多亚基蛋白质例如抗体在转化的微生物例如巴斯德毕赤酵母中的高纯度产生的制作方法

多亚基蛋白质例如抗体在转化的微生物例如巴斯德毕赤酵母中的高纯度产生的制作方法
【专利摘要】公开了用于在转化的细胞中产生异源多亚基蛋白质的方法。具体地，本公开提供了以更高的产率和减少的非所需副产物产量产生多亚基蛋白质的改进方法，所述多亚基蛋白质包括可能会或可能不会被分泌出的抗体和其它多亚基蛋白质。在示例性实施方案中，转化的细胞为酵母，例如甲醇营养型酵母如巴斯德毕赤酵母。
【专利说明】多亚基蛋白质例如抗体在转化的微生物例如巴斯德毕赤酵母中的高纯度产生
[0001]相关申请公开
[0002]本申请要求2011年8月19日提交的美国临时申请序列号61/525，307 (代理人案卷号 67858.730200)(标题为 “MULT1-COPY STRATEGY FOR HIGH-TITER AND HIGH-PURITYPRODUCTION OF MULT1-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBESSUCH AS PICHIA PAST0RIS”、2011年5月20日提交的美国临时申请序列号61/488，660 (代理人案卷号 67858.730300)(标题为“ANT1-CGRP COMPOSITIONS AND USE THEREOF”)、2011年6月14日提交的美国临时申请序列号61/496，860(代理人案卷号67858.760000)(标题为 “USE OF ANT1-CGRP ANTIBODIES AND ANTIBODY FRAGMENTS TO PREVENT OR INHIBITPHOTOPHOBIA IN SUBJECTS IN NEED THEREOF, ESPECIALLY MIGRAINE SUFFERERS”)和 2011年6月14日提交的美国临时申请序列号61/496，873(代理人案卷号67858.770000)(标题为 “USE OF ANT1-CGRP ANTIBODIES AND ANTIBODY FRAGMENTS TO TREAT DIARRHEA INSUBJECTS WITH DISEASES OR TREATMENTS THAT RESULT IN ELEVATED CGRP LEVELS”)的权益，这些美国临时申请的每一个通过引用整体并入本文。
[0003]本申请包括通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，该序列表创建于2012年5月8日，文件名为“67858o711002.txt”，大小为315，392字节，所述序列表通过引用整体并入本文。
[0004]领域
[0005]本公开总体上涉及用于在转化的细胞中产生异源蛋白质的方法。具体地，本公开提供了产生多亚基蛋白质包括抗体和其它多亚基蛋白质的改进方法，所述蛋白质可以是分泌的或可以不是分泌的，具有减少的非所需副产物的产量和/或增加的产率。在示例性实施方案中，转化的细胞是酵母`，例如巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母。
[0006]背景
[0007]常规抗体是由两个相同的轻链和两个相同的重链组成的四聚体蛋白质。对于许多目的，可能难以或不可能以充足的量从天然来源纯化特定类型的纯的人抗体。因此，生物技术和制药公司已转向基于重组DNA的方法来大规模制备抗体。功能性抗体的产生通常不仅包括两个多肽的合成而且还包括许多翻译后事件，包括N末端分泌信号序列的蛋白酶解加工；多肽至四聚体的正确折叠和装配；二硫键的形成；和通常包括特定N联接的糖基化。所有这些事件在真核细胞分泌途径(对于真核细胞是独特的细胞器复合物)中发生。
[0008]此类复合蛋白质的重组合成通常依赖于高等真核细胞的培养来产生具有生物活性的物质，培养的哺乳动物细胞是很常用的。然而，基于哺乳动物组织培养的产生系统相对于微生物发酵法引起显著增加的费用和并发症。此外，来源于哺乳动物细胞培养的产物可能需要另外的安全性测试来确保不含可能存在于培养细胞或用于培养的动物来源的产品例如血清中的哺乳动物病原体(包括病毒)。
[0009]现有工作帮助将酵母巴斯德毕赤酵母建立为用于产生功能性抗体的具有成本效益的平台，所述平台潜在地适用于研究、诊断和治疗用途。参见共同拥有的美国专利7，935，340和7，927，863，所述美国专利的每一个通过引用整体并入本文。用于用于表达重组蛋白质的巴斯德毕赤酵母发酵的设计和最优化(包括细胞密度、液体培养基体积、底物进料速度以及反应的每一个时期的长度的最优化)的方法在文献中也是已知的。参见 Zhang 等，“Rational Design and Optimization of Fed-Batch and ContinuousFermentations，，in Cregg, J.M., Ed., 2007, Pichia Protocols (第 2 版),Methods inMolecular Biology,第 389 卷,Humana Press, Totowa, N.J.,第 43-63 页。
[0010]尽管可从培养细胞产生重组多亚基蛋白质，还可产生非所需副产物。例如，培养细胞可产生连同游离单体、具有不正确的化学计量的复合物或具有不期望的或异常的糖基化的蛋白质一起的期望的多亚基蛋白质。期望的多亚基蛋白质的纯化可增加生产成本，并且参与纯化的步骤可减少活性复合物的总产率。此外，即使在纯化后，非所需副产物可以以引起关注的量存在。例如，糖基化副产物可以以在施用后增加免疫反应的风险的量存在，然而异常复合物或聚集体可减小特异性活性并且还可潜在具有免疫原性。
[0011]概述
[0012]大多数IgGl抗体分子通过总共16个链内和链间二硫键来稳定。链内二硫键稳定IgG结构域在重链和轻链中的折叠，然而链间二硫键使重链与轻链之间的结合稳定。由于这些键，抗体形成包含两个重链和两个轻链(H2L2)的稳定复合物。然而，由于不正确的二硫键形成，有时在重组抗体制剂中发现产物相关变体，包括具有一个轻链和一个重链的复合物(HlLl)和具有两个重链和一个轻链的复合物(H2L1)。此外，还可形成其中形成额外的链间二硫键(从而导致更多数目的共价连接的亚基)的更高级的复合物。
[0013]如下文中进一步描述的， 申请人:现已确立了在从酵母培养物重组产生抗体的过程中减少这些包含异常二硫键的复合物的产生的方法。具体地，所述方法包括将大剂量乙醇添加至培养物中，从而导致减少的H1L1、H2L1和H4L4产物相关变体的产生以及增加的期望的H2L2产物的纯度。HlLl和H2L1复合物可通过非还原变性SDS-PAGE来检测，H4L4复合物可通过尺寸排阻色谱法来`检测。通过使用主题方法，可促进适当的二硫键形成，从而导致增加的抗体纯度。这在3种不同的抗体中得以证明，当在添加大剂量乙醇的情况下产生时，所述三种抗体全都显示改善的纯度(图1-6)。这三种抗体不仅在序列上不同而且识别3种不同的抗原。此外，当在所述大剂量乙醇不存在的情况下，相较于第三抗体(图5)，所述抗体中的两种包含更大量的HlLl产物(图1-4)。两种包含更大量的HlLl产物的抗体具有非经典的或额外的二硫键，然而第3种抗体不具有非经典的或额外的二硫键。图1、2和3中例举的抗体在可变轻链结构域中具有额外的链内二硫键，然而图4中例举的抗体在其重链中具有额外的链内二硫键。文献中已报导过表达的蛋白质中二硫键的存在增加宿主的细胞内应激(参见 Gasser 等，Biotechnology and Bioengineering,第 94 卷，N0.2，第 353-61页，2006 年 6 月 5 日；Inan 等，Biotechnology And Bioengineering,第 93 卷，N0.4,第771-78 页，2006 年 3 月 5 日；Li 等，Biochem Biophys Res Commun.2010 年 11 月 19 日；402(3):519 - 524)。该增加的应激还可导致更低的活力，如图11、12和13中显示的，其中具有额外链内二硫键的两种抗体在“无大剂量”条件下具有更低的活力。大剂量乙醇的添加从而导致增加的活力和增加的纯度。这可以是有用的，特别是在难以表达多个二硫键要表达的蛋白质时。
[0014]在一个方面，本公开提供了产生多亚基复合物的方法，包括:(a)提供包含含有提供所述多亚基复合物的亚基的表达的基因的真核细胞的培养物；(b)将大剂量的乙醇添加至所述培养物；和(C)培养所述培养物以产生所述多亚基复合物。
[0015]大剂量乙醇相对于在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的所述相同方法增加稳定的二硫键的形成。
[0016]所述多亚基复合物可包含一个或多个包含至少一个二硫键的多肽。
[0017]所述多亚基复合物包含抗体。
[0018]所述方法相对于在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的所述相同方法可降低一种或多种产物相关变体的相对丰度。
[0019]所述方法相对于在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的所述相同方法可降低产物相关变体的相对丰度，所述变体具有比所述期望的多亚基复合物更高或更低的表观分子量，如通过尺寸排阻色谱法或凝胶电泳所检测的。
[0020]所述方法相对于在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的所述相同方法可降低具有异常化学计量的复合物的相对丰度。
[0021]所述方法相对于在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的所述相同方法可降低具有异常二硫键的复合物的相对丰度。
[0022]所述方法相对于在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的所述相同方法可降低具有降低的半胱氨酸的复合物的相对丰度。
[0023]所述方法相对于 在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的所述相同方法可降低具有异常糖基化的复合物的相对丰度。
[0024]所述方法可调节重链间二硫键的形成或稳定性。
[0025]所述方法可调节连接轻链与重链的二硫键的形成或稳定性。
[0026]所述方法相对于在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的方法可降低一种或多种产物相关变体的相对丰度。
[0027]所述产物相关变体包括H1L1、H2L1和H4L4产物相关变体的一种或多种。
[0028]所述方法相对于在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的所述相同方法增加所述抗体的纯度。
[0029]可在步骤(C)之前进行步骤(b)。
[0030]可在步骤(C)后进行步骤(b)。
[0031]可同时进行步骤(b)与步骤(C)。
[0032]步骤(b)可导致所述培养物中的乙醇浓度在约0.01%与约4% (w/v)之间。
[0033]步骤(b)可导致所述培养物中的乙醇浓度为约0.01%与约4%之间、约0.02%与约3.75%之间、约0.04%与约3.5%之间、约0.08%与约3.25%之间、约0.1%与约3%之间、约0.2%与约2.75%之间、约0.3%与约2.5%之间、约0.4%与约2.25%之间、约0.5%与约
1.5%之间、约0.5%与约2%之间、约0.6%与约1.75%之间、约0.7%与约1.5%或约0.8%与约1.25%之间。
[0034]步骤(b)可导致所述培养物中的乙醇浓度可为至少约0.01%、0.02%、0.03%、
0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.10%、0.2%、0.3%、0.4%、0.6%、0.6%、0.7%、0.8%
或 0.9% (w/V)
[0035]步骤(b)可导致所述培养物中的乙醇浓度可为至多约4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.8%、1.6%、1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、1.1%、1.0%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.35%、0.3%、0.25%、0.2% 或 0.15% (w/v)。
[0036]步骤(b)可包括将乙醇添加至所述培养物，将包含乙醇的载体添加至所述培养物，将所述细胞添加至培养基或包含乙醇的载体，或替换部分所述培养基。
[0037]在I至20分钟的时间段内将所述大剂量乙醇添加至培养基。
[0038]步骤(C)可包括给所述细胞提供氧。
[0039]所述提供氧包括搅拌所述培养物。
[0040]所述提供氧包括将所述培养物与包含氧的气体混合物接触。
[0041]步骤(C)可包括将含有碳源的进料添加至所述培养物。
[0042]所述进料包含至少一种可发酵碳源。
[0043]所述进料包含葡萄糖、乙醇、柠檬酸盐、山梨醇、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、蜜二糖、乳糖、麦芽糖、鼠李糖、核糖、甘露糖、甘露醇和棉子糖的一种或多种。
[0044]所述方法还可在步骤(C)期间将乙醇的浓度维持在上设置点与下设置点之间。
[0045]所述下设置点为约0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、
0.09%、0.10%、0.2%、0.3%、0.4%、0.6%、0.6%、0.7%、0.8% 或 0.9% (w/v)。
[0046]所述上设置点为 约4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.8%、1.6%、1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、
1.1%、1.0%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.35%,0.3%、0.25%,0.2% 或 0.15%(w/v)。
[0047]所述上设置点至多为约L 5%、L 4%、L 3、I.2%或I.1% (w/v)。
[0048]所述方法还可包括在步骤(C)期间将乙醇浓度维持在设置点。
[0049]所述设置点为约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、01.%、
01.1%、01.2%、01.3%、01.4% 或 01.5% (w/v)。
[0050]步骤(c)可包括将所述培养物中的乙醇浓度维持在约0.01%与约4%之间、约
0.02%与约3.75%之间、约0.04%与约3.5%之间、约0.08%与约3.25%之间、约0.1%与约3%之间、约0.2%与约2.75%之间、约0.3%与约2.5%之间、约0.4%与约2.25%之间、约0.5%与约2%之间、约0.6%与约1.75%之间、约0.7%与约1.5%或约0.8%与约1.25%之间。
[0051]所述培养物中的乙醇浓度通过控制由所述细胞进行的乙醇产生或通过将乙醇添加至所述培养物来维持。
[0052]控制乙醇产生的步骤可包括控制葡萄糖的浓度、氧的可用度、搅拌的强度、气压、供应的空气或其它气体混合物的流速、培养物粘度、培养物密度、供应的空气或其它气体混合物中氧的浓度以及温度的一项或多项。
[0053]步骤(a)与步骤(b)之间的时间可少于约72小时、少于约48小时、少于约24小时、少于约12小时、少于约9小时、少于约6小时、少于约5小时、少于约4小时、少于约3小时、少于约90分钟、少于约30分钟、少于约5分钟或少于约I分钟。
[0054]步骤(b)与步骤(C)之间的时间少于约10小时、少于约9小时、少于约8小时、少于约7小时、少于约6小时、少于约5小时、少于约4小时、少于约3小时、少于约2小时、少于约90分钟、少于约80分钟、少于约70分钟、少于约60分钟、少于约50分钟、少于约40分钟、少于约30分钟、少于约20分钟、少于约10分钟、少于约5分钟或少于约I分钟。
[0055]步骤(a)的培养物通过向所述培养物添加碳源，以及培养所述培养物直至碳源可被耗尽来产生。[0056]所述碳源包括甘油、葡萄糖、乙醇、柠檬酸盐、山梨醇、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、蜜二糖、乳糖、麦芽糖、鼠李糖、核糖、甘露糖、甘露醇和棉子糖的一种或多种。
[0057]碳源的耗尽通过检测所述真核细胞的代谢活动的减弱来测定。
[0058]所述真核细胞的代谢活动的所述减弱可通过检测所述真核细胞对氧的消耗的减少，通过检测培养物的pH的升高，通过检测湿细胞团的稳定化，或通过检测培养物中的氨浓度的增加来鉴定。
[0059]所述真核细胞对氧的消耗的所述减少可通过检测所述培养物中溶解氧的浓度的增加来鉴定。
[0060]所述真核细胞可包括酵母细胞。
[0061]所述酵母细胞可包括甲醇营养型酵母。 [0062]所述甲醇营养型酵母可属于毕赤酵母属。
[0063]毕赤酵母属的所述甲醇营养型酵母是巴斯德毕赤酵母。
[0064]毕赤酵母属的所述甲醇营养型酵母选自:安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、季也蒙毕赤氏酵母(Pichia guiIIermordii)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)和因诺托毕赤氏酵母(Pichia inositovera)。
[0065]提供所述多亚基复合物的表达的基因被整合到一个或多个基因组基因座中。
[0066]所述基因组基因座的至少一个选自pGAP基因座、3’A0X TT基因座、PpURA5、0CHl、A0Xl、HIS4、GAP、pGAP、3’ AOX TT、ARG 和 HIS4TT 基因座。
[0067]可在诱导型或组成型启动子的控制下表达编码多亚基复合物的所述亚基的基因中的至少一个。
[0068]所述诱导型启动子选自A0XUCUP1、四环素诱导型启动子、硫胺酸诱导型启动子以及FLDl启动子。
[0069]可在选自以下的启动子的控制下表达编码所述多亚基复合物的所述亚基的基因中的至少一个:CUP1、AOXl、ICLl、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)、FLDl、ADHl、醇脱氢酶I1、GAL4、PH03、PH05以及Pyk启动子、四环素诱导型启动子、硫胺素诱导型启动子、来源于其的嵌合启动子、酵母启动子、哺乳动物启动子、昆虫启动子、植物启动子、爬行动物启动子、两栖动物启动子、病毒启动子和禽类启动子。
[0070]所述真核细胞可以是二倍体、四倍体细胞或多倍体。
[0071]所述方法还可包括从所述真核细胞或从培养基纯化所述多亚基复合物。
[0072]可从所述真核细胞的细胞内组分、细胞质、核质或膜纯化所述多亚基复合物。
[0073]所述真核细胞可分泌所述多亚基复合物至培养基中。
[0074]可从所述培养基纯化所述多亚基复合物。
[0075]所述多亚基复合物可包括单特异性或双特异性抗体。
[0076]所述多亚基复合物可包括人抗体或人源化抗体或其片段。
[0077]所述人源化抗体可具有小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊或牛来源。
[0078]所述人源化抗体可具有兔来源。
[0079]所述多亚基复合物可包括单价、双价或多价抗体。
[0080]可通过蛋白A和/或蛋白G亲和从所述培养物纯化所述抗体。
[0081]可最优化基因的至少一个以在所述真核细胞中表达，所述基因在所述小组的所述真核细胞的至少一个中提供所述多亚基复合物的亚基的表达。
[0082]所述多亚基复合物可包括抗体并且所述抗体的纯度可通过测量由所述真核细胞产生的抗体的分数来评估，所述抗体可包含在具有预期的表观流体力学半径的抗体复合物中，可包含在具有预期的分子量的抗体复合物中，和/或特异性结合所述抗体的靶。
[0083]所述多亚基复合物可包括抗体并且所述抗体的产量可通过测定扣除任何产物相关变体的由所述真核细胞产生的抗体的量来评估，所述变体可被异常糖基化，包含在抗体复合物中而非具有预期的表观流体力学半径的复合物中，包含在具有预期的分子量的抗体复合物中，和/或不能特异性结合所述抗体的靶。
[0084]所述抗体复合物的分子量可通过非还原SDS-PAGE来测定。
[0085]所述多亚基复合物可包括抗体，所述方法还可包括纯化所述抗体。
[0086]所述培养细胞产生至少100mg/L、至少150mg/L、至少200mg/L、至少250mg/L、至少300mg/L、100 至 300mg/L、100 至 500mg/L、100 至 1000mg/L、至少 1000mg/L、至少 1250mg/L、至少1500mg/L、至少约1750mg/L、至少约2000mg/L、至少约10000mg/L或更多的上清液抗体滴度。
[0087]所述多亚基复合物的一个或多个亚基可从超过一个基因拷贝表达。
[0088]所述多亚基复合物可包括抗体，所述抗体可从1-10个拷贝的编码所述抗体的轻链的基因和从1-10个拷贝的编码所述抗体的重链的基因表达。
[0089]可将提供所述多亚基复合物的表达的基因整合到所述细胞的基因组中。
[0090]提供所述多亚基`复合物的表达的基因可包含在染色体外元件、质粒或人工染色体中。
[0091]所述细胞可包含比提供所述抗体的重链的表达的基因的拷贝更多的提供所述抗体的轻链的表达的基因的拷贝。
[0092]所述细胞中编码所述抗体的重链的基因的拷贝数和编码所述抗体的轻链的基因拷贝数分别为:2和2、2和3、3和3、3和4、3和5、4和3、4和4、4和5、4和6、5和4、5和
5、5和6或5和7。
[0093]所述细胞中的编码所述抗体的重链的基因的拷贝数和编码所述抗体的轻链的基因的拷贝数分别为:2和1、3和1、4和1、5和1、6和1、7和1、8和1、9和1、10和1、1和2、2和2、3和2、4和2、5和2、6和2、7和2、8和2、9和2、10和2、1和3、2和3、3和3、4和
3、5和 3、6 和 3、7 和 3、8 和 3、9 和 3、10 和 3、I 和 4、2 和 4、3 和 4、4 和 4、5 和 4、6 和 4、7 和
4、8和 4、9 和 4、10 和 4、1 和 5、2 和 5、3 和 5、4 和 5、5 和 5、6 和 5、7 和 5、8 和 5、9 和 5、10和 5、1 和 6、2 和 6、3 和 6、4 和 6、5 和 6、6 和 6、7 和 6、8 和 6、9 和 6、10 和 6、1 和 7、2 和 7、3和 7、4 和 7、5 和 7、6 和 7、7 和 7、8 和 7、9 和 7、10 和 7、1 和 8、2 和 8、3 和 8、4 和 8、5 和 8、6和8、7和8、8和8、9和8、10和8、1和9、2和9、3和9、4和9、5和9、6和9、7和9、8和9、9 和 9、10 和 9、1 和 10、2 和 10、3 和 10、4 和 10、5 和 10、6 和 10、7 和 10、8 和 10、9 和 10,10和10。
[0094]可使步骤(C)的培养物在生产培养基中生长。
[0095]所述生产培养基可以是基本培养基。
[0096]所述基本培养基不存在选择剂。
[0097]所述基本培养基不存在预形成的氨基酸或其它复合生物分子。[0098]所述生产培养基可以是复合培养基。
[0099]所述复合培养基可包含酵母提取物、大豆蛋白胨和其它植物蛋白胨的一种或多种。
[0100]可使步骤(C)的培养物生长至高细胞密度。
[0101]所述高细胞密度可以为至少50g/L。
[0102]所述高细胞密度可以为至少100g/L。
[0103]所述高细胞密度可以为至少300g/L。
[0104]所述高细胞密度可以为至少400g/L。
[0105]所述高细胞密度可以为至少500g/L。
[0106]所述高细胞密度可以为至少750g/L。
[0107]可将酵母细胞培养至少20个倍增，并且在至少20个倍增后维持所述多亚基复合物的高水平表达。
[0108]可将所述步骤(C)的细胞培养至少50个倍增并且在所述至少50个倍增后维持所述多亚基复合物的高水平表达。
[0109]可将所述步骤(C )的细胞培养至少100个倍增并且在所述至少100个倍增后维持所述多亚基复合物的高水平表达。
[0110]所述多亚基复合物的至少一个亚基可包含分泌信号。
[0111]所述多亚基复合物可包含抗体。
[0112]分泌信号可包含一种或多种选自:SEQ ID NOS:414至437及其任何组合的多肽。
