专利名称：酶活性的选择性灭活的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种灭活在包含所需酶的酶混合物中的一种或多种不需要的酶的方法。
背景技术：
现有技术已熟知在微生物以获得一种所需要的酶时，一种或多种不需要的酶通常也被该微生物表达，如果这些不需要的酶没有被有效地灭活，它们可能导致在所需酶的回收和/或所需酶的贮藏中的很大的稳定性问题。甚至即使这些其它酶不导致稳定性问题，由于产业上出于许多目的需要没有副活性的“纯”酶，因此它们可能的确是不希望的。
为了解决上述问题，已提出了许多建议Hoerle等在US 4,086,139中公开了使用次氯酸离子和亚氯酸离子来灭活淀粉酶-蛋白酶混合物中的淀粉酶；Bock等在DD 216 955中描述了通过加入尿素可将聚半乳糖醛酸酶从果胶酶混合物中除去，和Destefanis等在EP 021 179中公开了通过将体系的pH调节至5.0至7.0之间，用缓冲剂缓冲该混合物，并将所述混合物加热至40℃-75℃的温度可将蛋白酶-淀粉酶混合物中的芽孢杆菌属蛋白酶灭活。
本发明的一个目的是提供一种灭活酶混合物中不需要酶的方法，该方法应具有短的处理时间，产生高产率，并且同时应是简单，廉价和与工业需求相适应的。
发明概述已惊奇地发现通过使用本发明可有效地灭活许多不需要的酶。
因此，本发明涉及一种灭活包含一种所需酶的酶混合物中的至少一种不需要的酶的方法，包括步骤a)将混合物置于2℃-75℃的温度、pH小于5.0下至少20秒；和/或
b)将混合物置于2℃-75℃的温度、pH大于9.0下至少20秒。
附图简要说明通过参考附图进一步说明本发明，其中
图1表明在pH3.5和45℃(I)、50℃(II)、55℃(III)和70℃(IV)下，脂酶活性与灭活时间的函数关系，该实验如实施例1所描述的方法进行。
图2表明在pH3.5，45℃(I)、50℃(II)、55℃(III)和70℃(IV)下，蛋白酶活性与灭活时间的函数关系，该实验如实施例1所描述的方法进行。
图3表明未处理样品(I)和置于pH3.5、45℃下60分钟的样品(II)的稳定性试验，该实验如实施例1的描述的方法进行。
图4表明在pH3.5，45℃(I)、50℃(II)、55℃(III)，60℃(IV)和70℃(V)下，脂酶活性与灭活时间的函数关系，该实验如实施例2所描述的方法进行。
图5表明在pH3.5，45℃(I)、50℃(II)、55℃(III)、60℃(IV)和70℃(V)下，蛋白酶活性与灭活时间的函数关系，该实验如实施例2所描述的方法进行。
图6表明三种不同酶脂样品的稳定性试验在pH2.5，20℃下处理60分钟的样品(I)，在pH10.7，20℃下处理60分钟的样品(II)和未处理样品(III)，该实验如实施例3所描述的方法进行。
发明详述本发明涉及一种灭活包含一种所需酶的酶混合物中至少一种不需要的酶的方法，包括步骤a)将混合物置于2℃-75℃，pH小于5.0下至少20秒；和/或b)将混合物置于2℃-75℃，pH大于9.0下至少20秒。
我们在本发明中使用的原理是酶通常能耐酸性(pH小于5.0)或耐碱性环境(pH大于9.0)。我们将一事实与讨论的酶的温度耐受范围(2℃-75℃)和我们将酶混合物置于所述条件下的时间结合起来以获得最佳条件，其中保留了大部分所需酶，且大部分不需要的酶被灭活。这样该方法在三个参数可以变化的体系中进行pH、温度和放置时间。
在一些情况下，加入稳定剂可能是有利的，其中该稳定剂稳定所需的酶；该稳定剂应在使用本发明方法之前加入。该稳定剂的实例为所需酶的抑制剂、辅因子或底物现有技术已熟知当酶与抑制剂、辅因子或底物(如羧甲基纤维素(CMC))结合时，它变得更加稳定，实施例7中给出了其中使用CMC的一个实例。
在一些情况下，加入去稳定剂也可能是有利的，其中该去稳定剂使不需要的酶失稳定；该去稳定剂应在使用本发明方法之前加入。可用的去稳定剂可为络合剂，尤其是金属离子络合剂，如EDTA和EGTA。
