在重组含油微生物中表达油体钙蛋白以提高其中的油含量的制作方法
【专利摘要】本发明描述了由于油体钙蛋白多肽的表达而具有提高的油含量的重组含油微生物。本发明所公开的重组含油微生物产生占其细胞干重至少25%的油，并且包含功能性的多不饱和脂肪酸（PUFA）生物合成途径和至少一种编码油体钙蛋白多肽的遗传构建体。还描述了提高重组含油微生物中的油的量的方法。
【专利说明】在重组含油微生物中表达油体钙蛋白以提高其中的油含量[0001]本申请要求2011年5月26日提交的美国临时申请61/490，337的优先权，该申请全文以引用方式并入本文。【技术领域】[0002]本发明属于生物【技术领域】。更具体地，本发明涉及由于油体钙蛋白多肽的表达而能够产生更多的油的重组含油微生物。【背景技术】
[0003]微生物如丝状真菌、酵母和藻类产生多种脂质，包括脂肪酰、甘油脂、磷脂、鞘脂、 糖脂、聚酮化合物、留醇脂和孕烯醇酮脂类。通常从微生物中提取的一类脂质是甘油脂，包括脂肪酸甘油酯(“三酰基甘油”或“TAG”)。TAG是主要的脂肪酸储存单元，因此可含有长链多不饱和脂肪酸(PUFA)，以及较短的饱和的及不饱和的脂肪酸与较长链的饱和脂肪酸。对在药物和膳食产品中包括PUFA如二十碳五烯酸[“ΕΡΑ”;ω-3]和二十二碳六烯酸[“DHA”； ω-3]的兴趣一直在持续地增长。有效地并高性价比地产生包含PUFA的脂质组合物的方法因此是尤其期望的。[0004]有多种商品化的PUFA来源。然而，有多种与这些使用天然来源的生产方法相关联的缺点。第一，天然来源，例如鱼和植物，趋于具有高度异质性的油组成。从这些来源获得的油能够需要大量地纯化，以分离或富集一种或多种所期望的PUFA。鱼油通常具有令人不悦的嗅味，其可以是不能被经济地从所期望的产物分离的，并且能够导致此类产物不能作为食品补充剂被接受。令人不悦的嗅味能够使得基于高剂量的摄入的医疗规程不合乎期望， 并阻碍患者的依从性。[0005]鱼可积聚环境污染物，并且摄入鱼油胶囊作为饮食补充剂可导致摄入不合乎期望的污染物。PUFA的天然来源还受制于可用性的不可控的波动(例如，由于天气、疾病、或者就鱼类资源而言的过度捕捞)。同样，产生PUFA的作物与被开发用于产生食物的杂交体作物相比往往并不是在经济上有竞争力的。天然地产生PUFA的一些生物(例如，紫球藻 ^i(J}orphyridium)、^M^M(Jiortierella')')的大规模发酵还能够是昂贵的和/或难以以商业规模培养。由于这些限制，进行了大量用于开发能够高效地和以商业规模经济地产生PUFA的重组含油微生物的工作(例如，美国专利申请公布2005-0136519-A1)。此外， 还报道了在重组含油微生物中用以允许所期望的PUFA的产生的脂肪酸生物合成途径的修饰(例如，美国专利申请公布 2006-0110806-A1、2006-0115881-Al、2009-0093543-A1、和 2010-0317072-A1)。然而，仍然存在对具有相对于目前已知的菌株的油提高的油含量的重组含油微生物的需求。[0006]美国专利7，256，014公开了至少一种植物油质蛋白基因在被工程化以产生疏水的/亲脂的化合物(例如类胡萝卜素)的微生物细胞中的表达，显著提高了该化合物的总体滴度。[0007]Froissard等人(/--? Yeast Res.9:428-438, 2009)公开了用编码油体钙蛋白多肽(拟南芥iAa7ia/?a)油体钙蛋白l，AtClol)的异源性基因转化的非含油酵母啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae ),表现出脂质体数量和大小的提高并且比亲本菌株积聚了更多的脂肪酸。
[0008]然而，没有用编码油体钙蛋白多肽的基因转化重组含油微生物来提高此类重组微生物细胞的油含量的报道。
【发明内容】
[0009]在第一实施例中，本发明提供了重组含油微生物，该重组含油微生物产生占其细胞干重至少25%的油，并且该重 组含油微生物包含功能性的多不饱和脂肪酸生物合成途径和至少一种编码油体钙蛋白多肽的遗传构建体。在与由相应对照产生的油的量相比时，该实施例的重组含油微生物产生更大量的油，所述油包含至少一种多不饱和脂肪酸。
[0010]在第二实施例中，所述重组含油微生物可以是酵母、真菌、或藻类。在第三实施例中，所述重组含油微生物可以是解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)。
[0011]在第四实施例中，在由所述重组含油微生物产生的油中包含的多不饱和脂肪酸可以是ω-3多不饱和脂肪酸或ω-6多不饱和脂肪酸。在第五实施例中，所述ω-3多不饱和脂肪酸是二十碳五烯酸(ΕΡΑ)。
[0012]在第六实施例中，由遗传构建体编码的油体钙蛋白多肽具有的氨基酸序列基于Clustal W 比对方法与 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、38、40、42、或 51 具有至少 90% 的同一性。该实施例的油体钙蛋白多肽具有油体钙蛋白功能。
[0013]在第七实施例中，将由遗传构建体编码的油体钙蛋白多肽连接到催化二酰基甘油酰化的酶。在第八实施例中，催化二酰基甘油酰化的酶是磷脂:二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)。