[0113]所述多亚基复合物可以不是2010年12月I日提交的美国临时申请号61/418，832,2011年12月I日提交的PCT/US11/62963、2011年12月I日提交的美国序列号13/309，295,2011年12月I日提交的美国序列号13/309，153,2011年12月I日提交的美国序列号13/308，665和2011年12月I日提交的美国序列号13/308，831中公开的抗体的任一种。
[0114]所述多亚基复合物可以不是Abl-NGF、Ab2_NGF、Ab3_NGF、Ab4_NGF、Ab5_NGF、Ab6-NGF、Ab7-NGF、Ab8-NGF、Ab9-NGF、Abl0-NGF、Abll-NGF、Abl2-NGF、Abl3-NGF、Abl4-NGF、Abl5-NGF、Abl6-NGF、Abl7_NGF、Abl8_NGF、Abl9_NGF、Ab20_NGF 和 Ab21_NGF 或 Fab2 或其Fabl片段。
[0115]所述多亚基复合物可以不包含下列抗体的任一种中包含的互补性决定区(OTR)的至少I个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少全部6个:Abl-NGF、Ab2-NGF、Ab3-NGF、Ab4-NGF、Ab5_NGF、Ab6_NGF、Ab7_NGF、Ab8_NGF、Ab9_NGF、Ab IO-NGF, Ab 11-NGF,Abl2-NGF、Abl3-NGF、Abl4_NGF、Abl5_NGF、Abl6_NGF、Abl7_NGF、Abl8_NGF、Abl9_NGF、Ab20-NGF或Ab21-NGF，并且所述抗体任选地具有对于NGF的结合特异性。
[0116]所述多亚基复合物可以不包含如下序列或不由所述序列组成:分别地SEQ IDNO: 51和401的轻链和重链多肽序列、分别地SEQ ID NO: 53和402的轻链和重链多肽序列、分别地SEQ ID NO:405和406的轻链和重链多肽序列和分别地SEQ ID NO:407和408的轻链和重链多肽序列。
[0117]所述多亚基复合物可以不包含抗体，所述抗体含有SEQ ID N0:55、56、57、58、59和60的⑶R的至少I个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少全部6个的抗体,并且任选地具有对于NGF的结合特异性。
[0118]所述多亚基复合物可以不包含本文中在标题为“抗-NGF抗体及其具有对于NGF的结合活性的结合片段”和“编码抗-NGF抗体多肽的多核苷酸”的部分中公开的抗体或抗体编码序列的任一种。在一个方面，本公开提供了产生多亚基复合物的方法，所述方法可包括:培养宿主细胞，提供包含表达所述多亚基复合物的真核细胞的培养物，将大剂量乙醇添加至所述培养物，以及培养所述培养物以产生所述多亚基复合物。多亚基复合物可包含一个或多个二硫键，并且可以是抗体。
[0119]乙醇大剂量浓度(表示为％w/v)可以在约0.1%与约5%之间，例如至少约0.1%、至少约0.2%、至少约0.3%、至少约0.4%、至少约0.5%、至少约0.6%、至少约0.7%、至少约0.8%、至少约0.9%、至少约1%、闻达约1%、闻达约1.1%、闻达约1.2%、闻达约1.3%、闻达约1.4%、闻达约1.5%、闻达约1.6%、闻达约1.7%、闻达约1.8%、闻达约1.9%、闻达约2%、闻达约3%、闻达约4%或高达约5%，例如在约0.1%与约1.9%之间、约0.2%与约1.8%之间、约0.3%与约
1.7%之间、约0.4%与约1.6%之间、约0.5%与约1.5%之间、约0.6%与约1.4%之间、约0.7%与约1.3%之间、约0.8%与约1.2%之间或约0.9%与约1.1%之间，例如约0.1%、约0.2%、约0.3%、约 0.4%、约 0.5%、约 0.6%、约 0.7%、约 0.8%、约 0.9%、约 1%、约 1.1%、约 1.2%、约 1.3%、约 1.4%、约 1.5%、约 1.6%、约 1.7%、约 1.8%、约 1.9%、约 2%、约 2.5%、约 3%、约 4% 或约 5%。
[0120]所述方法还可包括所述期望的多亚基复合物的纯化。
[0121]在示例性实施方案中，可在添加大剂量乙醇后控制乙醇浓度，这可用于将乙醇浓度维持在期望的设置点或期望的设置点范围内。设置点(表示为％w/v)可以在约0.1%与约4%之间、至少约0.01%、至少约0.02%、至少约0.04%、至少约0.06%、至少约0.08%、至少约0.1%、至少约0.15%、至少约0.2%、至少约0.25%、至少约0.3%、至少约0.35%、至少约0.4%、至少约0.45%、至少约`0.5%、至少约0.6%、至少约0.7%、至少约0.8%、至少约0.9%、至少约1%、至少约1.2%、至少约1.4%、至少约1.6%、至少约1.8%、至少约2%、高达约4%、高达约3.75%、高达约3.5%、高达约3.25%、高达约3%、高达约2.75%、高达约2.5%、高达约2.25%、高达约2%、高达约1.75%、高达约1.5%、高达约1.25%、高达约1%、约0.01%与约4%之间、约0.02%与约3.75%之间、约0.04%与约3.5%之间、约0.08%与约3.25%之间、约0.1%与约3%之间、约0.2%与约2.75%之间、约0.3%与约2.5%之间、约0.4%与约2.25%之间、约0.5%与约2%之间、约0.6%与约1.75%之间、约0.7%与约1.5%之间或约0.8%与约1.25%之间。例如，设置点可与大剂量浓度相同或在大剂量浓度的正负1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%, 45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% 内。
[0122]可通过在发酵过程中控制酵母细胞的乙醇产生来维持乙醇浓度设置点。例如，可通过增加葡萄糖的浓度(例如，增加葡萄糖进料速度)、减少氧的可用度，通过减少搅拌的强度(例如，降低发酵罐输入功率)、减少发酵罐中的气压、减少供应的空气或其它气体混合物的流速、增加培养物的粘性或减少供应空气或其它气体混合物中氧的浓度(例如，如果将使用氧补充的话)来增加乙醇浓度。还可通过增加发酵温度来增加乙醇产生。同样地，可通过减少葡萄糖浓度(例如，减少葡萄糖进料速率)，通过增加氧的可用度，通过增加搅拌的强度(例如，增加发酵罐输入功率)、增加发酵罐中的气压、增加减少供应的空气或其它气体混合物的流速、减小培养物的粘性或增加供应空气或其它气体混合物中氧的浓度(例如，如果将使用氧补充的话)来增加乙醇浓度。还可通过降低发酵温度来增加乙醇产生。
[0123]通过使用本公开内容的方法，相对于常规方法，可将非所需副产物的相对丰度相较于初始丰度水平降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或降至不可检测
的水平。可这样降低其相对丰度的示例性非所需副产物可包括一个或多个具有与期望的多亚基复合物不同的表观分子量的种类。例如，表观分子量可受到化学计量、折叠、复合物装配和/或糖基化影响。例如，这样的非所需副产物可使用尺寸排阻色谱法和/或凝胶电泳来检测，可具有比期望的多亚基复合物更高或更低的表观分子量。在示例性实施方案中，可在还原条件下检测非所需副产物。在其它示例性实施方案中，可在非还原条件下检测非所需副产物。
[0124]在示例性实施方案中，本公开还提供了以更高产率提供抗体和其它多亚基复合物的重组产生的改进方法和物质组合物。在示例性实施方案中，可使用本文中公开的方法使产率增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少100%或更多(相对于常规方法)。
[0125]在示例性实施方案中，其中可产生多亚基蛋白质的宿主细胞可以是酵母例如毕赤酵母属的种类，例如巴斯德毕赤酵母或另一种甲醇营养型酵母或在酵母菌属的种类中例如酿酒酵母或另一种酵母例如裂殖酵母属(例如，粟酒裂殖酵母(S.pombe))。可用于本发明的甲醇营养型酵母的其它实例包括安格斯毕赤酵母(在本领域中也称为汉逊酵母)、季也蒙毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、因诺托毕赤氏酵母、绪方奈川氏酵母(Ogataeanitratoaversa)和波伊德氏假丝酵母(Candida boidnii)。
[0126]宿主细胞可以是真核细胞例如酵母细胞，例如甲醇营养型酵母，例如毕赤酵母属的酵母。毕赤酵母属示例性甲醇营养型酵母包括巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母和因诺托毕赤氏酵母。宿主细胞可通过交配，例如通过将两个各自包含一个或多个拷贝的至少一个编码多亚基复合物的亚基 的基因的二倍体酵母细胞交配来产生。
[0127]在优选实施方案中，毕赤酵母属的甲醇营养型酵母是巴斯德毕赤醇。宿主细胞可以是二倍体或四倍体细胞。
[0128]编码期望的多亚基复合物的所述亚基例如所述期望的抗体轻链和/或重链的所述基因的至少一个，可在如下诱导型或组成型启动子的控制下表达，例如CUPl (通过培养基中铜的水平诱导的；参见Koller等，Yeast2000 ;16:651_656.)、四环素诱导性启动子(参见例如，Staib 等，Antimicrobial Agents And Chemotherapy, Jan.2008, p.146 - 156)、硫胺素诱导性启动子、AOXl、ICLl、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)、FLD1、ADHl、醇脱氢酶I1、GAL4、PH03、PH05和Pyk启动子、来源于其的嵌合启动子、酵母启动子、哺乳动物启动子、昆虫启动子、植物启动子、爬行动物启动子、两栖动物启动子、病毒启动子和禽类启动子。
[0129]宿主细胞可分泌所述期望的多亚基复合物至培养基中。可选择地或此外，可将所述期望的多亚基复合物保留在所述宿主细胞中，以及可从其分离所述期望的多亚基复合物。
[0130]期望的多亚基复合物可包含抗体，例如单特异性或双特异性抗体。抗体可以是特异性结合任何抗原的抗体。
[0131]期望的多亚基复合物可以是除了 2010年12月I日提交的美国临时申请号61/418，832、2011年12月I日提交的PCT/US11/62963、2011年12月I日提交的美国序列号13/309，295、2011年12月I日提交的美国序列号13/309，153、2011年12月I日提交的美国序列号13/308，665和2011年12月I日提交的美国序列号13/308，831中公开的抗体(例如，除抗-NGF抗体的任一种外的抗体)的任一种外的抗体。在示例性实施方案中，期望的多亚基复合物可以不是下列抗体的任一种:Abl-NGF、Ab2-NGF、Ab3-NGF、Ab4-NGF、Ab5-NGF、Ab6-NGF、Ab7-NGF、Ab8-NGF、Ab9-NGF、Abl0-NGF、Abll-NGF、Abl2-NGF、Abl3-NGF、Abl4-NGF、Abl5-NGF、Abl6-NGF、Abl7_NGF、Abl8_NGF、Abl9_NGF、Ab20_NGF 和 Ab21_NGF。在示例性实施方案中，期望的多亚基复合物可以是不是下列抗体的任一种的Fab2片段:Abl-NGF、Ab2-NGF、Ab3-NGF、Ab4_NGF、Ab5_NGF、Ab6_NGF、Ab7_NGF、Ab8_NGF、Ab9_NGF、AbIO-NGF,Ab11-NGF, Abl2-NGF、Abl3_NGF、Abl4_NGF、Abl5_NGF、Abl6_NGF、Abl7_NGF、Abl8_NGF、Abl9-NGF、Ab20-NGF和Ab21-NGF。在其它示例性实施方案中，期望的多亚基复合物可以不是下列抗体的任一种的 Fabl 片段:Abl-NGF、Ab2_NGF、Ab3_NGF、Ab4_NGF、Ab5_NGF、Ab6-NGF、Ab7-NGF、Ab8-NGF、Ab9-NGF、Abl0-NGF、Abll-NGF、Abl2-NGF、Abl3-NGF、Abl4-NGF、Abl5-NGF、Abl6-NGF、Abl7-NGF、Abl8-NGF、Abl9-NGF、Ab20-NGF和Ab21-NGF。在其它示例性实施方案中，期望的多亚基复合物可以不包含抗体，所述抗体包含下列抗体的任一种中包含的互补性决定区(CTR)的至少I个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少全部
6个:Abl-NGF、Ab2-NGF、Ab3-NGF、Ab4-NGF、Ab5-NGF、Ab6-NGF、Ab7-NGF、Ab8-NGF、Ab9-NGF、AblO-NGF, Abll-NGF, Abl2_NGF、Abl3_NGF、Abl4_NGF、Abl5_NGF、Abl6_NGF、Abl7_NGF、Abl8-NGF、Abl9-NGF、Ab20_NGF或Ab21_NGF，并且任选地具有对于NGF的结合特异性。例如，期望的多亚基复合物可以不包含或可以不由如下多肽序列组成:分别地SEQ ID NO:51和401的轻链和重链多肽序列、分别地SEQ ID NO: 53和402的轻链和重链多肽序列、和/或分别地SEQ ID NO:405和406的轻链和重链多肽序列和/或分别地SEQ ID NO:407和408的轻链和重链多肽序列。作为其它实例，期望的多亚基复合物可以不包含抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:55、56、57、58、59和60的⑶R的至少I个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少全部6个的抗体，并且任选地具有对于NGF的结合特异性。
[0132]期望的多亚基复合物可包含任何类型的抗体。示例性抗体类型包括任何哺乳动物种类例如人、小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、牛等的抗体。优选，抗体是人抗体或可具有兔来源的人源化抗体。期望的抗体可以是单价、双介或多价抗体。
[0133]可最优化基因的至少一个以在所述宿主细胞中表达(例如，通过选择优选密码子和/或通过密码子选择改变AT的百分比)，所述基因在所述小组的所述宿主细胞的至少一种中提供所述多亚基复合物的亚基例如期望的抗体的轻链和/或重链的表达。
[0134]所述期望的多亚基复合物例如期望的抗体的纯度可通过测量由所述宿主细胞产生的期望的多亚基复合物的分数和/或通过测量多亚基复合物的特异性活性(例如，特异性结合期望的抗体的靶)来评估，所述多亚基复合物是非糖基化的，包含在具有预期的表观流体力学半径和/或表观分子量(例如通过尺寸排阻色谱法测量的)的复合物中，具有预期的电泳迁移率(例如，通过凝胶电泳，例如SDS-PAGE，和任选地Western印迹所检测)。
[0135]期望的多亚基复合物可以是抗体，并且所述抗体的产率可通过测定扣除任何产物相关变体的由所述宿主细胞产生的期望抗体的量来评估，所述变体被异常糖基化，包含在除具有预期的表观分子量或流体力学半径的复合物外的抗体复合物中，和/或不能特异性结合所述期望的抗体的靶。
[0136]主题方法可产生至少100mg/L、至少150mg/L、至少200mg/L、至少250mg/L、至少 300mg/L、100 至 300mg/L、100 至 500mg/L、100 至 1000mg/L 或超过 1000mg/L 例如高至1200mg/L、高至10，000mg/L或更高的上清液抗体滴度。
[0137]在另一个方面，产生期望的多亚基复合物宿主细胞可以是毕赤酵母属的双倍体或四倍体细胞，例如巴斯德毕业赤酵母细胞。可将提供所述期望的多亚基复合物的亚基例如期望的抗体的轻链和重链的表达的基因整合到所述宿主细胞的基因组，和/或可将其包含在染色体外元件、质粒或人工染色体上。
[0138]在另一个方面，产生期望的多亚基复合物的宿主细胞可经工程化以增加产率和/或纯度，例如如在2011年8月31日提交的美国临时申请序列号61/525，307(代理人案卷号67858.730200)(所述美国临时申请序列通过引用整体并入本文)中进一步描述的。如其中所描述的，可通过改变每细胞编码每一个亚基的基因的拷贝数来极大地改善抗体或其它多亚基复合物的产率和纯度。例如，当其中的多亚基复合物是抗体时，宿主细胞可包含比提供重链的表达的基因的拷贝更多的拷贝的提供轻链的表达的基因。在示例性实施方案中，宿主细胞可包含1-10个拷贝的编码轻链的基因和1-10个拷贝的编码重链的基因。所述宿主细胞中编码重链的基因的拷贝数和编码轻链的基因的拷贝数分别地各自可以为:2和2、2和3、3和3、3和4、3和5、4和3、4和4、4和5、4和6、5和4、5和5、5和6或5和7。重链和轻链基因拷贝数的另外的示例性组合包括达到10个拷贝的重链和/或轻链基因的任意组合，例如 H2xLl、H3xLl、H4xLl、H5xLl、H6xLl、H7xLl、H8xLl、H9xLl、HlOxLl、HlxL2、H2xL2、H3xL2、H4xL2、H5xL2、H6xL2、H7xL2、H8xL2、H9xL2、H10xL2、HlxL3、H2xL3、H3xL3、H4xL3、H5xL3、H6xL3、H7xL3、H8xL3、H9xL3、H10xL3、HlxL4、H2xL4、H3xL4、H4xL4、H5xL4、H6xL4、H7xL4、H8xL4、H9xL4、H10xL4、HlxL5、H2xL5、H3xL5、H4xL5、H5xL5、H6xL5、H7xL5、H8xL5、H9xL5、H10xL5、HlxL6、H2xL6、H3xL6、H4xL6、H5xL6、H6xL6、H7xL6、H8xL6、H9xL6、H10xL6、HlxL7、H2xL7、H3xL7、H4xL7、H5xL7、H6xL7、H7xL7、H8xL7、H9xL7、H10xL7、HlxL8、H2xL8、H3xL8、H4xL8、H5xL8、H6xL8、H7xL8、H8xL8、H9xL8、H10xL8、HlxL9、H2xL9、H3xL9、H4xL9、H5xL9、H6xL9、H7xL9、H8xL9、H9xL9、H10xL9、HlxLlO、H2xL10、H3xL10、H4xL10、H5xL10、H6xL10、H7xL10、H8xL10、H9xL10、HlOxLlO，其中“H”后的数字标明重链基因的拷贝数，“L”后的数字标明轻链基因的拷贝数。例如，指定数目的重链和轻链基因拷贝可被串联地整合到单个基因座，或整合到多个基因座(所述基因座的任一个或全部可包含超过一个拷贝)。任选地，每一个基因组基因座可包含超过3或4个串联整合的基因拷贝，从而在扩增和/或抗体产生过程中增强拷贝数稳定性。
[0139]培养最常见地包括给细胞提供能源、氧和营养物。用于用于表达重组蛋白质的巴斯德毕赤酵母发酵的设计和最优化(包括细胞密度、液体培养基体积、底物进料速度以及反应的每一个时期的长度的最优化)的方法在文献中也是已知的。参见Zhang等，“Rational Design and Optimization of Fed-Batch and Continuous Fermentations^inCregg, J.M., Ed., 2007, Pichia Protocols (第 2 版)，Methods in Molecular Biology,第389卷，Humana Press, Totowa, N.J.,第43_63页。可给培养物提供包含氧的气体混合物，例如补充有氧或未补充氧的空气。可将酵母培养物培养在可以为基本培养基，可以不存在选择剂和/或可以不存在预形成的氨基酸或其它复合生物分子的培养基中。培养基还可以是复合培养基(例如，包含酵母提取物和/或植物蛋白胨)。培养基可包含氮源(例如，甲胺氯、NH4S04、酵母提取物、大豆蛋白胨、其它植物蛋白胨等)。示例性基本培养基包括基本葡萄糖培养基(MD) (1.34%酵母氮源基础(YNB)(无氨基酸)、4X 10_5%生物素和2%葡萄糖)、缓冲的基本甘油复合培养基(BMGY) (1%酵母提取物、2%蛋白胨、1%甘油、1.34%YNB (无氨基酸)、4X 10 - 5%生物和IOOmM磷酸钾(pH6.0))。培养基可包含一种或多种盐(例如氯化钠、氯钙、氯化镁和磷酸盐)、缓冲剂(例如磷酸钾、Tris或HEPES)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如，添加以抑制污染物的生长和/或维持可选择标记)、痕量元素以及葡萄糖或另一种能源。还可以对于本领域技术人员来说是已知的适当的浓度包含任何补充物和替代物。
[0140]可使培养物生长至高细胞密度，例如至少50g/L、至少100g/L、至少300g/L、至少400g/L、至少500g/L或至少700g/L。这些培养物密度是举例说明性的而非限定性的，并且适合的培养物密度可由本领域技术人员来容易地确定。
[0141]可将酵母细胞培养至少20个倍增并且在所述至少20个倍增后维持所述抗体的高水平表达。
[0142]可将酵母细胞培养至少50个倍增并且在所述至少50个倍增后维持所述抗体的高水平表达。
[0143]可将酵母细胞培养至少100个倍增并且在所述至少100个倍增后维持所述抗体的高水平表达。
[0144]在另一个方面，本公开提供了包含按照前述方法的任何方法产生的稳定的二倍体毕赤酵母属酵母培养物的培养基，其中培养基可包含所述期望的抗体的表达水平，所述表达水平可以为至少约 50mg/L、100mg/L、500mg/L、750mg/L、1000mg/L、1250mg/L、1500mg/L、1750mg/L、2000mg/L或更高。这些产率值是举例说明性的而非限定性的。任选地，可以例如使用、Zhang等(2007)(同上)中描述的方法和一般途径最优化产率。例如，可通过改变温度、pH、培养基组成(例如，碳源、碳源浓度、两种或更多种碳源的混合物、氮源和浓度、盐和营养物(包括KH2P04、K2HPO4, MgSO4、`硫酸钾、柠檬酸钠、硫酸钾、柠檬酸钠、痕量金属例如氯化钴、硫酸铜、碘化钠、硫酸镁、钥酸钠、硼酸、氯化锌、硫酸亚铁、维生素例如生物素、肌醇、硫胺素、蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白氨基酸、尿素、磷酸铵或其它铵离子、L-精氨酸-盐酸盐))、时间、培养物密度、充氧以及其它影响产率的其它因素来最优化产率。例如，期望的多亚基复合物的产率、表达和/或纯度可在一些情况下通过将温度维持在期望的设置点例如约15°C至约30°C (例如约17°C至约25°C)的设置点上来进行改善。不希望被理论束缚，假设控制温度可通过折叠和翻译后加工途径来帮助细胞内运输，和/或可减小细胞蛋白酶的活性。同样地，期望的多亚基复合物的产率、表达和/或纯度可在一些情况下通过将培养基的PH维持在期望的设置点例如pH3至pH8 (例如pH4至pH7)的设置点上来进行改善。
[0145]在另一个方面，本公开提供了包含按照前述方法的任何方法产生的稳定的二倍体巴斯德毕赤酵母的培养基，所述方法将所述期望的抗体表达进入培养基，其中所述培养物中的所述二倍体细胞的细胞密度可以为至少约50g/L、100g/L、300g/L、400g/L、500g/L、700g/L或更多。这些培养物密度是举例说明性的而非限定性的，适当的培养物密度可由本领域技术人员来容易地确定。
[0146]所述抗体或其它多亚基蛋白质的至少一个亚基可包含分泌信号，例如S.chicken溶菌酶(CLY)信号肽；CLY-L8 ;酿酒酵母转化酶(SUC2)信号肽；MF_ a (Prepro)；MF-a (Pre) -apv ；MF-a (Pre) -apv-SLEKR ；MF-a (Prepro) - (EA) 3 ; a F 信号肽；KILM1 信号肽；可抑制的酸性磷酸酶(PHOl)信号肽；黑曲霉GOX信号肽；西方许旺酵母葡糖淀粉酶基因(GAMl)信号肽；无前导序列的人血清白蛋白(HSA)信号肽；具有前导序列的人血清白蛋白(HSA)信号肽；ISN信号肽；IFN信号肽；HGH信号肽；植物血细胞凝集素(PHA) ；SiIkworm溶菌酶；人溶菌酶(LYZl);活化素受体I型；活化素受体II型受体；巴斯德毕赤酵母免疫球蛋白结合蛋白(PpBiP);人抗体3D6轻链前导序列；及其任意组合。
[0147]宿主细胞可通过交两个二倍体酵母细胞交配来产生，所述酵母细胞各自包含一个或多个拷贝的编码所述抗体或其它多亚基蛋白质的一个或多个亚基的基因。
[0148]附图简述
[0149]图1A-B.通过在葡萄糖进料开始之前在从其产生抗体的酵母培养物中添加大剂量乙醇来改善重组产生的Ab-A的纯度。在97小时的培养后收集抗体，通过蛋白A亲和进行纯化，随后使用非还原性凝胶(图1A)拆分期望的完全抗体(箭头，“完全Ab (H2L2) ”)与不期望的产物相关变体，通过SDS-PAGE来评估纯度。基于它们的分子量、对于蛋白A的亲和力以及下文中进一步描述的其它研究，将具有异常化学计量的复合物鉴定为包含一个重链和一个轻链(箭头，“H1L1”)的“半抗体”种类和包含两个重链和一个轻链(“H2L1”)的复合物。可通过在抗体产生过程中大剂量添加乙醇来极大减小H2L1和HlLl复合物的相对丰度。比较图1A的泳道2-3 (无大剂量)与泳道5 (具有大剂量)。图1B显示在还原条件下处理的相同样品，所述处理将每一个完全抗体HlLl和H2L1复合物分离成单个重链和轻链，从而确认HlLl和H2L1复合物由全长重链和轻链组成。图1A-B中的泳道顺序:泳道1:分子量标准；泳道2和3:在不大剂量添加乙醇的情况下从发酵培养物制备的对照样品；泳道4:无样品；样品5:在大剂量添加乙醇的情况下从发酵培养物制备的样品。