而且，在一些情况下同时加入稳定所需酶的稳定剂和不需要的酶的去稳定剂可能是有利的。不需要的酶非常常见的一类不需要的酶是蛋白水解酶(蛋白酶，肽酶)，因为它们能降解蛋白质，并且由于酶是蛋白质，蛋白水解酶能降解所需要的酶。
然而，几乎所有从例如动物、植物或微生物获得的酶可能都是不需要的，因为工业上要求更为“纯”的酶或“单组分”酶，即除开所需要的外，任何酶活性都是不期望的。
这样不需要的酶可为任何酶，尤其是选自脂酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化还原酶、木聚糖酶、异构酶、肽酶和蛋白酶的酶。所需要的酶任何可从例如微生物、动物或植物获得的酶可能是所需要的。尤其优选选自脂酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化还原酶、木聚糖酶、异构酶、肽酶和蛋白酶的酶。
当所需要的酶可从微生物、动物或植物，尤其可从真菌，优选丝状真菌，如曲霉属，如米曲霉、黑曲霉或腐质霉属(Humicola)，如腐质霉H.insolens获得时，本发明的方法尤为有用。
尤其是当所需要的酶被克隆至丝状真菌，如曲霉属的种或腐质霉属的种时，目前存在一个去除不需要的酶(通常是少量蛋白酶活性)的问题。不需要的酶的存在量通常是极低的，常常用常规方法不能检测，但由于被克隆的酶对这些酶不适应，甚至是极少量的这些不需要的酶也使得被克隆(所需要)的酶不稳定。通过使用本发明的方法可以灭活极少量的这些蛋白水解活性，从而可获得具有极好的稳定性的产物(参见实施例1)。酶混合物本发明的方法可用于包含至少两种酶的任何酶混合物。当酶混合物为培养(＝发酵)液时，该方法尤为有用。
本发明的方法可用于未处理的培养液(全培养液)，被匀浆的培养液，或经过如用水稀释和/或一种或多种固体/液体分离技术例如絮凝作用、离心、过滤如转鼓真空过滤或压滤过滤、或膜分离、任选接着进行膜浓缩或蒸发处理的全或被匀浆的培养液。
根据本发明，可使用现有技术已知的任何膜装置来进行膜浓缩，但优选使用超滤技术，如空心丝、螺旋圆形或板框设备来进行膜浓缩。优选的截止值取决于所讨论的酶的特性，但通常优选间隔为1-100kD的截止值。
在根据本发明灭活不需要的酶活性之前，可以多种方式如使用过滤、层析法、吸附和/或沉淀/结晶法进一步纯化酶溶液。
如果所需要的酶极不稳定，最好在发酵之后，通常在过滤如离心或转鼓真空过滤之后尽快灭活不需要的酶。
如果所需要的酶较稳定，等待直至液被纯化和浓缩；通常在完成过滤和超滤之后再进行灭活可能是有利的。
在完成了根据本发明的灭活之后，以常规方法处理酶产物；即它可进一步以多种方法来进行纯化，如通过使用过滤、浓缩、层析法、吸附和/或沉淀/结晶法。
在一些情况下，不需要的酶仅仅被灭活，在另一些情况下，灭活并除去不需要的酶可能是有利的。除去不需要的酶一般通过固体/液体操作来进行。该方法的应用当有一种含所需要的酶及一种或多种不需要的酶的酶混合物时，可建议首先察看所需要酶的pH曲线，看它是否在碱侧或酸侧具有最佳值。如果所需要的酶在酸侧具有最佳值，这意味着在pH小于5.0时它一般不受损伤。因此推荐进行系列试验，该试验将各种pH值(如pH4.5，pH4.0，pH3.5)与各种温度值(如40℃，50℃，60℃，70℃)和各种放置时间(如1分种，5分钟，60分钟，240分钟)结合起来。通过进行该试验，可找到最佳条件，其中大部分所需要的酶被保留了且大部分不需要的酶被灭活。
优选将pH保持在为尽可能酸性或碱性，因此，根据本发明优选其中所述酶混合物被调节为pH小于4.5，尤其是pH小于4.0，特别是pH小于3.5，或其中所述酶混合物被调节为pH大于9.5，尤其是pH大于10.0的方法。
根据本发明，温度应保持在2-75℃之间，尤其是10-70℃之间，优选为25-65℃之间，更较为优选的是40-60℃之间。
