给定的条件下,大肠杆菌细胞能够以最大比生长速度生长至非常高的细胞密度。当重组产物生成开始时,只有所生成的产物以限制方式作用于生长。不发生因底物或代谢副产物造成的生长限制。因此,能在特定空间和时间内大量产生重组蛋白质。
文档编号C12P21/00GK1219203SQ96198949
公开日1999年6月9日 申请日期1996年11月28日 优先权日1995年12月11日
发明者W·斯特里特马特, S·马特兹库, D·里森伯格, U·霍恩, U·克努非尔, M·库加, R·温德斯, A·普鲁克图恩, A·克里博 申请人:默克专利股份有限公司