[0150]图1C-E显示沿着非`还原凝胶的长度绘制的凝胶条带强度(图1A，分别地泳道2、3和5);箭头鉴定对应于HlLl种类的峰。图1F将图1C-E中显示的HlLl峰中包含的面积绘制成表，显示了 HlLl复合物的相对丰度的约90%的降低。H2L1复合物丰度因与完全抗体峰的不完全拆分而未被定量。
[0151]图2A-B和3A-B显示通过向酵母培养物添加大剂量乙醇产生的Ab-A的纯度的改善的重现性。在87或86小时的培养后(分别地图2和3)收集抗体，通过蛋白A亲和进行纯化，随后使用非还原凝胶通过SDS-PAGE评估纯度。再次通过大剂量乙醇添加来降低HlLl和H2L1复合物(箭头)的丰度。将图2A的泳道3 (无大剂量)与泳道2 (具有大剂量)相比较，将图3A的泳道4-6 (无大剂量)与泳道2和4(具有大剂量)相比较。图2B显示在还原条件下处理的与图2A中相同的样品，再次确认观察到的产物相关变体由全长重链和轻链组成。图2A-B中的泳道顺序:泳道1:分子量标准；泳道2:在大剂量添加乙醇的情况下从发酵培养物制备的样品；泳道3:在不大剂量添加乙醇的情况下从发酵培养物制备的对照样品。图3A中的泳道顺序:泳道1:分子量标准；泳道2和4:在大剂量添加乙醇的情况下从发酵培养物制备的样品；泳道3:无样品；泳道5-7:在不大剂量添加乙醇的情况下从发酵培养物制备的对照样品。
[0152]图2C和2D显示沿着非还原凝胶的长度绘制的凝胶条带强度(图2A，分别地泳道2和3);箭头鉴定对应于HlLl种类的峰。图2E和3B将图2C和图3A中显示的HlLl峰中包含的面积绘制成表，显示了图2A中的HlLl复合物的相对丰度的约85%的降低，和图3A中的HlLl复合物的相对丰度的约87%的平均降低。
[0153]图4A-D.通过在发酵过程的生产期之前大剂量添加乙醇也改善第二重组抗体(，，Ab-B，，)的纯度。在67小时(“T67)或87小时(“T87”)的培养(分别地，图4A-B和4C-D)后收集发酵培养液体培养基的样品，通过蛋白A亲和纯化抗体。随后，使用非还原凝胶通过SDS-PAGE评估纯度(图4A和4C)。在两个评估的时间点上，相对于未接受大剂量乙醇添加的对照培养物，在接受大剂量乙醇添加的制备的发酵培养物中半抗体种类(HlLl)和H2L1复合物的丰度大大降低。将图4A的泳道2-3 (无大剂量)与泳道6_7(具有大剂量)相比较，以及将图4C的泳道2-3(无大剂量)与泳道6-7(具有大剂量)相比较。图4B和4D显示在还原条件下处理的相同样品。图4A-D的泳道顺序:泳道1:分子量标准；泳道2-3:在不大剂量添加乙醇的情况下从发酵培养物制备的对照样品；泳道4-5:无样品；泳道6-7:在大剂量添加乙醇的情况下从发酵培养物制备的样品。
[0154]图4E和4F将分别在图4A(T67)和4C(T87)中显示的HlLl峰中包含的面积绘制成表，显现了乙醇的大剂量添加产生图4A中显示的较早时间点上HlLl复合物的相对丰度的约73%的降低和图4C中显示的较晚时间点上HlLl复合物相对丰度的约34%的平均降低。
[0155]图5A-B.通过在发酵过程的生产期之前大剂量添加乙醇也改善第三重组抗体(”Ab-C”)的纯度。在86小时的培养(图5A)后收集抗体，通过蛋白A亲和纯化抗体，随后，使用非还原凝胶通过SDS-PAGE评估纯度(图5A)。即使在不大剂量添加乙醇的情况下在Ab-C产物中HlLl和H2L1复合物不太丰富，留了更少的改善空间。然而，相对于未接受大剂量乙醇添加的对照培养物,在接受大剂量乙醇添加的发酵培养物中半抗体种类(HlLl)和H2L1复合物的丰度显著降低。将图5A的泳道5-6 (无大剂量)与泳道3 (具有大剂量)相比较。图5B显示在还原条件下处理的相同样品。图5A-B的泳道顺序:泳道1:分子量标准；泳道2:无样品；泳道3:在接受大剂量乙醇添加的情况下从发酵培养物制备的对照样品；泳道4:无样品；泳道5-6:从未接受大剂量乙醇添加的发酵培养物制备的对照样品。
[0156]图5C将图5A中显示的HlLl峰中包含的面积绘制成表，显示了通过大剂量添加乙醇产生的HlLl复合物的相对丰度的约61`%的平均降低。
[0157]图6A-F显示通过尺寸排阻色谱法产生的图1-3中显示的Ab-A制剂的相对纯度。在每一个小组中，主峰包含含有两个重链和两个轻链(H2L2)的完全抗体。通过该方法未能将HlLl种类与主峰相区分(据认为归因于通过在使用的条件下保留的非共价缔合产生的HlLl 二聚体形成)。然而，检测到其它不期望的产物相关变体，包括更高分子量的种类(主峰的左边)和更低分子量的种类(主峰的右边)。检测到被认为对应于包含两个完全抗体(H4L4)的抗体二聚体的主峰(箭头)，并且这类抗体的相对丰度在从接受大剂量乙醇添加的发酵培养物制备的样品中降低。将图6A、6C和6E (无大剂量)与图6B、6D和6F(具有大剂量)相比较。
[0158]图7概述了通过图6中显示的6个Ab-A样品和5个另外的样品的SEC检测的产物相关变体的量的定量。对于每一个鉴定的样品(第I列)，显示了运行设置号(第2列，标识平行进行的发酵运行)、添加的大剂量(10g/L或无，第3列)和在获取和处理培养样品前消耗的培养时间(第4列)以及在主峰中检测到的蛋白质的分数(“SEC主峰％”，第5列)。生长期结束时乙醇的大剂量添加使主峰中包含的平均百分比从80.3%增加至90.6%。[0159]图8概述了通过图4中显示的Ab-B抗体样品的SEC检测到的产物相关变体的量的定量。对于每一个发酵运行(第I列)，显示了在生长期结束时添加的大剂量(10g/L或无，第2列)，和在获取和处理培养样品前消耗的培养时间(第3列)以及主峰中检测到的蛋白质的分数(“SEC主峰%，，，第4列)。总体纯度增加，主峰在T67时从76%增加至79%，在T87时从60%增加至73%。
[0160]图9概述了通过图5中显示的Ab-C抗体样品的SEC检测到的产物相关变体的量的定量。对于每一个鉴定的发酵运行(第I列)，显示了添加的大剂量(10g/L或无，第2列)，和在获取和处理样品前消耗的培养时间(第3列)以及主峰中检测到的蛋白质的分数(“SEC主峰％”，第4列)。在总体纯度上几乎无差异，如通过该方法检测到的，在利用大剂量乙醇或不利用大剂量乙醇的情况下约89%的产物包含在主峰中。这显然归因于即使在不添加大剂量乙醇的情况下Ab-C抗体的高初始纯度。此外，SEC未将HlLl种类与完全抗体相区分，相应地归因于大剂量乙醇的该种类的减少的产生未反映在SEC结果中。
[0161]图10概述了包含高量或低量HlLl条带的Ab-A样品中的游离重链(不存在对第二重链的二硫键)的量的质谱测量的结果。如所预期的，游离重链的量与HlLl条带的量相关，确认了其身份为包含一个重链和一个轻链并且不存在对第二重链的二硫键。
[0162]图11-13显示了大剂量乙醇添加与细胞活力之间的关系。大剂量乙醇的添加通常改善细胞活力以及Ab-A抗体(图11)和Ab-B抗体(图12)的抗体纯度。这些结果表明细胞活力的改善可至少部分负责通过大剂量乙醇添加产生的抗体纯度的改善。与这些结果一致，Ab-C抗体培养物显示比Ab-A和Ab-B培养物更高的抗体纯度和细胞活力(图13)。显然，因为Ab-C抗体产生性培养物的活力在这些实验中已经很高，所以几乎没有改善的空间，并且培养物在大剂量添加乙醇的情况下显示几无改善。在图11-13，实心条棒表示无大剂量乙醇添加，然而空心条棒表示乙醇的大剂量添加。从在1.5小时(在该时间上收集样品以进行纯度分析)取样的发酵培养物测定活力(如在先前载片中鉴定的)。
`[0163]图14显示宽范围的乙醇大剂量浓度可产生抗体纯度的相同改善。在大剂量添加5g/L (0.5%w/v)至15g/L(l.5%w/v)的乙醇的情况下产生Ab-A,通过蛋白A亲和进行纯化，随后通过非还原SDS-PAGE分析纯度。每一个培养物在第63小时(图14A)和第86小时(图14B)显示相似的低H2L1和HlLl复合物水平。图14A-B中的泳道顺序:泳道1:分子量标准；泳道2和7:5g/L大剂量；泳道3和5:10g/L大剂量；泳道4和6:15g/L大剂量。
[0164]图15显示溶解氧剧增与乙醇大剂量添加之间过去的时间可进行相当大的变化，然而产生相似的抗体纯度的改善。在大剂量添加10g/L(l%W/v)的乙醇的情况下产生Ab-A，通过蛋白A亲和进行纯化，随后通过非还原SDS-PAGE分析纯度(图15A)。“饥饿期”(溶解氧剧增(表明培养物中碳源的耗尽)与大剂量添加乙醇之间的时间)在O与3小时之间变化。每一个培养物显示相似的低H2L1和HlLl复合物的水平，无论饥饿期的持续时间多长，这表明抗体纯度对饥饿期的不存在或至少达到3小时的饥饿期相对不敏感。在还原凝胶上分析相同样品(图15B)。图15A-B中的泳道顺序:泳道1:分子量标准；泳道2-4:无样品；泳道5:0小时饥饿期；泳道6:3小时饥饿期。
[0165]图16显示平衡期(大剂量乙醇添加与开始进料之间的时间)对抗体纯度的作用。在大剂量添加10g/L(l%w/v)的乙醇的情况下产生Ab-B抗体,通过蛋白A亲和进行纯化,随后通过非还原SDS-PAGE分析纯度(图16A)。平衡期的持续时间为0、30或60分钟。60分钟的平衡期导致更低的抗体纯度(更高的H2L1和HlLl复合物丰度)。对于60分钟的平衡期，特别在培养早期(在第23小时，图16B)，培养物活力也显著下降；到培养结束时(在第85小时，图16C)，活力略有改善。图16A中的泳道顺序:泳道1:分子量标准；泳道2和4:无样品；泳道3:30分钟的平衡；泳道5和6:60分钟的平衡时间；泳道7和8:0分钟的平衡时间。在图16B-C中，实心条棒表示O分钟的平衡期，阴影线条棒表示30分钟的平衡期，空心条棒表示60分钟的平衡期。
[0166]详细描述
[0167] 申请人:已意外地发现从酵母表达的多亚基复合物的纯度可通过向培养基添加大剂量乙醇来极大地改善。已显示乙醇的单次大剂量添加在长达至少97小时的持续生产时期中改善纯度。
[0168]本公开提供了主题方法和组合物，所述方法和组合物以增加的纯度和减少的一种或多种非所需副产物的产量提供抗体和其它多亚基复合物的重组产生。在示例性实施方案中，相对于期望的多亚基复合物，不期望的产物可显示如下的一项或多项:改变的化学计量、异常糖基化、表观分子量的差异、二硫键的差异、流体力学半径的差异、一个或多个亚基的片段和/或截短形式。非所需副产物可同样地显示一个或多个另外的差异。非所需副产物还可通过它们对制剂的作用，例如特异性活性的水平、免疫原性的改变，或对期望的多亚基复合物的物理构造和/或功能的其它作用来检测。
[0169]例如，当期望的多亚基复合物是抗体时，非所需副产物可包括HlLl或“半抗体”种类(即，包含重链和轻链，其中重链未通过二硫键连接至另一个重链)，和/或H2L1种类(即，包含两个重链和一个轻链，但不存在第二轻链)。
[0170]然而不希望被理论束缚，假设乙醇浓度的快速增加(这可通过大剂量添加乙醇来产生)可引起基因表达的持续改变，这赋予了正确折叠和装配的多亚基复合物的持续改善和/或增加了不正确折叠或错误装配的多亚基复合物的加工，从而导致多亚基复合物的改善的纯度。此外，已显示改善的抗体纯度与培养物中酵母的改善的活力相关，并且在此基础上 申请人:假设改善的活力可负责(至少部分)改善的纯度，然而该理论无意是限定性的。
[0171] 在优选实施方案中，异源多亚基复合物是抗体或抗体片段，例如人源化抗体，其由两个重链亚基和两个轻链亚基组成。优选宿主细胞包括酵母，特别优选酵母包括甲醇营养型酵母菌株，例如巴斯德毕赤酵母、多形汉森酵母(安格斯毕赤酵母)、季也蒙毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、因诺托毕赤氏酵母等等(参见，例如，美国专利4，812，405,4, 818，700、4，929，555,5, 736，383,5, 955，349,5, 888，768 和 6，258，559，所述美国专利的每一个通过引用整体并入本文)。宿主细胞可通过本领域已知的方法例如转化、交配、芽孢形成等来产生。
[0172]在优选实施方案中，宿主细胞可包含超过一个拷贝的编码异源蛋白质亚基的基因的一个或多个基因。例如，可将多拷贝的亚基基因以串联方式整合到一个或多个染色体基因座。患联整合的基因拷贝在产生多亚基复合物的培养过程中优选以稳定拷贝数得以保留。例如，在上述实例中，对于包含3至4个串联整合的拷贝的轻链和重链抗体基因的巴斯德毕赤酵母菌株，基因拷贝数通常是稳定的。
[0173]优选将编码异源蛋白质亚基的基因的一个或多个基因整合到宿主细胞的一个或多个染色体基因座。任何适当的染色体基因座可用于整合，包括基因间序列、启动子序列、编码序列、终止序列、调控序列等。可用于巴斯德毕赤酵母的示例性染色体基因座包括PpURA5 ；0CH1 ；A0X1 ;HIS4和GAP。还可将编码基因整合到一个或多个随机染色体基因座而非被靶向的基因座。在优选实施方案中，染色体基因座选自PGAP基因座、3’AOX TT和HIS4TT基因座。在另外的示例性实施方案中，可将编码异源蛋白质亚基的基因可包含在一个或多个染色体外元件例如一个或多个质粒或人工染色体中。
[0174]在示例性实施方案中，多亚基蛋白质可包含2、3、4、5、6或更多个非相同的亚基。此外，每一个亚基可在每一个多亚基蛋白质中存在I次或多次。例如，多亚基蛋白质可以是多特异性抗体例如包含两个不相同的轻链和两个不相同的重链的双特异性抗体。
[0175]可从单顺反子基因、多顺反子基因或其任意组合表达亚基。每一个多顺反子基因可包含多个拷贝的相同亚基，或可包含一个或多个拷贝的每一种不同的亚基。
[0176]可用于操作巴斯德毕赤酵母的示例性方法(包括培养、转化和交配的方法)公开于公布的申请包括 U.S.20080003643、U.S.20070298500 和 U.S.20060270045 中以及 Higgins, D.R.和 Cregg, J.M.，Eds.1998.Pichia Protocols.Methods in MolecularBiology.Humana Press, Totowa, N.J.和 Cregg, J.M., Ed., 2007, Pichia Protocols (第 2版)，Methods in Molecular Biology.Humana Press, Totowa, N.J.(将上述资料的每一份资料通过引用整体并入本文)中。
[0177]可使用的示例性表达盒由整合至编码分泌信号的序列的甘油醛脱氢酶基因(GAP基因)启动子、随后待表达的基因的序列、随后编码巴斯德毕赤酵母转录终止信号(来自巴斯德毕赤酵母醇氧化酶I基因(A0X1)的转录终止信号)的序列组成。Zeocin抗性标记基因可提供通过选择抗更高水平的Zeocin的转化子，来富集在菌株中包含多个整合的拷贝的表达载体的菌株的方法。类似地，G418或卡那霉素抗性标记基因可用于提供通过选择抗更高水平的遗传霉素或卡那霉素的转化子，来富集在菌株中包含多个整合的拷贝的表达载体的菌株的方法。
[0178]可使用的宿主菌株包括营养缺陷型巴斯德毕赤酵母或其它毕赤酵母属菌株，例如在metl、lyS3、ura3和adel或其它营养缺陷型相关基因中具有突变的菌株。优选突变不能以任何可评估的频率产生回复子并且优选地是部分突变体或甚至更优选是完全缺失突变体。优选地，原养型二倍体或四倍体菌株可通过将互补组的营养缺陷型菌株交配来产生。
[0179]二倍体巴斯德毕赤酵母菌株的转化以及巴斯德毕赤酵母有性周期的遗传操作可如 Pichia Protocols (1998, 2007)(同上)中所述来进行。
[0180]在转化之前，每一个表达载体可通过与靶基因组基因座(例如，GAP启动子序列)同源的区域内的限制 性内切酶切割进行线性化来指导载体至宿主细胞的靶基因座内的整合。随后可通过电穿孔或其它方法将每一个载体的样品单个地转化进入期望的菌株的培养物，成功的转化体可通过可选择标记例如抗生素抗性或营养缺陷型的互补作用来选择。可挑拣分离株，在选择条件下将其划线培养以产生单个菌落，随后通过对从每一个菌株提取的基因组DNA进行Southern印迹或PCR测定来检查，以确认编码多亚基复合物(例如，期望的抗体)的亚基的基因的拷贝数。任选地，预期的亚基基因产物的表达可以例如通过FACS、Western印迹、菌落转移检测和免疫印迹和本领域已知的其它方法来确认。任选地，额外地多次转化二倍体分离株以将额外的异源基因例如额外拷贝数的相同亚基和/或额外拷贝数的不同亚基整合在不同的基因座中。随后将二倍体菌株交配以产生能够合成多蛋白复合物的二倍体菌株(或更高倍体的菌株)。每一个预期的亚基基因的存在可通过Southern印迹、PCR和本领域已知的其它检测方法来确认。当期望的多蛋白复合物是抗体时，其表达还可通过菌落转移检测/免疫印迹法(Wung等Biotechniques21808_812 (1996)和/或通过FACS来确认。
[0181]任选地重复该转化方案以将异源基因靶向第二基因座中，所述第异源基因可以是与被靶向第一基因座的基因相同的或不同的基因。当待整合到第二基因座中的构建体编码与由第一基因座编码的序列相同或高度相似的蛋白质时，可改变其序列减少不期望的至第一基因座中的整合的概率。例如,待整合到第二基因座中的序列相对于整合到第一基因座的序列，可具有启动子序列、终止序列、密码子选择的差异和/或其它可耐受的序列差异。
[0182]为了交配巴斯德毕赤酵母二倍体菌株，将待杂交的每一个菌株一起涂板在交配板上。例如，可通过将每一个待交配的菌株在适合于其生长的板上划线培养来方便地同时进行多个交配，可将交配伴侣在第二块板(优选该板是丰富培养基例如YPD)上划线培养。通常地，在于30°C温育I或2天后，可将两块板以交叉的方式模印涂板至交配板上，这导致每一对菌株被共涂板并且在一对原始脉线的交叉点上具有交配的可能的交叉影线械。随后可温育(例如，在30°C)交配板以刺激两个菌株之间的交配开始。在约2天后，可将交配板上的细胞划线培养，涂板，或模印涂板至对期望的二倍体菌株具有选择性的培养基上(例如，当交配的菌株具有互补自养作用时，可使用省却培养基或基本培养基板)。可温育(例如，在30°C)这些板进行适当的持续时间(例如，约3天)以允许期望的二倍体菌株选择性生长。可挑拣产生的菌落，将其划线以分离单个菌落，纯化每一个二倍体菌落。
[0183]用于本发明的方法的表达载体还可包括酵母特异性序列，包括用于鉴定转化酵母菌的可选择营养缺陷型或药物标记。药物标记还可用于在酵母宿主细胞中扩增载体的拷贝数，例如通过在浓度升高的药物中培养一群细胞，从而选择表达升高的水平的抗性基因的转化体来进行扩增。
[0184]在示例性实施方案中，将编码异源蛋白质亚基的基因的一个或多个基因偶联至诱导型启动子。适当的示例性启动子包括醇氧化酶I基因启动子、甲醛脱氢酶基因(FLD ;参见美国公布N0.2007/0298500)和本领域已知的其它诱导型启动子。醇氧化酶I基因启动子在最常用的碳源例如葡萄糖、甘油或乙醇上在酵母生长过程中被严格抑制，但在甲醇上在生长过程中被高度诱导(Tschopp等，1987 ;属于Stroman, D.W.等的美国专利N0.4，855，231)。为了产生外来蛋白质，最初将菌株生长在抑制性碳源上，以产生生物质，随后转移至甲醇(作为唯一(或主要)碳源和能源)来诱导外来基因的表达。该调控系统的一个有利方面是可通过在抑制性条件下生长来维持利用外来基因(其表达产物对于细胞是有害的)转化的巴斯德毕赤酵母菌株。
[0185]在另一个示例性实施方案中，可将异源基因的一个或多个基因偶联至其表达水平在适当的条件下被上调的调控型启动子。示例性调控启动子包括CUPl启动子(被培养基中的铜的水平诱导的)、四环素诱导性启动子、硫胺素诱导性启动子、AOXl启动子和FLDl启动子。
[0186]虽然本发明公的大部分开内容描述抗体的产生，但本文中描述的方法可被容易地改造来同样地适用于其它多亚基复合物。不希望受理论限制，据信多亚基复合物的产率和纯度可受到亚基的浓度和化学计 量的巨大影响，这转而受到负责产生每一种亚基的基因的表达水平的影响。本文中公开的方法可被容易地用于改善任何重组多亚基复合物(包含两个或更多个不同亚基)的产率和/或纯度。此外，本方法不限于产生多蛋白质复合物，而且还可被容易地改造来适用于核糖核蛋白(RNP)复合物(包括端粒酶、hnRNP、核糖体、snRNP、信号识别颗粒、原核和真核RNA酶P复合物)，以及包含多个不同蛋白质和/或RNA亚基的任何其它复合物。表达多亚基复合物的宿主细胞可通过本领域已知的方法来产生。例如，一小组包含不同基因拷贝数的组合的二倍体或四倍体酵母细胞可通过将包含不同拷贝数的单个亚基基因(其拷贝数优选在交配前是已知的)的细胞交配来产生。
[0187]定义
[0188]应当理解本发明不限于描述的具体方法、方案、细胞系、动物的种或属以及试剂，因为这可变化。还应理解本文中使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案，无意限定仅由所附权利要求限定的本发明的范围。
[0189]如本文中所用，除非上下文中另外清楚地指出，否则单数形式〃 一个/ 一种〃、〃和〃以及〃所述〃包括复数所指物。因此，例如，〃 一个/ 一种细胞〃包括多个这样的细胞并且〃所述蛋白质"包括指一种或多种蛋白质以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。除非明确地另有所指，否则本文中使用的所有技术和道学术语具有与本发明所属的领域内的技术人员通常理解的含义相同的含义。
[0190]大剂量添加:在本公开中，“大剂量添加”通常是指与培养细胞(例如，在培养基中)接触的物质(例如乙醇)的浓度的快速改变。例如，可以以单次添加、超过一次添加的连续添加和/或在一段时间内(例如，在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60,90或120分钟的时间内)进行的输注的方式将物质添加至培养细胞。还可通过部分或完全更换培养基，例如通过浓缩细胞(使用离心、过滤、沉降或其它方法)，除去部分或全部培养基，随后添加物质，或通过将细胞添加至含有物质的培养基中来添加物质。可将物质与载体(例如，培养基、水、盐水等)混合。例如，乙醇的大剂量添加可包括将纯的或高浓度乙醇(例如，100%、95%、70%、50%、60%、40%、30%、20%等)以足以产生期望的浓度的量添加至培养基中。作为另一个实例，可将细胞添加至含有乙醇的培养基，例如通过将含有细胞的接种物添加至含乙醇的培养基。`
[0191]大剂量浓度:在本公开中，“大剂量浓度”通常是指因物质(例如，乙醇)的大剂量添加而导致的浓度。
[0192]具有交配能力的酵母的种:在本发明中，这意欲广泛地包括可在培养中生长的任何二倍体或四倍体酵母。这样的种类的酵母可以以单倍体、二倍体或其它多倍体形式存在。给定倍性的细胞可在适当的条件下以该形式增殖无限的世代数。二倍体细胞还可生成孢子来形成单倍体细胞。连续交配可通过二倍体菌株的进一步交配或融合来导致四倍体菌株。本发明涉及单倍体酵母以及例如通过交配或融合(例如，原生质球融合)产生的二倍体或其它多倍体酵母细胞的用途。
[0193]在本发明的一个实施方案中，具有交配能力的酵母是酵母菌科(Saccharomycetaceae)的成员，其包括阿斯霉属(Arxiozyma)、类盘酵母属(Ascobotryozyma)、固囊酵母属(Citeromyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、德克酵母属(Dekkera)、假囊酵母属(Eremothecium)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、酿酒酵母属(Kazachstania)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、柯达菌属(Kodamaea)、类德罗菌属(Lodderomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、毕赤酵母属、酵母菌属、子囊酵母属(Saturnispora)、四盾酵母属(Tetrapisispora)、有抱圆酵母属(Torulaspora)、拟威尔酵母属(Williopsis)和接合糖酵母菌(Zygosaccharomyces)。潜在地用于本发明的其它类型的酵母包括子囊菌酵母属(Yarrowia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、线黑粉(Filobasium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、布勒掷孢酵母属(Bullera)、白冬孢酵母属(Leucosporidium)和线黑粉菌属(Filobasidella)。