根据本发明可首先调节pH，然后将溶液加热/冷却至所需温度(如实施例所述)，或首先将溶液加热/冷却至所需温度，然后调节pH(如实施例3所述)。
放置时间可为20秒至二周之间任何值，通常放置时间范围为1分钟至24小时之间，优选范围为1分钟至4小时之间。
取决于讨论的所需要和不需要的酶，指出多少不需要的酶应被灭活和多少所需要的酶应保留是非常困难的。通常优选在根据本发明的灭活作用后将不需要的酶降低至少于起始水平的15％的水平，尤其优选在根据本发明的灭活作用后降低至少于起始水平的10％的水平，甚至更优选在根据本发明的灭活作用后降低至少于起始水平的2％的水平，尤其优选在根据本发明的灭活作用后降低至少于起始水平的1％的水平。
一般来讲，仅仅最多灭活所需要的酶的一半是可被接受，因此，优选在根据本发明的灭活作用之后所需要的酶的水平大于起始水平的50％，尤其在根据本发明的灭活作用后大于起始水平的60％，优选在根据本发明的灭活作用后大于起始水平的60％，优选在根据本发明的灭活使用后大于起始水平的75％，甚至更优选在根据本发明的灭活作用后大于起始水平的85％。调节pH为了调节pH，实质上可使用任何酸或碱，酸可为无机或有机酸。一些实例为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、柠檬酸和甲酸。优选的酸为甲酸、柠檬酸和乙酸。优选的碱为氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化铵，尤其是氢氧化钠。
下面的实施例进一步说明本发明，但无意以任何方式限定所要求的本发明的范围。
在实施例中，酶活使用一种下面的分析法来测定脂酶活性的测定使用甘油三丁酸酯作为底物、阿拉伯树胶作为乳化剂分析实施例1、2、3、4和5中的脂酶活性。1LU(脂酶单位)为30℃、pH7.0下每分钟释放1μmol可滴定丁酸的酶量。使用Radiometer滴定仪VIT 90(Radiometer，Copenhagen)恒定pH来分析脂酶活性。蛋白酶活性的测定使用ala-ala-pro-phe-对硝基苯胺作为底物分析实施例1，2，3和8中的蛋白酶活性。当被水解时，对硝基苯胺(pNA)基团被释放，产生可在405nm用分光光度法测定的黄色。
反应条件为30℃、pH9.5，使用0.05M硼酸盐/KCl缓冲液，底物浓度为2.5mM pNA-肽。
用自动仪<Cobas>FARA测定405nm处吸光率随时间的变化，1单位活性(1U)定义为每分钟能水解1nmol pNA-肽的酶量。使用粘度计和CMC测定纤维素酶活性(内切葡聚糖酶活性)使用羧甲基纤维素CMC(Hercules 7 LFD)作为底物分析实施例7中的纤维素酶活性。当被水解时，保温混合物的粘度降低，并使用振动粘度计测定。40℃、pH＝9.0下在0.1M三羟甲基氨基甲烷中保温30分钟。使用MIVI 3000型振动棒状粘度计(Sofrase)测定粘度。使用IEF和CMC测定纤维素酶活性(内切葡聚糖酶活性)使用CMC加顶部琼脂层进行等电聚焦(IEF)，分析实施例6中的纤维素活性。对IEF，使用Pharmacia Ampholine PAGplate，pH3.5-9.5(编号80-1124-80)。
在tris马来酸缓冲液(pH＝7)中，使用0.5％CMC(Hercules 7LFD)+1％琼脂糖(Litex LSA)制备顶部琼脂。将悬浮液加热至沸点5分钟，然后冷却至55℃。
聚焦后，通过用tris马来酸缓冲液(pH＝7)连续冲洗1小时除去pH梯度。接着将顶部琼脂浇注在凝胶上，6小时后，45℃下进行鉴定，将0.1％刚果红的tris马来酸缓冲液(pH＝7)溶液倾倒在顶部琼脂上，此后放置10分钟并用1M NaCl水溶液脱色2×10分钟。
在红色背景中可见内切葡聚糖酶活性为一明亮的区带。在BioImage凝胶扫描仪上进行定量，被扫描的区带代表纤维素酶活性的量。使用IEF和酪蛋白测定蛋白酶活性使用酪蛋白加顶部琼脂层进行等电聚焦，分析实施例7中的蛋白酶活性。对IEF，使用Pharmacia Anpholine PAGplate，pH3.5-9.5(编号80-1124-80)。