[0014]在第九实施例中，相对于所述油体钙蛋白多肽的野生型氨基酸序列，所述油体钙蛋白多肽包含添加的半胱氨酸残基。所述添加的半胱氨酸残基能够散布在所述油体钙蛋白多肽的N末端和C末端区域内。
[0015]在第十实施例中，本发明提供了提高重组含油微生物中包含的油的量的方法，所述方法包括以下步骤:
a)提供本发明的重组含油微生物；
b)使步骤(a)的重组含油微生物在其中产生油的条件下生长，所述油包含至少一种多不饱和脂肪酸；以及
c)任选地,回收步骤(b)的油。
[0016]在所述方法的一个方面，所述重组含油微生物可以是酵母、真菌、或藻类。在另一方面，所述重组含油微生物可以是解脂耶氏酵母。
[0017]在所述方法的另一方面，在由所述重组含油微生物产生的油中包含的多不饱和脂肪酸可以是ω-3多不饱和脂肪酸或ω-6多不饱和脂肪酸。在另一方面，所述ω-3多不饱和脂肪酸是二十碳五烯酸(ΕΡΑ)。
[0018]在所述方法的又一个方面，由遗传构建体编码的油体钙蛋白多肽具有的氨基酸序列基于 Clustal W 比对方法与 SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、38、40、42、或51 具有至少 90%的同一性。该方面的油体钙蛋白多肽具有油体钙蛋白功能。[0019]【专利附图】
【附图说明】和序列表图1是PYRH55的质粒图谱，其被描述于本文的实例I中。[0020]图2显示了 AtClols和cys-AtClols的氨基酸序列之间的比对。添加至AtClols 以产生cys-AtClols的半胱氨酸残基带有下划线。[0021]表14
【权利要求】
1.重组含油微生物,所述重组含油微生物产生占其细胞干重至少25%的油，其中所述重组含油微生物包含功能性的多不饱和脂肪酸生物合成途径和至少一种编码油体钙蛋白多肽的遗传构建体； 进一步地，其中在与由相应对照产生的油的量相比时，所述重组含油微生物产生更大量的油，所述油包含至少一种多不饱和脂肪酸。
2.根据权利要求1所述的重组含油微生物，其中所述微生物选自酵母、真菌、和藻类。
3.根据权利要求1所述的重组含油微生物，其中所述微生物是解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica )。
4.根据权利要求1所述的重组含油微生物， 其中所述多不饱和脂肪酸选自ω-3多不饱和脂肪酸和ω-6多不饱和脂肪酸。
5.根据权利要求4所述的重组含油微生物，其中所述ω-3多不饱和脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA)。
6.根据权利要求1所述的重组含油微生物，其中所述油体钙蛋白多肽具有的氨基酸序列基于 Clustal W 比对方法与选自 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、38、40、42 和 51 的氨基酸序列具有至少90%的同一性，其中所述油体钙蛋白多肽具有油体钙蛋白功能。
7.根据权利要求1所述的重组含油微生物，其中将所述油体钙蛋白多肽连接到催化二酰基甘油酰化的酶。
8.根据权利要求7所述的重组含油微生物，其中所述酶是磷脂:二酰基甘油酰基转移BI(PDAT)0
9.根据权利要求1所述的重组含油微生物，其中相对于所述油体钙蛋白多肽的野生型氨基酸序列，所述油体钙蛋白多肽包含添加的半胱氨酸残基，其中所述添加的半胱氨酸残基散布在所述油体钙蛋白多肽的N末端和C末端区域内。
10.提高重组含油微生物中包含的油的量的方法，所述方法包括以下步骤: a)提供根据权利要求1所述的重组含油微生物； b)使步骤(a)的重组含油微生物在其中产生油的条件下生长，所述油包含至少一种多不饱和脂肪酸；以及 c)任选地，回收步骤(b)的油。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述重组含油微生物选自酵母、真菌、和藻类。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述微生物是解脂耶氏酵母。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述多不饱和脂肪酸选自ω-3多不饱和脂肪酸和ω-6多不饱和脂肪酸。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述ω-3多不饱和脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA)0
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述油体钙蛋白多肽具有的氨基酸序列基于Clustal W 比对方法与选自 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 和32的氨基酸序列具有至少90%的同一性，其中所述油体钙蛋白多肽具有油体钙蛋白功能。
【文档编号】C07K14/37GK103562217SQ201280025445
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年5月23日 优先权日:2011年5月26日
【发明者】S-P.洪, Q.Q.朱 申请人:纳幕尔杜邦公司