[0194]在本发明的优选实施方案中，具有交配能力的酵母是毕赤酵母属的成员或为另一种甲基营养生物。在本发明的其它优选实施方案中，毕赤酵母属的具有交配能力的酵母是下列种之一:巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母和汉逊酵母(安格斯毕赤酵母)。在本发明的特别优选实施方案中，毕赤酵母属的具有交配能力的酵母是巴斯德毕赤酵母种。
[0195]单倍体酵母细胞:具有单个拷贝的其正常基因组(染色体)组型的每一个基因的细胞。
[0196]多倍体酵母细胞:具有超过一个拷贝的其正常基因组(染色体)组型的细胞。
[0197]二倍体酵母细胞:具有两个拷贝(等位基因)的其正常基因组组型的基本上每一个基因的细胞，通常通过两个二倍体细胞的融合(交配)过程形成的。
[0198]四倍体酵母 细胞:具有4个拷贝(等位基因)的其正常基因组组型的基本上每一个基因的细胞，通常通过两个二倍体细胞的融合(交配)过程形成的。四倍体可具有2、3、4或更多个不同的表达盒。这样的四倍体可通过选择性交配纯合异宗配合二倍体a/a与α/α二倍体在酿酒酵母中获得和通过单倍体的连续交配(以获得营养缺陷型二倍体)在毕赤酵母属中获得。例如，可将[met his]单倍体与[ade his]单倍体交配以获得二倍体[his];和可将[met arg]单倍体与[ade arg]单倍体交配以获得二倍体[arg];随后可将二倍体[his]与二倍体[arg]交配以获得四倍体原养型。本领域技术人员应理解二倍体细胞的有益效果和用途也可适用于四倍体细胞。
[0199]酵母交配:两个酵母细胞籍以融合以形成单个酵母细胞的过程。融合细胞可以是单倍体细胞或具有更高倍性的细胞(例如，将两个二倍体细胞交配以产生四倍体细胞)。
[0200]减数分裂:二倍体酵母细胞藉以经历减容分裂以形成4个单倍性孢子产物。每一孢子随后可萌发并且形成单倍体营养生长细胞系。
[0201]可选择标记:可选择标记是赋予接受该基因(如例如通过转化事件)的细胞生长表型(物理生长特征)的基因或基因片段。可选择标记允许细胞在其中不接受该可选择标记基因不能生长的条件下在选择生长培养基中存活和生长。可选择标记通常分成几个类型，包括阳性可选择标记基因例如赋予细胞对抗生素或其它药物、温度(当将两个温度敏感型(“ts”)突变体杂交或转化ts突变体时)的抗性的基因；阴性可选择标记基因例如生物合成基因，所述生物合成基因赋予细胞在不含被不具有该生物合成基因的细胞需要的特定营养物的培养基中生长的能力，或诱变的生物合成基因，所述诱变的生物合成基因使得细胞不能通过不具有野生型基因的细胞生长；等。适当的标记包括但不限于:ZE0、NE0(G418)、LYS3、METl、MET3a、ADEl、ADE3、URA3 等。
[0202]整合的:共价地连接至生物体的染色体中的遗传元件(通常地异源遗传元件)。
[0203]串联整合的:两个或更多个拷贝的被整合在染色体中相邻位置中的遗传元件。两个或更多个拷贝不必定向；例如对于转录的基因，一些拷贝可从Watson链转录，其它拷贝可从Crick链转录。
[0204]宿主细胞:在本公开内容的上下文中，术语宿主细胞是指包含异源基因的细胞(例如，真核细胞，例如毕赤酵母属细胞)。例如，异源基因可提供期望的多亚基复合物的亚基的表达，参与蛋白质折叠(例如，伴侣分子)、表达或分泌的基因和/或另一种期望的基因。可将异源基因整合到真核细胞的基因组中或包含在染色体外元件例如质粒或人工染色体内。
[0205]表达载体:这些DNA载体包含有利于外来基因在靶宿主细胞内表达的元件。方便地，首先在细菌宿主例如大肠杆菌(E.coli)中进行用于转化的DNA的产生和序列的操作，并且通常载体可包括有利于这样操作的序列，包括细菌复制起始点和适当的细菌选择标记。选择标记编码在选择性培养基中生长的转化的宿主细胞存活或生长所必需的蛋白质。未用包含选择基因的载体转化的宿主细胞在培养基上不能存活。常见选择基因编码蛋白质，所述蛋白质(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，(b)补充营养缺陷性不足或(c)提供不可从复合培养基获得的至关重要的营养物。用于酵母转化的示例性载体和方法描述于例如Burke, D.，Dawson, D.，&Stearns, T.(2000).Methods in yeast genetics: a Cold SpringHarbor Laboratory course manual.Plainviewj N.Y.: Cold Spring Harbor LaboratoryPress (将所述文献通过引用整体并入本文)中。
[0206]用于本发明的方法的表达载体还可包括酵母特异性序列，包括用于鉴定转化的酵母菌株的可选择营养缺陷或药物标记。药物标记还可用于选择载体拷贝数在酵母宿主细胞中的扩增。
[0207]编码目标序列的多肽通常有效地连接至转录和翻译调控序列，所述调控序列提供多肽在酵母细胞中的表达。这些载体元件可包括但不限于下列元件的一个或多个:增强子元件、启动子和转录终止序列。还可包含用于多肽分泌的序列，例如信号序列等。酵母复制起始点是任选的，因为表达载体`通常被整合到酵母基因组中。
[0208]虽然是任选地，但在本发明的一个实施方案中，将多亚基复合物的一个或多个亚基有效地连接至或融合至分泌序列，所述分泌序列提供表达的多肽至培养基中的分泌，所述分泌序列可有利于异源多亚基复合物的收集和纯化。甚至更优选地，分泌信号例如通过选择优选密码子和/或通过密码子选择改变AT百分比来提供来自宿主细胞(例如，酵母二倍体细胞)的多肽的最优化分泌。在本领域已知分泌效率和/或稳定性可通过选择分泌序列来实现，并且最佳分泌序列在不同蛋白质之间可变化(参见，例如，Koganesawa等，Protein Eng.2001Sep; 14(9):705-10，将所述文献通过引用整体并入本文)。许多潜在适当的分泌信号在本领域是已知的并且可容易地测试它们对特定异源多亚基复合物的产率和/或纯度的作用。可潜在地使用任何分泌序列，包括存在于酵母和其它物种的分泌型蛋白质中的那些分泌序列以及工程化分泌信号。可使用的示例性分泌序列包括:鸡溶菌酶(CLY)信号肽(MRSLLILVLCFLPLAALG(SEQ ID NO: 414))、CLY-L8 (MRLLLLLLLLPLAALG (SEQID N0:415))、酿酒酵母转化酶(SUC2)信号肽(MLLQAFLFLLAGFAAKISA(SEQ ID N0:416))、MF-a (Prepro)(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSLEKR(SEQ ID NO:417))、MF-α (Pre) -apv(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APV(SEQ ID N0:418))、MF-a (Pre)-apv-SLEKR(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVSLEKR(SEQ ID NO:419)), MF- a (Prepro) - (EA)3(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSL EKR-EAEAEA(SEQ ID NO:420))、 aF信号肽(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-DETAQIPAEAVIGYSDLEG DFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKE-EGVSLEKR(SEQ ID NO:421))、KILMl 信号肽(MTKPTQVLVRSVSILFFITLLHLVVALNDVAGPAETAPVSLLPR(SE Q ID NO:422))、可抑制的酸性磷酸酶(PHOl)信号肽(MFSPILSLEIILALATLQSVFA (SEQID NO: 423))、黑曲霉 GOX 信号肽(MQTLLVSSLVVSLAAALPHYIR (SEQ ID NO: 424))、西方许旺酵母葡糖淀粉酶基因(GAMl)信号肽(MIFLKLIKSIVIGLGLVSAIQA(SEQ ID NO:425)),具有前导序列的人血清白蛋白(HSA)信号肽(MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR(SEQ IDNO:426))、具有前导序列的人血清白蛋白(HSA)信号肽(MKWVTFISLLFLFSSAYS (SEQID N0:427))、ISN 信号肽(MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA(SEQ ID N0:428))、IFN 信号肽(MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCDLP(SEQ ID NO: 429) )、HGH 信号肽(MAADSQTPWLLTFSLLCLLWPQEPGA (SEQ ID N0:430))、植物血细胞凝集素(PHA) (MKKNRMMMMIWSVGVVWMLLLVGGSYG(SEQ ID NO:431))、蚕溶菌酶(MQKLIIFALVVLCVGSEA(SEQID NO:432))、人溶菌酶(LYZl)(MKALIVLGLVLLSVTVQG(SEQ ID NO:433))、活化素受体 I 型(MVDGVMILPVUMIALPSPS(SEQ ID NO:434))、活化素受体 II 型受体(MGAAAKLAFAVFLISCSSG(SEQ ID NO:435))、巴斯德毕赤酵母免疫球蛋白结合蛋白(PpBiP) (MLSLKPSWLTLAALMYAMLLVVVPFAKPVRA(SEQ ID NO:436))和人抗体 3D6 轻链前导序列(MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC(SEQ ID NO:437))。参见Hashimoto 等，Protein Engineering 第 11 卷 n0.2 第 75 - 77 页，1998 ；0ka 等，Biosci Biotechnol Biochem.1999Nov ;63(11):1977-83 ;Gellissen 等，FEMS YeastResearch5(2005) 1079 - 1096 ；Ma 等，Hepatology.2005Dec;42(6):1355-63 ；Raemaekers等，Eur J Biochem.19990ctI; 265 (I): 394-403 ；Koganesawa 等，Protein Eng.(2001) 14(9):705-710 ;Daly 等,Protein Expr Purif.2006Apr;46(2):456-67 ；Damasceno等，Appl Microbiol Biotechnol (2007)74:381 - 389 和 Felgenhauer 等，Nucleic AcidsRes.1990Aug25; 18(16):4927，所述文献的每一篇文献通过引用整体并入本文)。还可将多亚基复合物分泌进入培养基而无需有效地连接至或融合至分泌信号。例如，已显示当在巴斯德毕赤酵母中表达时(即使未有效地连接至或融合至分泌信号的情况下)时，一些异源多肽被分泌进入培养基。此外，可使用本领域已知的方法从宿主细胞(所述细胞，例如，可以是优选的，如果较少分泌复合物的话)纯化多亚`基复合物。
[0209]可从培养基回收包含期望的多亚基复合物的培养基或细胞。任选地，可纯化分泌的蛋白质。例如可使用机械、化学、酶促和/或渗透法(例如，利用液氮冷冻，使用匀浆器，原生质球化，超声处理，在玻璃珠存在的情况下搅拌，使用去垢剂等)裂解包含期望的多亚基复合物的细胞。可使用本领域已知的方法浓缩、过滤、透析期望的多亚基复合物等。可基于例如其分子质量(例如，尺寸排阻色谱法)、等电点(例如，等电聚焦)、电泳迁移率(例如，凝胶电泳)、疏水相互作用层析(例如，HPLC)、电荷(例如，离子交换层析)、亲和力(例如，在抗体的情况下，结合蛋白A、蛋白G，和/或期望的抗体所结合的表位)和/或糖基化状态(例如，通过外源凝集素结合亲和力检测的)纯化期望的多亚基复合物。可进行多个纯化步骤来获得期望水平的纯度。在示例性实施方案中，期望的多亚基复合物可包含免疫球蛋白恒定结构域并且可使用蛋白A或蛋白G亲和、尺寸排阻色谱法以及对外源凝集素的结合的不存在(以除去糖基化形式)来纯化。任选地，可添加蛋白酶抑制剂例如苯甲磺酰氟(PMSF)来在纯化过程中抑制蛋白水解消化。
[0210]当被置于与另一个核酸序列的功能性关系中时，核酸是“有效地连接的”。例如，如果信号序列的DNA表达为参与多肽的分泌的前蛋白，则其有效地连接于多肽的DNA;如果启动子或增强子影响序列的转录，则其有效地连接至编码序列。一般而言，〃有效地连接的〃意指被连接的DNA序列是邻接的，以及在分泌前导序列的情况下，是邻接的并且在读框内。然而，增强子不必是邻接的。连接可通过在方便的限制性位点上连接或可选择地通过对于本领域技术人员来说是熟悉的PCR/重组法(Gateway? Technology ；
Invitrogen, Carlsbad Calif.)来实现。如果这样的位点不存在,贝U可按照常规实践使用合成寡核苷酸接头或连接体。期望的核酸(包括包含有效连接的序列的核酸)还可通过化学合成产生。
[0211]启动子是位于结构基因(通常在约100至1000bp内)的起始密码子上游(5’)的非翻译序列，其控制与它们有效连接的特定核酸序列的转录和翻译。这样的启动子分成几个种类:诱导型、组成型和阻抑启动子(所述启动子响应阻抑物的不存在而升高转录的水平)。诱导型启动子可响应培养条件下的一些变化(例如营养物的存在或不存在或温度的变化)而起始升高水平的从在它们控制之下的DNA的转录。
[0212]酵母启动子片段还可用作用于表达载体至酵母基因组的相同位点中的同源重组和整合的位点；可选择地可选择标记用作同源重组的位点。毕赤酵母属的转化描述于Cregg等(1985)Mol.Cell.Biol.5:3376-3385(将所述文献通过引用整体并入本文)中。
[0213]来自毕赤酵母属的适当的启动子的实例包括CUPl (通过培养基中铜的水平诱导的)、四环素诱导性启动子、硫胺素诱导性启动子、AOXl启动子(Cregg等(1989)Mol.Cell.Biol.9:1316-1323)、ICLl 启动子(Menendez 等(2003) Yeast20 (13): 1097-108)、3_ 磷酸甘油醛脱氢酶启动子(GAP) (Wa`terham 等(1997) Genel86 (I):37-44) ；and FLDl 启动子(Shen等(1998)Gene216(l):93-102)。GAP启动子是强组成型启动子，CUPU AOX和FLDl启动子是诱导型启动子。每一个前述参考资料通过引用整体并入本文。
[0214]其它酵母启动子包括ADH1、醇脱氢酶I1、GAL4、PH03、PH05、Pyk和来源于其的嵌合启动子。此外，非酵母启动子可用于本发明例如哺乳动物、昆虫、植物、爬行动物、两栖动物、病毒和禽类启动子。最常见地，启动子将包含哺乳动物启动子(潜在地对于表达的基因是内源性的)或将包含在酵母系统中提供高效转录的酵母或病毒启动子。
[0215]目标多肽不仅可直接重组产生，而且还可作为与异源多肽例如信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N末端上具有特定切割位点的其它多肽的融合多肽产生。一般而言，信号序列可以是载体的组件，或其可以是被插入载体的多肽编码序列的部分。优选地选择的异源信号序列是被识别的并且通过可在宿主细胞内获得的标准途径之一加工的序列。酿酒酵母α因子前-原信号已证明在多种重组蛋白从巴斯德毕赤酵母的分泌中是有效的。其它酵母信号序列包括α交配因子信号序列、转化酶信号序列和来源于其它分泌的酵母多肽的信号序列。此外，这些信号肽序列可被工程化以在二倍体酵母表达系统中提供增强的分泌。其它目标分泌信号还包括哺乳动物信号序列，所述信号序列对于待分泌的蛋白质可以是同源的，或对于待分泌的蛋白质可以是天然序列。信号序列包括前肽序列，在一些情况下可包括原肽序列。许多这样的信号序列在本领域是已知的，包括在免疫球蛋白链上发现的信号序列，例如Κ28前毒素原序列、PHA-E、FACE、人MCP-1、人血清白蛋白信号序列、人Ig重链、人 Ig 轻链等。例如，参见 Hashimoto 等 Protein Engll (2) 75 (1998);和 Kobayashi 等Therapeutic Apheresis2 (4) 257 (1998),所述文献的每一篇通过引用整体并入本文。
[0216]转录可通过将转录激活因子序列插入载体来增强。这些激活因子是DNA的顺式作用元件，通常为约10至300bp，其作用于启动子以增强其转录。转录增强子相对地不依赖于方向和位置，发现于转录单位的5’和3’，位于内含子中以及位于编码序列本身内。可将增强子在编码序列的5’或3’位置上剪接进入表达载体，但优选位于启动子的5’位置。
[0217]用于真核宿主细胞的表达载体还可包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这样的序列通常可获自翻译终止密码子的3’，其存在于真核或病毒DNA或cDNA的非翻译区中。这些区域包含转录为mRNA的非翻译部分中的多腺苷酸化片段的核苷酸区段。
[0218]包含上文所列的组件的一个或多个的适当载体的构建使用标准连接技术或PCR/重组法。切割、裁剪分离的质粒或DNA片段，以期望产生所需质粒的形式或通过重组法再连接所述片段。为了进行确认构建的质粒中的正确序列的分析，将连接混合物用于转化宿主细胞，适当时通过抗生素抗性(例如,氨节青霉素或Zeocin)选择成功的转化体。从转化体制备质粒，通过限制性内切核酸酶消化分析质粒和/或对质粒进行测序。
[0219]作为对片段的限制和连接的替代，基于att位点和重组酶的重组法可用于将DNA序列插入载体。这样的方法例如由Landy(1989)Ann.Rev.Biochem.58:913-949进行了描述；并且对于本领域技术人员来说是已知的。这样的方法利用通过λ与大肠杆菌编码的重组蛋白的混合物介导的分子间DNA重组。重组发生在相互作用的DNA分子上的特异性附着(att)位点之间。关于att位点的描述，参见Weisberg和Landy(1983)Site_SpecificRecombination in Pha ge Lambda, in Lambda II, ffeisberg, ed.(Cold Spring Harbor, N.Y.:Cold Spring Harbor Press),第211-250页。转换侧翼连接重组位点的DNA区段，以便在重组后，att位点是由每一个亲代载体供给的序列组成的杂交序列。重组可在具有任何拓扑结构的DNA之间发生。每一个前述参考资料通过引用整体并入本文。
[0220]可通过将目标序列连接至适当的载体中来将Att位点引入目标序列；通过使用特异性引物产生包含att B位点的PCR产物；产生克隆进入包含att位点的适当载体中的cDNA文库；等等。
[0221]单顺反子和多顺反子基因。单顺反子基因编码包含仅翻译成单一蛋白质的遗传信息的RNA。多顺反子基因编码包含翻译超过一种蛋白质的遗传信息的mRNA。多顺反子基因中编码的蛋白质可具有相同的或不同的序列或其组合。二顺反子或双顺反子是指编码两种蛋白质的多顺反子。多顺反子基因任选地包括一个或多个内核糖体进入位点(IRES)元件来有促进不依赖于帽的翻译起始，所述元件可位于可这样的位置中，所述位置可不依赖于键合至mRNA分子的5’末端的5’-帽结构来驱动下游蛋白质编码区的翻译。可使用任何已知的IRES序列(例如，病毒、真核生物或人工来源的)。例如，可使用基因间区域(IGR)中的蟋蟀麻痹病毒IRES序列，如Thompson等(2001)PNAS98:12972-12977中所描述的。任选地，IRES功能可通过遗传改变，例如通过引起eIF2激酶GCN2的组合成型表达或中断两个断裂的起始密码子tRNA(met)基因(同前)来赋予。
[0222]折叠，如本文中所用，是指多肽和蛋白质的三维结构，其中氨基酸残基之间的相互作用用于稳定结构。虽然非共价相互作用在决定结构中是非常重要的，但目标蛋白质通常具有通过两个半胱氨酸残基形成的分子内和/或分子间共价二硫键。对于天然存在的蛋白质和多肽或其衍生物和变体，正确折叠通常是导致最佳生物活性的排列，并且可方便地通过活性(例如配体结合、酶促活性等)的测定来监测。
[0223]在一些情况下，例如当期望的产物是合成来源时，基于生物活性的测定意义不大。这样的分子的正确折叠可基于物理性质、活力考虑、建模研究等来确定。
[0224]表达宿主还可通过引入编码一种或多种增强折叠和二硫键形成的酶即折叠酶、伴侣蛋白等的序列来进行修饰。这样的序列可使用本领域已知的载体、标记等来在酵母宿主细胞中组成型地或诱导型地表达。优选，通过靶向方法将序列(包括足以进行期望的表达模式的转录调控元件)稳定地整合在酵母基因组中。
[0225]例如，真核PDI不仅是蛋白质半胱氨酸氧化和二硫键异构化的高效催化剂而且还显示伴侣蛋白活性。PDI的共表达可有利于具有多个二硫键的活性蛋白质产生。还有利的是BIP(免疫球蛋白重链结合蛋白)、亲环素等的表达。在本发明的一个实施方案中，可从通过交配产生的酵母表达多亚基复合物,其中每一个单倍体亲代菌株表达不同的折叠酶,例如一个菌株可表达BIP，另一个菌株可表达PDI或其组合。
[0226]术语〃期望的蛋白质〃或〃靶蛋白质〃可互换使用并且通常是指异源多亚基蛋白质例如本文中描述的抗体(例如，人源化抗体)或其结合部分。
[0227]术语"抗体"包括具有与表位拟合或识别表位的特定形状的任何含多肽链的分子结构，其中一个或多个非共价结合相互作用稳定分子结构与表位之间的复合。原型抗体分子是免疫球蛋白，来自所有来源例如人、哨齿类动物、兔、牛、绵羊、猪、狗、其它哺乳动物、鸡、其它禽类等的所有类型的免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等被认为是“抗体”。用于产生用作根据本 明的起始材料的抗体的优选来源是兔。许多抗体编码序列已被描述；其它抗体可利用本领域公知的方法产生。其实例包括嵌合抗体、人抗体和其它非人哺乳动物抗体、人源化抗体、单链抗体例如scFv、骆能体、纳米抗体、IgNAR(来源于S鱼的单链抗体)、小模块免疫药物(SMIP)和抗体片段例如Fab、Fab’、F(ab’)2等。参见Streltsov VA,等，Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of anearly-developmental isotype, Protein Sc1.2005November ；14(11):2901-9.Epub2005年9 月 30 日；Greenberg A S,等,A new antigen receptor gene family that undergoesrearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature.1995年 3 月 9 日.9 ;374(6518): 168-73 ;Nuttall S D，等，Isolation of the new antigenreceptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of proteinloop libraries, Mol Immunol.2001 年 8 月；38 (4): 313-26 ;Hamers_Casterman C，等，Naturally occurring antibodies devoid of light chains，Nature.1993 年 6 月 3 日；363(6428):446-8 ；Gill D S，等，Biopharmaceutical drug discovery using novelprotein scaffolds, Curr Opin Biotechnol.2006 年 12 月；17 (6):653-8.Epub2006 年 10月19日。将每一个上述参数资料通过引用整体并入本文。
[0228]例如，抗体或抗原结合片段可通过遗传工程产生。在该技术中，与其它方法一样，抗体产生性细胞对期望的抗原或免疫原敏感。从抗体产生性细胞分离的信使RNA用作使用PCR扩增产生cDNA的模板。通过将扩增的免疫球蛋白cDNA的适当区段插入表达载体来产生载体的文库，每一个载体包含保留初始抗原特异性的一个重链基因和一个轻链基因。通过将重链基因文库与轻链基因文库组合来构建重组文库。这导致共表达重链和轻链(类似于抗体分子的Fab片段或抗原结合片段)的克隆的文库。将携带这些基因的载体共转染入宿主细胞。当将抗体基因合成引入转染的宿主时，重链和轻链蛋白质自组装以产生可通过利用抗原或免疫原的筛查来检测的活性抗体。