使用1％酪蛋白+1％琼脂糖(Litex LSA)的tris马来酸缓冲液(pH＝7)的混合物制备顶部琼脂。将琼脂糖加热至沸点5分钟，此后冷却至55℃。聚焦后，通过用tris马来酸缓冲液(pH＝7)连续冲洗1小时除去pH梯度。在混合1体积1％酪蛋白和1体积1％琼脂糖后，接着将顶部琼脂浇注在凝胶上。
观察到的蛋白酶活性为被水解的酪蛋白的沉淀区带，在BioImage凝胶扫描仪上进行定量，被扫描的区带代表蛋白酶活性的量。实施例1蛋白酶的灭活本实施例描述了在低pH下灭活浓缩液中的不需要的蛋白酶而保留所需脂酶。
如WO 88/02775所述，通过将假丝酵母C.antarctica脂酶B克隆至米曲霉宿主中获得包含脂酶B的培养液，在所述培养液中不需要的蛋白酶用根据本发明的方法灭活。
首先，通过转鼓真空过滤培养液进行固/液分离。接着将转鼓真空过滤液在截止值为20kD的膜上进行UF-浓缩，使用10％磷酸将浓缩液pH调至3.5，并接着加热至45℃至70℃之间的各种温度(45℃(I)，50℃(II)，55℃(III)和70℃(IV))。
在0-60分钟之间的各种时间后，使用13％氢氧化钠将样品调至pH＝8.0，冷却并分析脂酶和蛋白酶活性。
所需脂酶活性的产率示于图1中，不需要的蛋白酶活性的灭活效率示于图2中。
可以看出45℃、pH＝3.5下处理60分钟提供了92％的剩余脂酶活性产率(图1)和小于2％的不需要蛋白酶活性(图2)。
在pH3.5、45℃下处理60分钟的样品中进行保留的脂酶活性在20℃下的稳定性试验。来自相同分批的处理(II)和未处理浓缩液(I)的稳定性示于图3中。该图表明被处理样品为100％稳定，而未处理样品不稳定并在贮藏仅4天后即丧失40％的起始活性。实施例2蛋白酶的灭活本实施例描述了在低pH灭活转鼓真空滤液中不需要的蛋白酶而保留所需的脂酶(培养液与实施例1中的相同)。由于所需脂酶的高度不稳定性，对转鼓真空滤液已进行了本发明的方法，而不是如实施例1所描述的在浓缩之后。
首先，通过转鼓真空过滤将培养液进行固/液分离。使用10％磷酸将转鼓真空滤液调至pH3.5，并接着加热至45℃-70℃之间的各种温度(45℃(I)，50℃(II)，55℃(III)，60℃(IV)和70℃(V))。
在0-60分钟之间的各种时间后，使用13％氢氧化钠将样品调至pH＝8.0，冷却并分析脂酶和蛋白酶活性。
所需脂酶活性的产率示于图4中，不需要的蛋白酶活性的灭活效率示于图5中。可以看出45℃、pH＝3.5下处理60分钟提供了86％的剩余脂酶活性和小于2％的不需要的蛋白酶活性。实施例3稳定性试验本实施例进一步描述在低pH下灭活转鼓真空滤液中不需要的蛋白酶而保留所需脂酶。
首先，通过转鼓真空过滤将培养液进行固/液分离。将转鼓真空滤液分成三个部分。将所有三个级分加热至20℃。使用20％磷酸将一个级分调节至pH2.5，使用17％氢氧化钠将第二个级分调节至pH10.7，第三个级分被当作未处理级分，被调节至pH＝5.5。
60分钟后，将低pH和高pH级分调至pH5.5(对于低pH级分，使用13％氢氧化钠，对于高pH级分使用20％磷酸)。在调节pH后，将样品冷却至5℃，并将所有级分在所述温度贮藏14天。在此方法中，在贮藏期间，所有级分均保存在pH＝5.5和5℃。在3、7、10和14天后从所有三个级分中取样并分析脂酶活性。
三个级分贮藏期间的稳定性示于图6中。可以看出均在20℃下，在pH＝2.5进行酸性处理60分钟(I)优于在pH＝10.7进行碱性处理60分钟(II)，因为酸性处理提供100％的稳定性，而碱性处理高度不稳定。对照表明未处理样品(III)也高度不稳定。
在使用本发明的方法处理后，pH3.5、20℃下被处理60分钟的样品为100％稳定。所需脂酶的产率为60％。实施例4淀粉酶的灭活本实施例描述了在低pH下灭活转鼓真空滤液中不需要的淀粉酶而保留所需纤维素酶。