[0229]目标抗体编码序列包括由天然序列编码的那些序列，以及因遗传密码的简并性而在序列上与公开的核酸不相同的核酸及其变体。变体多肽可包括氨基酸(aa)置换、添加或缺失。氨基酸置换可以是保守氨基酸置换，或消除非必需氨基酸，例如以改变糖基化位点或使错折叠减少至最低程度(通过一个或多个对于功能不是必需的半胱氨酸残基的置换或缺失)的置换。可这样设计变体以使其保留蛋白质的特定区域(例如，功能结构域、催化氨基酸残基等)的生物活性或具有增强的所述生物活性。变体还包括本文中公开的多肽的片段，特别地生物活性片段和/或对应于功能结构域的片段。用于克隆的基因的体外诱变的技术是已知的。还包括在主题发明中的是已使用常规分子生物学技术修饰以改善它们对蛋白水解消化的抗性或最优化溶解度性质或使它们更适合作为治疗剂的多肽。
[0230]嵌合抗体可通过重组方法，通过将获自一个物种的抗体产生性细胞的可变轻链和重链区('和Vh)与来自另个物种的抗体产生性细胞的恒定轻链和重链区组合来进行制备。通常地，嵌合抗体利用啮齿类动物或兔可变区和人恒定区，以产生具有大部分人结构域的抗体。这样的嵌合抗体的产生在本领域是公知的，并且可通过标准方法(如例如美国专利N0.5，624，659 (通过引用并入本文)中所描述的)来实现。还预期本发明的嵌合抗体的人恒定区可选自 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgG6、IgG7、IgG8、IgG9、IgGlO、IgGll、IgG12、IgG13、IgG14、IgG15、IgG16、IgG17、IgG18 或 IgG19 恒定区。
[0231]人源化抗体经工程化以包含甚至更多人样免疫球蛋白结构域，并且仅包含动物来源的抗体的互补性决定区。这通过仔细检查单克隆抗体的可变区的高变环的序列，将它们与人抗体链的结构拟合来实现。虽然表面上复杂，但过程在实践上简单明了。参见，例如美国专利N0.6，187，287 (通过引用整体并入本文)。人源化抗体的方法先前已在公布的美国专利N0.7935340(将其公开内容通过引用整体并入本文)中进行了描述。在一些情况下，是否需要额外的兔框架残基来维持活性的确定是必需的。在一些情况下，人源化抗体仍然需要保留一些至关重要的兔框架残基来使亲`和力或活性的损失减小至最低程度。在这些情况下，必需将来自人种系序列的单个或多个框架氨基酸变回原始兔氨基酸以具有期望的活性。实验性测定这些变化以鉴定哪个兔残基是保持亲和力和活性所必需的。
[0232]除了完整的免疫球蛋白(或它们的重组对应部分)外，可合成包含表位结合位点(例如，Fab’、F(ab’)2或其它片段)的免疫球蛋白片段。"片段"或最小免疫球蛋白可使用重组免疫球蛋白技术来设计。例如用于本发明的"Fv"免疫球蛋白可通过合成融合的可变轻链区和可变重链区来产生。抗体的组合也是有益的，例如双链抗体，其包含两个不同的Fv特异性。在本发明的另一个实施方案中，免疫球蛋白片段包括SMIP (小分子免疫药物)、骆鸵体、纳米抗体和IgNAR。
[0233]免疫球蛋白及其片段可被翻译后修饰来例如添加效应物部分例如化学连接体、可检测部分例如荧光染料、酶、毒素、底物、生物发光物质、放射性物质、化学发光部分等，或特异性结合部分例如链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白或生物素等可用于本发明的本发明的方法和组合物。其它效应分子的实例提供于下文中。
[0234]产物相关变体:存在于期望的产物的制剂中并且与期望的产物相关的除期望的产物(例如，期望的多亚基复合物)外的产物。示例性产物相关变体包括截短的或延长的肽，具有与期望的糖基化不同的糖基化的产物(例如，如果糖基化产物是期望的，则任何糖基化产物可被认为是产物相关变体)，具有异常化学计量的复合物，不正确装配，异常二硫键，异常或不完全折叠，聚集，蛋白酶切割或其它异常。示例性产物相关变体可显示分子质量(例如，通过尺寸排阻色谱法检测的)、等电点(例如，通过等电聚焦检测的)、电泳迁移率(例如，通过电泳检测的)、磷酸化状态(例如，通过质谱检测的)、荷质比(例如，通过质谱检测的)、蛋白水解片段的质量或身份(例如，通过质谱或凝胶电泳检测的)、疏水性(例如，通过HPLC检测的)、电荷(例如，通过离子交换层析检测的)、亲和力(例如，在抗体的情况下，通过对蛋白A、蛋白G和/或期望的抗体所结合的表位的结合检测的)以及糖基化状态(例如，通过外源凝集素结合亲和力检测的)的一项或多项的改变。当期望的蛋白质是抗体时，术语产物相关变体可包括糖-重链和/或半抗体种类(下文中描述的)。[0235]示例性产物相关变体包括包含异常二硫键的变体形式。例如，大多数IgGl抗体分子通过总共16个链内和链间二硫键来稳定，所述二硫键在重链和轻链中稳定IgG结构域的折叠，而链间二硫键稳定重链与轻链之间的缔合。其它抗体类型同样地包含特定性稳定链内和链间二硫键。此外，一些抗体(包括本文中公开的Ab-A和Ab-B)包含称为非经典二硫键的额外二硫键。因此，异常链间二硫键可因稳定共价连接的不存在和/或对额外亚基的二硫连接而导致异常的复杂的化学计量。此外，异常二硫键(无论链间还是链内)可降低抗体的结构稳定性，这可导致减小的活性、减小的稳定性、增加的形成聚集体的倾向和/或增加的免疫原性。包含异常二硫键的产物相关变体可以以多种方式检测，包括非还原变性SDS-PAGE、毛细管电泳、cIEX、质谱法(任选针利用化学修饰来产生游离半胱氨酸的质量漂移)、尺寸排阻色谱法、HPLC、光散射的改变以及本领域已知的任何其它适当的方法。参见，例如，The Protein Protocols Handbook2002,第 V 部分，581-583，DO1: 10.1385/1-59259-169-8:581 ；
[0236]半抗体、半抗体种类或HlLl是指蛋白质复合物，所述蛋白质复合物包括单个抗体重链和单个抗体轻链，但在第二抗体重链与第二抗体轻链之间不存在共价键。两个半抗体可在一些条件下保持非共价缔合(其可产生与完全抗体相似的行为，例如通过尺寸排阻色谱法测定的表观分子量)。类似地，H2L1是指包括两个抗体重链和单个抗体轻链，但不存在对第二抗体轻链的共价连接的蛋白质复合物；这些复合物还可以与另一个抗体轻链非共价缔合(并且同样地产生与完全抗体相似的行为)。与完全抗体一样,半抗体种类和H2L1种类可在还原条件下解离成单个重链和轻链。半抗体种类和H2L1种类可在非还原SDS-PAGE凝胶上被检测为以比完全抗体更低的表观分子量迁移的种类，例如HlLl以约一半的完全抗体的表观分子量(例如，约75kDa)迁移。
[0237]糖-重链变体是指有时存在于抗体制剂中并且包含至少部分Fe序列的糖基化产物相关变体。糖-重链变体的特征在于可通过SDS-PAGE观察的减小的电泳迁移率(相对于正常重链)、外源凝集素结合亲和力、对抗-Fe抗体的结合以及及如通过尺寸排阻色谱法测定的包含糖-重链变体的抗体复合物的显著更高的分子量。参见2011年8月31日提交的美国临时申请序列号61/525，307 (代理人案卷号67858.730200)(将其通过引用整体并入本文)。
[0238]术语"长时间稳定地表达期望的分泌的异源多肽的多倍体酵母"是指在阈值表达水平上(通常至少50-500mg/L(在培养约90小时后)和优选显著更大)分泌所述多肽至少数天至I周，更优选至少I个月，更优选至少1-6个月，更优选超过I年的酵母培养物。
[0239]术语"分泌期望量的重组多肽的多倍体酵母培养物"是指稳定地或长期分泌至少50-500mg/L、最优选500_1000mg/L或更多的培养物。
[0240]如果多核苷酸序列按照遗传密码的翻译产生多肽序列(即，多核苷酸序列“编码”多肽序列，则多核苷酸序列“对应”于多肽序列，如果两个序列编码相同多肽序列，则一个多核苷酸序列〃对应〃于另一个多核苷酸序列。
[0241]DNA构建体的〃异源〃区或结构域是未被天然地发现与更大的分子结合的更大DNA分子内的DNA的可辨认区段。因此，当异源区域编码哺乳动物基因时，基因通常侧翼连接有在来源生物的基因组中不侧翼连接哺乳动物基因组DNA的DNA。异源区的另一个实例是其中未天然地发现编码序列本身的构建体(例如，其中基因组编码序列包含内含子的cDNA，或具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。等位基因变型或天然存在的突变事件不产生本文中定义的DNA的异源区域。
[0242]"编码序列"是(根据遗传密码)对应于或编码蛋白质或肽序列的密码子的框内序列。两个编码序列彼此对应，如果序列或它们的互补序列编码相同氨基酸序列的话。与适当的调控序列连接的编码序列可被转录并且翻译成多肽。多腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’。"启动子序列"是能够结合细胞中的RNA聚合酶并且起始下游(3’方向)编码序列的转录的DNA调控区。启动子序列任选地包含用于进行编码序列的转录的调控分子(例如，转录因子)的结合的额外位点。当RNA聚合酶结合细胞中的启动子并且将编码序列转录成mRNA时，编码序列处于启动子序列的"控制之下"或"有效地连接至启动子，所述mRNA随后被翻译成由编码序列编码的蛋白质。
[0243]载体被用于将外`来序列例如DNA、RNA或蛋白质引入生物或宿主细胞。常见载体包括重组病毒(用于多核苷酸)和脂质体(用于多肽)。"DNA载体〃是可将另一个多核苷酸区段连接至其以进行连接区段的复制的复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒。〃表达载体〃是包含可指导适当的宿主细胞进行多肽合成的调控序列的DNA载体。这通常意指结合RNA聚合酶并且起始mRNA的转录的启动子，以及引导mRNA至多肽的翻译的核糖体结合位点和起始信号。将多核苷酸序列在适当的位点和按正确的读框整合到表达载体，随后利用载体转化适当的宿主细胞使得能够产生由所述多核苷酸序列编码的多肽。
[0244]多核苷酸序列的"扩增"是多个拷贝的特定核酸序列的体外产生。扩增序列通常以DNA的形式存在。多种用于进行这样的扩增的技术描述于下列综述论述(将所述综述论述的每一篇通过引用整体并入本文):Van Bruntl990, Bio/Technol.，8 (4): 291-294 ;以及Gill 和 Ghaemi, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids.2008Mar; 27 (3): 224-43 中。聚合酶链式反应或PCR是核酸扩增的原型，并且此处PCR的使用应当被认为是其它适当扩增技术的范例。
[0245]大多数脊椎动物(包括哺乳动物)的抗体的一般结构现已得到良好的理解(Edelman, G.M., Ann.N.Y.Acad.Sc1.，190:5 (1971))。常规抗体由两个分子量约 23，000 道尔顿(〃轻链〃)的相同多肽轻链和两个分子量约53，000-70，000(〃重链〃)的相同重链组成。4个链通过"Y"构型中的二硫键连接在一起，在所述"Y"构型中轻链括入始于"Y"构型的口部的重链。〃Y〃构型的〃分支〃部分称为Fab区；〃Υ〃构型的茎部分称为F。区。氨基酸序列取向从"Y"构型的顶部的N末端延伸至每一个链的底部的C末端。N末端具有拥有对于引发其的抗原的特异性的可变区，并且在长度上为约100个氨基酸，在轻链与重链之间以及抗体间存在微小变异。
[0246]可变区在每一条链中连接至延续链的剩余长度的恒定区，并且特定种类的抗体内的恒定区不随抗体的特异性(即，引发其的抗原)而变化。存在5个已知大类的决定免疫球蛋白分子的种类的恒定区(对应于Y、μ、α、δ、ε重链恒定区的IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)。恒定区和中类决定抗体的随后效应子功能，包括补体的活化(Kabat, E.A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry,第 2版，第 413-436 页,Holt, Rinehart, Winston (1976))以及其它细胞反应(Andrews, D.ff.,等，Clinical Immunobiology,第 1-18 页,W.B.Sanders (1980) ；Kohl, S.,等，Immunology, 48:187(1983));然而可变区决定其与哪个抗原反应。轻链被分类为κ和入。可将每一个重链种类与K或λ轻链配对。轻链与重链彼此共价键合，并且当免疫球蛋白通过杂交瘤或通过B细胞产生时，两个重链的“尾”部分通过共价二硫键彼此键合。
[0247]措辞”可变区〃或"VR"是指抗体中每一对轻链和重链内直接参与抗体对抗原的结合的结构域。每一个重链在一个末端具有可变结构域(Vh)，随后许多恒定结构域。每一个轻链在一个末端具有可变结构域并且在其另一末端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。
[0248]措辞”互补性决定区〃、〃高变区〃或〃⑶R"是指抗体的轻链或重链的可变区内发现的高变区或互补性决定区(⑶幻的一个或多个(See Kabat, E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes ofHealth, Bethesda, Md., (1987))。这些表达包括如由Kabat等定义的高变区("Sequencesof Proteins of Immunological Interest, ^Kabat E.,等，US Dept, of Health and HumanServices, 1983)或抗体的三维结构中的高变环(hypervariable loop) (Chothia和 Lesk, JMol.Biol.196901-917 (1987))。每一条链中的CDR通过框架区保持紧密靠近，并且与来自另一条链的CDR —起促成了抗原结合位点的形成。在CDR内，存在已被描述为选择性决定区(SDR)的选择氨基酸，所述氨基酸代表了在抗体-抗原相互作用中由CDR使用的至关重要的接触残基(Kashmiri, S., Methods, 36:25-34 (2005))。
[0249]措辞”框架区〃或"FR"是指抗体的轻链和重链的可变区内的框架区的一个或多个(参见Kabat, E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md.，(1987))。这些表达包括插入在抗体的轻链和重链的可变区内的CDR之间的那些氨基酸序列区。
[0250]抗-NGF抗体及其具有对于NGF的结合活性的片段
[0251]杭体Abl
[0252]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合和/或抑制或预防疼痛的治疗有效量，使用单独的或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合的抗体Abl或其片段，或结合与Abl所结合的表位相同的或与之重叠的表位的抗体或抗体片段(例如下文中所示的)治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法。在一个实施方案中，本发明包括具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列的嵌合抗体:ALVMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASQNIYSNLAWYQQRPGQRPKLLIYGASNLDAGVPSRFRGSGSGTEYTLTISDLECDDVGTYYCQSAFDSDSTENTFGGGTEVVVKR(SEQ ID NO:1)。
[0253]本发明任选地涉及利用单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列的嵌合抗体:ALVMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASQNIYSNLAWYQQRPGQRPKLLIYGASNLDAGVPSRFRGSGSGTEYTLTISDLECDDVGTYYCQSAFDSDSTENTFGGGTEWVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:2)。
[0254]本发明任选地涉及单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变重链序列的嵌合抗体:
[0255]QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGVITSIGSTVYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGYDDYDEMTYFNIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:3)。
[0256]本发明任选地涉及单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列的嵌合抗体:
[0257]QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGVITSIGSTVYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGYDDYD EMTYFNIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:4)。
[0258]本发明任选地涉及单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包含对应于SEQ ID NO:1的可变轻链序列或SEQ ID NO: 2的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID N0:3的可变重链序列或SEQ ID N0:4的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体或其片段包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0259]本发明任选地涉及单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体是具有对于NGF的结合特异性的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQID N0:3或SEQ ID NO:4的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0260]在本发明的其它实施方案中，用于治疗或预防疼痛的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO:1的可变轻链序列或SEQ ID NO: 2的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。[0261]本发明任选地涉及单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括具有对于NGF的结合特异性的片段，其包含对应于SEQ ID NO:3的可变重链序列或SEQ ID N0:4的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:8, SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0262]本发明还任选地涉及包括本文中描述的抗体片段的一个或多个的抗体片段。在本发明的一个实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的一个、二个、三个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO:1的可变轻链区、SEQID NO: 3的可变重链区、SEQ ID NO:1的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 5,SEQ IDN0:6和SEQ ID NO:7)以及SEQ ID NO:3的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID N0:8、SEQID NO:9 和 SEQ ID NO:10)。
[0263]在本发明的特别优选实施方案中，嵌合抗-NGF抗体是Abl，其包含SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:4或可选择地由SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:4组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0264]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，本文中使用的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段或结合与Abl所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或单价抗体片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Abl而言，Fab片段包括SEQ ID NO:1的可变轻链序列和SEQ ID N0:3的可变重链序列。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID N0:1和/或SEQ ID N0:3的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0265]在本文(下文)中描述的本发明的一个任选实施方案中，Fab片段可通过Abl的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，抗-NGF抗体例如Abl或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NS0或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯`德毕赤酵母。
[0266]杭体 Ab2
[0267]本发明任选地涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括具有对于NGF的结合特异性的嵌合或人源化抗体，其中抗体是抗体Ab2或其片段，或结合与Ab2所结合的表位相同的或与之重叠的表位的抗体或抗体片段(例如下文中所示的)。在一个实施方案中，本发明包括具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列的嵌合或人源化抗体:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLDAGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQSAFDSDSTENTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:11)。
[0268]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列的嵌合或人源化抗体:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLDAGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQSAFDSDSTENTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:12)。[0269]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列的嵌合或人源化抗体:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYAMSWVRQAPGKGLEWVGVITSIGSTVYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYDDYDEMTYFNIffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)。