如WO 91/17243所述，通过将腐质霉H.insolens纤维素酶克隆至米曲霉宿主中获得包含纤维素酶的培养液，在该培养液中，使用本发明的方法灭活不需要的淀粉酶。
通过离心将培养液进行固/液分离。接着使用截止值为20kD的膜将离心分离液进行超滤。将浓缩液迅速加热至70℃，并使用20％磷酸调至pH3.5，在所述温度和pH下静置1分钟。在所述静置时间后，用13％氢氧化钠将pH再调至pH7.0，并迅速冷却至40℃。
在此方法中，灭活了不需要的淀粉酶而完整保留了所需要的纤维素酶，见于下表1中，不需要的淀粉酶被100％灭活，而完整保留了96％的所需要的纤维素酶活性。
表1在低pH和高温下灭活来自脂酶/淀粉酶混合物的不需要的淀粉酶，而保留所需要的脂酶。实施例5淀粉酶的灭活本实施例描述了在高pH下灭活培养液中的不需要的淀粉酶，而保留所需要的脂酶。
如EP 305 16所述，通过将腐质霉H.lanuginosa脂酶克隆至米曲霉宿主获得包含脂酶的培养液。在该培养液中，通过使用本发明的方法灭活不所需要的淀粉酶。
将温度保持在35℃，并接着使用13％氢氧化钠将pH调至pH＝10.7，在所述pH下静置30分钟，从而灭活淀粉酶。接着通过过滤进行固/液分离来处理培养液以除去沉淀，而保留清亮滤液。随后使用13％氢氧化钠将pH调至pH＝8.0，将液体冷却至10℃。
通过使用该方法，有选择性地灭活了不需要的淀粉酶，而保留所需要的脂酶，可见于下表2中。在高pH处理期间，不需要的淀粉酶被完全灭活，而保留了所需要的脂酶。
表2.在高pH和中等温度下灭活来自脂酶/淀粉酶混合物的不需要的淀粉酶，而保留需要的脂酶。实施例6纤维素酶的灭活本实施例描述了在低pH和中等温度下灭活浓缩液中不需要的纤维素酶，而保留所需要的来自在腐质霉H.insolens的纤维素酶。
将如US 4,435,307中所描述获得的包含腐质霉H.insolens纤维素酶的培养液用于本发明的方法。
pI＝4.5的所需纤维素酶占整个纤维素酶活性的约25％。
首先，通过转鼓真空过滤将培养液进行固/液分离。接着将转鼓真空滤液在截止值为20kD的膜上进行UF浓缩。
将浓缩液调至20℃。随后使用20％磷酸将pH调至pH＝2.0，并在所述pH下静置60分钟。在所述静置时间后，使用13％氢氧化钠将pH调至pH＝8.0。
从表3看出，高于95％的不需要的纤维素酶活性被灭活，而完整保留了所需纤维素酶活性。
表3.在低pH和中等温度下灭活来自含一种需要的和几种不需要的纤维素酶混合物的不需要的纤维素酶，而完整保留所需要的纤维素酶。实施例7蛋白酶的灭活本实施例描述了在低pH和中等温度下灭活浓缩液中的不需要的蛋白酶，而保留来自腐质霉H.insolens的所需要的纤维素酶复合物。如实施例6中所见，完整的纤维素酶复合物在酸性条件下是不稳定的。因此本实施例包括针对所需完整的纤维素酶活性复合物使用稳定剂的实例。
将如US 4,435,307所描述而获得的包含腐质霉H.insolens纤维素酶的培养液用于本发明的方法。
首先，通过转鼓真空过滤将培养液进行固/液分离。接着将转鼓真空过滤滤液在截止值为20kD的膜上进行UF浓缩。
如表4所示，将浓缩液分为6等分。除一份外，所有级分中加入1％量的CMC以测定在灭活不需要的蛋白酶期间对所需纤维素酶的稳定效果。
在所有情况下均使用20％的磷酸以获得低的pH值，在所有情况下将它们在所述pH值下静置60分钟。在所述静置时间后，使用13％的氢氧化钠将所有情况下的pH调至pH＝8.0。
从表4看出，在灭活处理期间，CMC在pH＝3.0时的效果是提高纤维素酶产率。降低pH的效果是降低纤维素酶产率，但同时增加对不需要的蛋白酶的灭活效率。提高温度的效果是降低纤维素酶产率。
表4.在低pH和低温至中等温度下使用或不使用CMC灭活来自纤维素酶/蛋白酶混合物的不需要的蛋白酶，而保留所需要的纤维素酶。实施例8蛋白酶的灭活本实施例描述了在低pH下灭活浓缩液中不需要的蛋白酶，而保留所需要的过氧化氢酶。