[0270]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列的嵌合或人源化抗体:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYAMSWVRQAPGKGLEWVGVITSIGSTVYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYDDYDEMTYFNIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:14)。
[0271]本发明还任选地涉及用于治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO: 11的可变轻链序列或SEQ ID NO: 12的轻链序列的互补性决定区(⑶R，或高变区)的SEQ ID NO: 15,SEQ ID N0:16和SEQ ID NO: 17的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO: 13的可变重链序列或SEQ ID NO: 14的轻链序列的互补性决定区(⑶R，或高变区)的SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 20的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体或其片段包含⑶R、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0272]本发明还任选地涉及用于治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID N0:11或SEQ ID NO: 12的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0273]在本发明的其它实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段任选地包含对应于SEQ ID NO: 11的可变轻链序列或SEQID NO: 12的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0274]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片 段任选地包含对应于SEQ ID NO: 13的可变重链序列或SEQID NO: 14的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20的多肽序列一个或多个，或可选择地由其组成。
[0275]本发明还任选地涉及包括本文中描述的抗体片段的一个或多个的抗体片段。在本发明的一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO: 11的可变轻链区、SEQ ID NO: 13的可变重链区、SEQ ID NO: 11的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16 和 SEQ ID NO: 17)和 SEQ ID NO: 13的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20) ?[0276]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗-NGF抗体是Ab2，其包含SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 14或可选择地由SEQ IDN0:12和SEQ ID NO: 14组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0277]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，用于治疗或预防疾病和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段或结合与Ab2所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或单价抗体片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Ab2而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 11的可变轻链序列和SEQ ID NO: 13的可变重链序列。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 11和/或SEQ IDNO: 13的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0278]在本文(下文)中描述的本发明的一个任选实施方案中，Fab片段可通过Ab2的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，抗-NGF抗体例如Ab2或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NS0或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0279]杭体 Ab3
[0280]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合而未明显抑制NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括具有对于NGF的结合特异性的嵌合或人源化抗体，其中抗体是Ab3或其片段，或结合与Ab3所结合的表位相同的或与之重叠的表位的抗体或抗体片段(例如下文中所示的)。在一个实施方案中，本发明包括具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列的嵌合抗体:AVLTQTPSPVSAAMGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPRLLIYDASN LPSGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDADNAFGGGTEVVVKR(SEQ ID N0:21)。
[0281]本发明还包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，所述抗体具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:AVLTQTPSPVSAAMGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPRLLIYDASNLPSGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDADNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:22)。
[0282]本发明还包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，所述抗体具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCAGGGGSIYDIffGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:23)。
[0283]本发明还包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，所述抗体具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCAGGGGSIYDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:24)。
[0284]本发明还任选地涉及用于治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO: 21的可变轻链序列或SEQ ID NO: 22的轻链序列的互补性决定区(⑶R，或高变区)的SEQ ID NO:25,SEQ ID N0:26和SEQ ID NO:27的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO: 23的可变重链序列或SEQ ID NO: 24的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 28,SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 30的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体或其片段包含⑶R、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0285]本发明还任选地涉及用于治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID N0:21或SEQ ID N0:22的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:23或SEQ ID NO:24的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0286]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO:21的可变轻链序列或SEQ IDNO:22的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:25,SEQ ID N0:26和SEQID NO:27的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0287]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO:23的可变重链序列或SEQ IDNO: 24的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 28,SEQ ID NO: 29和SEQID NO:30的多肽序列的一个或多个`，或可选择地由其组成。
[0288]本发明还任选地涉及包括本文中描述的用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段的一个或多个的抗体片段。在本发明的一个实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO:21的可变轻链区、SEQ ID NO:23的可变重链区、SEQ ID NO:21的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO:25,SEQ ID N0:26 和 SEQ ID NO:27)和 SEQ ID NO:23的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO:28, SEQ ID N0:29和SEQ ID NO:30) ?
[0289]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗-NGF抗体是Ab3，其包含SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 24或可选择地由SEQ ID NO: 22和SEQ ID N0:24组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0290]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，用于治疗或预防疾病和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段或结合与Ab3所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或单价抗体片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Ab3而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 21的可变轻链序列和SEQ ID NO: 23的可变重链序列。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 21和/或SEQ IDNO:23的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0291]在本文(下文)中描述的本发明的一个任选实施方案中，Fab片段可通过Ab3的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，抗-NGF抗体例如Ab3或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CHO、NSO或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0292]杭体Ab4
[0293]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合而未明显抑制NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括具有对于NGF的结合特异性的嵌合或人源化抗体，其中抗体是抗体Ab4或其片段，或结合与Ab4所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或抗体片段(例如下文中所示的)。在一个实施方案中，本发明包括用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列:
[0294]DIQMTQSPSTLSASV⑶RVTITCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGKAPKLLIYDASNLPSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLGDYDDDADNAFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:31)。
[0295]本发明还包括用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGKAPKLLIYDASNLPSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCL⑶YDDDADNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:32)。
[0296]本发明还包括用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGGGSIYDIffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:33)。
[0297]本发明还包括用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGGGSIYDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:34)。
[0298]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO:31的可变轻链序列或SEQ ID NO:32的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:35,SEQ ID N0:36和SEQ ID NO:37的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO:33的可变重链序列或SEQ ID NO:34的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:38, SEQ ID N0:39和SEQ ID N0:40的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体或其片段包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0299]本发明还任选地涉及用于 治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体包含SEQ IDN0:31或SEQ ID NO:32的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:33或SEQ ID NO:34的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0300]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO:31的可变轻链序列或SEQ IDNO:32的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:35,SEQ ID N0:36和SEQID NO:37的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0301]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 33的可变重链序列或SEQ IDNO: 34的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 38,SEQ ID NO: 39和SEQID NO:40的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。[0302]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID N0:31的可变轻链区、SEQ ID NO:33的可变重链区、SEQ ID N0:31的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO:35,SEQ ID N0:36 和 SEQ ID NO:37)和 SEQ ID NO:33的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO:38, SEQ ID N0:39和SEQ ID NO:40) ?
[0303]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合和人源化抗-NGF抗体是Ab4，其包含SEQ ID NO: 32和SEQ ID NO: 34或可选择地由SEQ IDN0:32和SEQ ID NO:34组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0304]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，用于治疗或预防疾病和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段或结合与Ab 14所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或单价抗体片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Ab4而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 31的可变轻链序列和SEQ IDNO: 33的可变重链序列。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 31和/或SEQ ID NO:33的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0305]在本文(下文)中描述的本发明的一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过Ab4的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，抗-NGF抗体例如Ab4或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NS0或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0306]杭体Ab5
[0307]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体任选地包括抗体Ab5或其片段，或结合与Ab5所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或抗体片段(例如下文中所示的)。在一个实施方案中，本发明包括具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列的嵌合抗体:AYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSIYSNLAWYQQRPGQPPKLLIYDASTLESGVPSRFKGSGSGTEYTLTISGVECADAASYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTEVVVKR(SEQ ID NO:41)。
[0308]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:AYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSIYSNLAffYQQRPGQPPKLLIYDASTLESGVPSRFKGSGSGTEYTLTISGVECADAASYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:42)。
[0309]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变重链序列:QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSNYAVGffVRQAPGKGLEWIGIIGRNGNTWYASffARGRFTISKTSTTVDLKITSPTSEDTATYFCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:43)。
[0310]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSNYAVGffVRQAPGKGLEWIGIIGRNGNTWYASffARGRFTISKTSTTVDLKITSPTSEDTATYFCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQID NO:44)。
[0311]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO:41的可变轻链序列或SEQ ID NO:42的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:45,SEQ ID N0:46和SEQ ID N0:47的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO:43的可变重链序列或SEQ ID N0:44的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:48, SEQ ID N0:49和SEQ ID N0:50的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体或其片段任选地包含CDR、可变重链和可变`轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0312]本发明还任选地涉及用于治疗疼痛和特定疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID N0:41或SEQ ID N0:42的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:43或SEQ ID N0:44的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0313]在本发明的其它实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO:41的可变轻链序列或SEQ ID NO:42的轻链序列的互补性决定区(⑶R，或高变区)的SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46和SEQ ID NO: 47的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0314]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID N0:43的可变重链序列或SEQ IDN0:44的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:48,SEQ ID N0:49和SEQID NO:50的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0315]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO:41的可变轻链区、SEQ ID NO:43的可变重链区、SEQ ID NO:41的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO:45,SEQ ID N0:46 和 SEQ ID NO:47)和 SEQ ID NO:43的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO:48, SEQ ID N0:49和SEQ ID NO:50) ?
[0316]在本发明的特别优选实施方案中，任选地包括的用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗-NGF抗体是Ab5，其包含SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:44或可选择地由SEQID N0:42和SEQ ID N0:44组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0317]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，用于治疗或预防疾病和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段或结合与Ab5所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或抗体片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Ab5而言，Fab片段包括SEQ ID NO:41的可变轻链序列和SEQ ID N0:43的可变重链序列。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 41和/或SEQ ID NO: 43的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0318]在本文(下文)中描述的本发明的一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过Ab5的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，抗-NGF抗体例如Ab5或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NS0或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。`
[0319]杭体 Ab6
[0320]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体任选地包括Ab6或其片段，或结合与Ab6所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或抗体片段(例如下文中所示的)。在一个实施方案中，本发明包括具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列的嵌合或人源化抗体:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:51)。
[0321]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:52)。
[0322]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:53)。[0323]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:54)。
[0324]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO:51的可变轻链序列或SEQ ID NO:52的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO:53的可变重链序列或SEQ ID NO:54的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:59和SEQ ID N0:60的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体或其片段任选地包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0325]本发明还任选地涉及用于治疗疼痛和特定疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:51或SEQ ID NO: 52的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:53或SEQ ID NO:54的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0326]在本发明的其它实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID N0:51的可变轻 链序列或SEQ ID NO:52的轻链序列的互补性决定区(⑶R，或高变区)的SEQ ID NO: 55,SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0327]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO:53的可变重链序列或SEQ IDNO: 54的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 58,SEQ ID NO: 59和SEQID NO:60的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0328]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO:51的可变轻链区、SEQ ID NO:53的可变重链区、SEQ ID NO:51的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO:55,SEQ ID N0:56 和 SEQ ID NO:57)和 SEQ ID NO:53的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:59和SEQ ID NO:60) ?
[0329]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗-NGF抗体是Ab6，其包含SEQ ID NO: 52和SEQ ID NO: 54或可选择地由SEQ IDN0:52和SEQ ID NO:54组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0330]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，用于治疗或预防疾病和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段或结合与Ab6所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或单价抗体片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Ab6而言，Fab片段包括SEQ ID NO:51的可变轻链序列和SEQ ID NO:53的可变重链序列。本发明的该任选实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 51和/或SEQID NO: 53的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0331]在本文(下文)中描述的本发明的一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过Ab6的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，抗-NGF抗体例如Ab6或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NSO或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0332]杭体Ab7
[0333]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括Ab7或其片段，或结合与Ab7所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或抗体片段(例如下文中所示的)。在一个实施方案中，本发明包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，所述抗体具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列:ADVVMTQTPASVSQPVGGTVTIKCQASEDIYNLLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPSRFKGSGSGTEYTLTISGLECADAATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTEVVVKR(SEQ ID N0:61)。
[0334]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，所述抗体具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:ADVVMTQTPASVSQPVGGTVTIKCQASEDIYNLLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPSRFKGSGSGTEYTLTISGLECADAATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:62)。
`[0335]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，所述抗体具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变重链序列:QEQLKESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYYASWVKGRFTISRTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSYAAYGGYPATFDPWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:63)。
[0336]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，所述抗体具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:QEQLKESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYYASWVKGRFTISRTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSYAAYGGYPATFDPWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:64)。
[0337]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO:61的可变轻链序列或SEQ ID N0:62的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66和SEQ ID NO: 67的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO:63的可变重链序列或SEQ ID N0:64的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:68, SEQ ID N0:69和SEQ ID N0:70的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体或其片段任选地包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0338]本发明还任选地涉及用于治疗疼痛和特定疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:61或SEQ ID N0:62的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:63或SEQ ID N0:64的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0339]在本发明的其它实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO:61的可变轻链序列或SEQ ID NO:62的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:65, SEQ ID N0:66和SEQ IDNO:67的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0340]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID N0:63的可变重链序列或SEQ IDN0:64的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:68,SEQ ID N0:69和SEQID NO:70的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0341]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO:61的可变`轻链区、SEQ ID NO:63的可变重链区、SEQ ID NO:61的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO:65,SEQ ID N0:66 和 SEQ ID NO:67)和 SEQ ID NO:63的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO:68, SEQ ID N0:69和SEQ ID NO:70) ?
[0342]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗-NGF抗体是Ab7，其包含SEQ ID NO: 62和SEQ ID NO: 64或可选择地由SEQ ID NO: 62和SEQ ID N0:64组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0343]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，用于治疗或预防疾病和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段或结合与Ab7所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或单价抗体片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Ab7而言，Fab片段包括SEQ ID NO:61的可变轻链序列和SEQ ID NO:63的可变重链序列。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID N0:61和/或SEQ IDNO:63的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0344]在本文(下文)中描述的本发明的一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过Ab7的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，抗-NGF抗体例如Ab7或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NSO或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。[0345]杭体Ab8
[0346]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括Ab8或其片段，或结合与Ab8所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或片段(例如下文中所示的)。在一个实施方案中，本发明包括具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列的嵌合或人源化抗体:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDIYNLLAWYQQKPGKVPKLLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:71)。
[0347]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，所述抗体具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDIYNLLAWYQQKPGKVPKLLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:72)。
[0348]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，所述抗体具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变重链序列:QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYYASSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSYAAYGGYPATFDPWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:73)。
[0349]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，所述抗体具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYYASSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSYAAYGGYPA TFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:74)。
[0350]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO:71的可变轻链序列或SEQ ID NO:72的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76和SEQ ID NO: 77的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO: 73的可变重链序列或SEQ ID NO: 74的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:78, SEQ ID N0:79和SEQ ID N0:80的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个任选实施方案中，本发明的抗体或其片段包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0351]本发明还任选地涉及用于治疗疼痛和特定疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:71或SEQ ID NO: 72的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:73或SEQ ID NO:74的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0352]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 71的可变轻链序列或SEQ IDNO:72的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:75,SEQ ID N0:76和SEQID NO:77的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0353]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO:73的可变重链序列或SEQ IDNO: 74的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 78,SEQ ID NO: 79和SEQID NO:80的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0354]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO:71的可变轻链区、SEQ ID NO:73的可变重链区、SEQ ID NO:71的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO:75,SEQ ID N0:76 和 SEQ ID NO:77)和 SEQ ID NO:73的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO:78, SEQ ID N0:79和SEQ ID NO:80) ?