将如WO 92/17571所述而获得的包含小柱孢菌(Scytalidiumtermophilum)的培养液用于本发明的方法。
如表5所述，将培养液进行絮凝作用
表5包含过氧化氢酶的液的絮凝。
接着通过转鼓真空过滤将经絮凝的液进行固/液分离。
将滤液分成2个级分A和B。将两个级分进行下表6所描述的处理。使用20％磷酸调节pH。
表6.对包含所需过氧化氢酶和不需要的蛋白酶的两种相同级分的处理。
将各级分处理0.5和1小时；在所述处理后，使用13％NaOH将各级分调至pH＝6.5，并冷却至10℃。
下表7说明被处理级分的过氧化氢酶和蛋白的酶产率。
使用过氧化氢的分解来测定过氧化氢酶活性。在规定H2O2浓度下的分光光度吸光率的规定的降低所需的时间是测定过氧化氢酶活性的一种方法。
使用前述的ala-ala-pro-phe-对硝基苯胺底物测定蛋白酶活性。
表7.所需要的过氧化氢酶和不需要的蛋白酶活性的产率可以看出40℃、pH＝2.5时对级分B处理30分钟提供了62％的剩余过氧化氢酶活性产率和小于1％的不需要的蛋白酶活性。对级分A的处理没有提供同样的蛋白酶的灭活。
权利要求
1.一种灭活包含所需要的酶的酶混合物中的至少一种不需要的酶的方法，包括步骤a)将混合物置于2℃-75℃的温度，pH小于5.0下至少20秒；和/或b)将混合物置于2℃-75℃的温度，pH大于9.0下至少20秒。
2.根据权利要求1的方法，其中不需要的酶选自蛋白酶、肽酶、淀粉酶、纤维素酶、脂酶、异构酶、氧化还原酶和木聚糖酶。
3.根据权利要求1的方法，其中所需要的酶选自脂酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化还原酶、木聚糖酶、异构酶、蛋白酶和肽酶。
4.根据权利要求1的方法，其中酶混合物是培养液，尤其是澄清的培养液。
5.根据权利要求4的方法，其中酶混合物为澄清和浓缩的培养液。
6.根据权利要求1的方法，其中酶由真菌产生，尤其是丝状真菌。
7.根据权利要求6的方法，其中酶由曲霉或腐质霉产生。
8.根据权利要求1的方法，其中所述酶混合物被调至pH小于4.5，尤其是pH小于4.0。
9.根据权利要求1的方法，其中所述酶混合物被调至pH大于9.5，尤其是pH大于10.0。
10.根据权利要求1的方法，其中所述酶混合物被置于2-75℃的温度范围内，尤其是10-70℃的范围内，优选25-65℃的范围内，更优选在40-60℃的范围内。
11.根据权利要求1的方法，其中在所述灭活作用后不需要的酶的水平小于起始水平的15％，尤其是在所述灭活作用后小于起始水平的2％。
12.根据权利要求1的方法，其中在所述灭活作用后所需要的酶的水平大于起始水平的50％，尤其是在所述灭活作用后大于起始水平的75％。
13.根据权利要求11和12的方法，其中在所述灭活作用后不需要的酶的水平小于起始水平的15％，尤其是在所述灭活作用后，小于起始水平的2％，并且在所述灭活作用后所需酶的水平大于起始水平的50％，尤其是在所述灭活作用后大于起始水平的75％。
14.根据权利要求1的方法，其中两种或多种酶是所需要的。
15.根据权利要求1的方法，其中在该方法前加入至少一种稳定剂。
16.根据权利要求1的方法，其中在该方法之前加入至少一种去稳定剂。
17.根据权利要求1的方法，其中在该方法前加入至少一种稳定所需要的酶的稳定剂和至少一种不需要的酶的去稳定剂。
18.可由根据权利要求1的方法获得的酶产品。
全文摘要
一种灭活包含所需要的酶的酶混合物中的至少一种不需要的酶的方法,它由改变pH、温度和放置时间而实现。
文档编号C12N9/99GK1203627SQ96198848
公开日1998年12月30日 申请日期1996年11月25日 优先权日1995年12月7日
发明者M·A·劳兹森, S·尼尔桑 申请人:诺沃挪第克公司