[0355]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗-NGF抗体是Ab8，其包含SEQ ID NO: 72和SEQ ID NO: 74或可选择地由SEQ IDN0:72和SEQ ID NO:74组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0356]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，用于治疗或预防疾病和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Ab8而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 71的可变轻链序列和SEQ IDNO: 73的可变重链序列或结合与Ab8所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或单价抗体片段。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID N0:71和/或SEQ IDNO: 73的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
`[0357]在本文(下文)中描述的本发明的一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过AbS的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，抗-NGF抗体例如Ab8或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NSO或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0358]杭体 Ab9
[0359]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括Ab9或其片段，或结合与Ab9所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或抗体片段(例如下文中所示的)。在一个任选实施方案中，本发明包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列:AYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASENIGSYLAWYQQKPGQPPELLIYRASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTEVVVKR(SEQ ID N0:81)。
[0360]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:AYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASENIGSYLAWYQQKPGQPPELLIYRASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:82)。
[0361]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变重链序列:QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYASWAKGRFTISKTSTTVELKITSPTIEDTATYFCARETPVNYYLDIffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:83)。
[0362]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYASffAKGRFTISKTSTTVELKITSPTIEDTATYFCARETPVNYYLDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:84)。
[0363]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO:81的可变轻链序列或SEQ ID N0:82的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86和SEQ ID NO: 87的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO:83的可变重链序列或SEQ ID N0:84的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:88, SEQ ID N0:89和SEQ ID N0:90的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个任选实施方案中，本发明的抗体或其片段包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0364]本发明还任选地涉及用于治疗疼痛和特定疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:81或SEQ ID N0:82的多肽序列，或可选`择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:83或SEQ ID N0:84的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0365]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID N0:81的可变轻链序列或SEQ IDN0:82的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:85,SEQ ID N0:86和SEQID NO:87的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0366]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID N0:83的可变重链序列或SEQ IDN0:84的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:88,SEQ ID N0:89和SEQID NO:90的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0367]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO:81的可变轻链区、SEQ ID NO:83的可变重链区、SEQ ID NO:81的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO:85,SEQ ID N0:86 和 SEQ ID NO:87)和 SEQ ID NO:83的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO:88, SEQ ID N0:89和SEQ ID NO:90) ?
[0368]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗-NGF抗体是Ab9，其包含SEQ ID NO: 82和SEQ ID NO: 84或可选择地由SEQ ID NO: 82和SEQ ID N0:84组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。[0369]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，用于治疗或预防疾病和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Ab9而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 81的可变轻链序列和SEQ IDNO:83的可变重链序列或结合与Ab9所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或单价抗体片段。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID NO:81和/或SEQ IDNO:83的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0370]在本文(下文)中描述的本发明的一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过Ab9的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个任选实施方案中，抗-NGF抗体例如Ab9或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NSO或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0371]杭体 AblO
[0372]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括AblO或其片段，或结合与AblO所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或抗体片段(例如下文中所示的)。在一个任选实施方案中，本发明包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列:AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIGSYLAWYQQKPGKVPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTKVEIKR(SEQ IDN0:91)。
[0373]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIGSYLAWYQQKPGKVPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:92)。
[0374]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变重链序列:QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARETPVNYYLDIffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:93)。
[0375]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARETPVNYYLDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:94)。
[0376]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO:91的可变轻链序列或SEQ ID N0:92的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO:93的可变重链序列或SEQ ID N0:94的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:98,SEQ ID N0:99和SEQ ID NO: 100的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体或其片段包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0377]本发明还任选地涉及用于治疗疼痛和特定疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:91或SEQ ID N0:92的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:93或SEQ ID N0:94的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0378]在本发明的其它实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO:91的可变轻链序列或SEQ ID NO:92的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:95, SEQ ID N0:96和SEQ IDNO:97的多肽序列的一 个或多个，或可选择地由其组成。
[0379]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID N0:93的可变重链序列或SEQ IDN0:94的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:98,SEQ ID N0:99和SEQID NO: 100的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0380]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID N0:91的可变轻链区、SEQ ID NO:93的可变重链区、SEQ ID N0:91的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97)和SEQ ID NO:93的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO:98,SEQ IDNO:99 和 SEQ ID NO:100)。
[0381]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗-NGF抗体是Ab 10，其包含SEQ ID N0:92和SEQ ID NO:94或可选择地由SEQ IDN0:92和SEQ ID N0:94组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0382]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，用于治疗或预防疾病和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体AblO而言，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段包括SEQ ID NO:91的可变轻链序列和SEQ ID NO:93的可变重链序列或结合与AblO所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或单价抗体片段。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID N0:91和/或SEQ ID N0:93的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0383]在本文(下文)中描述的本发明的一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过AblO的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，抗-NGF抗体例如AblO或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NSO或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0384]杭体 Abll
[0385]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括AblI或其片段，或结合与AblI所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或抗体片段(例如下文中所示的)。在一个任选实施方案中，本发明包括具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列的嵌合抗体:AFELTQTPSSVEAAVGGTVTIKCQASQNIVTNLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYFCQSYDGFNSAGFGGGTEVVVKR(SEQ ID NO:101)。
[0386]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，所述抗体具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:AFELTQTPSSVEAAVGGTVTIKCQASQNIVTNLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYFCQSYDGFNSAGFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:102)。
[0387]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，所述抗体具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变重链序列:QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEYIGLISYDGNTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:103)。
[0388]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，所述抗体具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEYIGLISYDGNTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:104)。
[0389]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO: 101的可变轻链序列或SEQ ID NO: 102的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的 SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106 和 SEQ ID NO: 107 的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO: 103的可变重链序列或SEQ ID NO: 104的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区) 的SEQ ID NO: 108,SEQ ID NO: 109和SEQ ID NO: 110的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体或其片段任选地包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0390]本发明还任选地涉及用于治疗疼痛和特定疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID NO: 101或SEQ ID NO: 102的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个任选实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:103或SEQ ID NO: 104的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0391]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 101的可变轻链序列或SEQ IDNO: 102的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 105,SEQ ID NO: 106SEQ ID NO: 107的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0392]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 103的可变重链序列或SEQ IDNO: 104的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 108,SEQ ID NO: 109和SEQ ID NO: 110的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0393]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO: 101的可变轻链区、SEQ ID NO: 103的可变重链区、SEQ ID NO: 101的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 105,SEQ ID N0:106和SEQ ID NO: 107)和SEQ IDNO: 103 的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 108,SEQ ID N0:109和 SEQ ID NO: 110) ?
[0394]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗-NGF抗体是Abll，其包含SEQ ID `NO: 102和SEQ ID NO: 104或可选择地由SEQ ID NO: 102和SEQ ID NO: 104组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0395]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，用于治疗或预防疾病和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Abll而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 101的可变轻链序列和SEQID NO: 103的可变重链序列或包括结合与Abll所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或单价抗体片段。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 101和/或SEQ ID NO: 103的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0396]在本文(下文)中描述的本发明的一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过Abll的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个任选实施方案中，抗-NGF抗体例如Abll或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0,NSO或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0397]杭体 Abl2
[0398]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括Abl2或其片段，或结合与Abl2所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或抗体片段(例如下文中所示的)。在一个任选实施方案中，本发明包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列:AFQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIVTNLAWYQQKPGKVPKLLIYGASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQSYDGFNSAGFGGGTKVEIKR(SEQ IDN0:111)。
[0399]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:AFQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIVTNLAWYQQKPGKVPKLLIYGASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQSYDGFNSAGFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:112)。
[0400]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变重链序列:QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEWVGLISYDGNTYYATSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:113)。
[0401]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEWVGLISYDGNTYYATSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS`RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:114)。
[0402]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO: 111的可变轻链序列或SEQ ID NO: 112的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的 SEQ ID NO: 115, SEQ ID N0:116 和 SEQ ID NO: 117 的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO: 113的可变重链序列或SEQ ID NO: 114的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 118,SEQ ID N0:119和SEQ ID N0:120的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个任选实施方案中，本发明的抗体或其片段任选地包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0403]本发明还任选地涉及用于治疗疼痛和特定疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID NO: 111或SEQ ID NO: 112的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:113或SEQ ID NO: 114的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0404]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 111的可变轻链序列或SEQ IDNO: 112的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 115,SEQ ID NO: 116和SEQ ID NO: 117的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0405]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 113的可变重链序列或SEQ IDNO: 114的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 118,SEQ ID NO: 119和SEQ ID NO: 120的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0406]本发明还任选地涉及包括本文中描述的抗体片段的一个或多个的抗体片段。在本发明的一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO: 111的可变轻链区、SEQ ID NO: 113的可变重链区、SEQ ID NO: 111的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 115,SEQ ID N0:116和SEQ ID NO: 117)和SEQ IDNO: 113 的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 118,SEQ ID N0:119和 SEQ ID NO: 120) ?
[0407]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗-NGF抗体是Ab 12，其包含SEQ ID NO: 112和SEQ ID NO: 114或可选择地由SEQ IDN0:112和SEQ ID NO: 114组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0408]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，用于治疗或预防疾病和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Abl2而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 111的可变轻链序列和SEQID NO: 113的可变重链序列或包括结合与Abl2所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或单价抗体片 段。本发明的该任选实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 111和/或SEQ ID NO: 113的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0409]在本文(下文)中描述的本发明的一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过Abl2的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗-NGF抗体例如Abl2或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NS0或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0410]杭体 Abl3
[0411]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括Abl3或其片段，或结合与Abl3所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或抗体片段(例如下文中所示的)。在一个实施方案中，本发明包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列:AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFKGGGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTEVVVKR(SEQ ID NO:121)。
[0412]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFKGGGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:122)。
[0413]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变重链序列:QSVEASGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWIGDIYFSNEETNYASWAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:123)。
[0414]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:QSVEASGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWI⑶IYFSNEETNYASWAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO:124)?
[0415]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO: 121的可变轻链序列或SEQ ID NO: 122的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的 SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126 和 SEQ ID NO: 127 的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO: 123的可变重链序列或SEQ ID NO: 124的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 128,SEQ ID NO: 129和SEQ ID NO: 130的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个任选实施方案中，本发明的抗体或其片段包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0416]本发明还任选地涉及用于治疗疼痛和特定疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID NO: 121或SEQ ID NO: 122的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID NO: 123或SEQ ID NO: 124的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。`
[0417]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 121的可变轻链序列或SEQ IDNO: 122的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 125,SEQ ID NO: 126和SEQ ID NO: 127的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0418]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 123的可变重链序列或SEQ IDNO: 124的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 128,SEQ ID NO: 129SEQ ID NO: 130的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0419]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO: 121的可变轻链区、SEQ ID NO: 123的可变重链区、SEQ ID NO: 121的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 125,SEQ ID N0:126和SEQ ID NO: 127)和SEQ IDNO: 123 的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 128,SEQ ID N0:129和 SEQ ID NO: 130) ?
[0420]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗-NGF抗体是Ab 13，其包含SEQ ID NO: 122和SEQ ID NO: 124或可选择地由SEQ ID NO: 122和SEQ ID NO: 124组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0421]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，用于治疗或预防疾病和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Abl3而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 121的可变轻链序列和SEQID NO: 123的可变重链序列，或包括结合与Abl3所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或单价抗体片段。本发明的该任选实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 121和/或SEQ ID NO: 123的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0422]在本文(下文)中描述的本发明的一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过Abl3的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，抗-NGF抗体例如Abl3或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NSO或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0423]杭体 Ab 14
[0424]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括具有对于NGF的结合特异性的嵌合抗体，其中抗体为Abl4或其片段，或结合与Abl4所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或抗体片段(例如下文中所示的)。在一个任选实施方案`中，本发明包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列:DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:131)。
[0425]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:132)。
[0426]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变重链序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEETNYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:133)。
[0427]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEETNYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:134)。
[0428]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO: 131的可变轻链序列或SEQ ID NO: 132的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的 SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136 和 SEQ ID NO: 137 的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO: 133的可变重链序列或SEQ ID NO: 134的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 138,SEQ ID NO: 139和SEQ ID NO: 140的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个任选实施方案中，本发明的抗体或其片段包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0429]本发明还任选地涉及用于治疗疼痛和特定疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID NO: 131或SEQ ID NO: 132的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID NO: 133或SEQ ID NO: 134的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0430]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 131的可变轻链序列或SEQ IDNO: 132的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 135,SEQ ID NO: 136和SEQ ID NO: 137的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0431]在本发明的其 它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 133的可变重链序列或SEQ IDNO: 134的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 138,SEQ ID NO: 139和SEQ ID NO: 140的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0432]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO: 131的可变轻链区、SEQ ID NO: 133的可变重链区、SEQ ID NO: 131的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 135,SEQ ID N0:136和SEQ ID N0:137)和SEQ IDNO: 133 的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 138,SEQ ID N0:139和 SEQ ID NO: 140) ?
[0433]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗-NGF抗体是Abl4，其包含SEQ ID NO: 132和SEQ ID NO: 134或可选择地由SEQ IDNO: 132和SEQ ID NO: 134组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0434]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，用于治疗或预防疾病和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Abl4而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 131的可变轻链序列和SEQID NO: 133的可变重链序列，或结合与Abl4所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或单价抗体片段。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 131和/或SEQ ID NO: 133的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。[0435]在本文(下文)中描述的本发明的一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过Abl4的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗-NGF抗体例如Abl4或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NS0或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0436]杭体 Abl5
[0437]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合而不显著地抑制NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括具有对于NGF的结合特异性的嵌合抗体，其中抗体为Ab15或其片段(例如下文中所示的)，或包括结合与Abl5所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本发明包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列:AAVLTQTPSPVSAAVGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYDASNLPSGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDTDNGFGGGTEVVVKR(SEQ ID NO:141)。
[0438]本发明还包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:AAVLTQTPSPVSAAVGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYDASNLPSGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDTDNGFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:142)。
[0439]本发明还包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变重链序列:QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGIIffSGGTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLQITSPTTEDAATYFCAAGGGSIYDVWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:143)。
`[0440]本发明还包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGIIffSGGTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLQITSPTTEDAATYFCAAGGGSIYDVffGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:144)。
[0441]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO: 141的可变轻链序列或SEQ ID NO: 142的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的 SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146 和 SEQ ID NO: 147 的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO: 143的可变重链序列或SEQ ID NO: 144的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 148,SEQ ID NO: 149和SEQ ID NO: 150的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的本发明的抗体或其片段包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0442]本发明还涉及用于治疗疼痛和特定疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:141或SEQID NO: 142的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:143或SEQ ID NO: 144的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0443]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 141的可变轻链序列或SEQ IDNO: 142的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 145,SEQ ID NO: 146和SEQ ID NO: 147的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0444]在本发明的其它实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 143的可变重链序列或SEQ IDNO: 144的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 148,SEQ ID NO: 149SEQ ID NO: 150的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0445]本发明还涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO: 141的可变轻链区、SEQ ID N0:143的可变重链区、SEQ ID NO: 141的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 145,SEQ ID NO: 146和SEQ ID NO: 147)和 SEQ ID NO: 143的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 148,SEQID NO:149 和 SEQ ID NO:150)。
[0446]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗-NGF抗体是Ab 15，其包含SEQ ID NO: 142和SEQ ID NO: 144或可选择地由SEQ IDNO: 142和SEQ ID NO: 144组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0447]在本发明的其它特别优选实施方案中，用于治疗或预防疾病和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Abl5而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 141的可变轻链序列和SEQ IDNO: 143的可变重链序列，或包括结合与Abl5所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID N0:141和/或SEQ ID NO: 143的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0448]在本文(下文)中描述的本发明的一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过Abl5的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗-NGF抗体例如Abl5或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NS0或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0449]杭体 Ab 16
[0450]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合而不显著地抑制NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括具有对于NGF的结合特异性的嵌合抗体，其中抗体为Abl6或其片段(例如下文中所示的)，或包括结合与Abl6所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本发明包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列:ALVMTQTPSSTSEPVGGTVTINCQASQNIGNDLSWYQQKPGQPPELLIYSTSKLATGVPKRFSGSRSGTQFTLTISDLECDDAATYYCLGVYSYISDDGNAFGGGTEVWKR(SEQ ID NO:151)。
[0451]本发明还包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:ALVMTQTPSSTSEPVGGTVTINCQASQNIGNDLSWYQQKPGQPPELLIYSTSKLATGVPKRFSGSRSGTQFTLTISDLECDDAATYYCLGVYSYISDDGNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:152)。
[0452]本发明还包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变重链链序列:QSVEEFGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNYAMTWVRQAPGKGLEWIGIIGSIGTTYYASffAKGRFFISKTSTTVDLKIISPTTEDTATYFCARDAGVTVDGYGYYFNIWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:153)。
[0453]本发明还包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链链序列:QSVEEFGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNYAMTWVRQAPGKGLEWIGIIGSIGTTYYASffAKGRFFISKTSTTVDLKIISPTTEDTATYFCARDAGVTVDGYGYYFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:154)。
[0454]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO: 151的可变轻链序列或SEQ ID NO: 152的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的 SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156 和 SEQ ID NO: 157 的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO: 153的可变重链序列或SEQ ID NO: 154的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 158,SEQ ID NO: 159和SEQ ID NO: 160的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的本发明的抗体或其片段包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0455]本发明还涉及用于治疗疼痛和特定疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:151或SEQID NO: 152的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的本发明的抗体片段包含SEQ ID NO: 153或SEQ IDNO: 154的多肽序列或可 选择地由所述多肽序列组成。
[0456]在本发明的其它实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 151的可变轻链序列或SEQ IDNO: 152的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 155,SEQ ID NO: 156SEQ ID NO: 157的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0457]在本发明的其它实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 153的可变重链序列或SEQ IDNO: 154的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 158,SEQ ID NO: 159SEQ ID NO: 160的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0458]本发明还涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO: 151的可变轻链区、SEQ ID NO: 153的可变重链区、SEQ ID NO: 151的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 155,SEQ ID N0:156和SEQ ID N0:157)和SEQ ID NO: 153的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159和SEQ ID NO: 160)。
[0459]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗-NGF抗体是Ab 16，其包含SEQ ID NO: 152和SEQ ID NO: 154或可选择地由SEQ IDNO: 152和SEQ ID NO: 154组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0460]在本发明的其它特别优选实施方案中，用于治疗或预防疾病和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Ab 16而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 151的可变轻链序列和SEQ ID NO: 153的可变重链序列，或包括结合与Abl6所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或另一种双价或单价抗体片段。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 151和/或SEQ ID NO: 153的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
`[0461]在本文(下文)中描述的本发明的一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过Abl6的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗-NGF抗体例如Abl6或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NS0或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0462]杭体Abl7
[0463]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括具有对于NGF的结合特异性的嵌合抗体，其中抗体为Abl7或其片段(例如下文中所示的)，或包括结合与Abl7所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本发明包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列:AIEMTQTPFSVSAAVGGTVTIKCQASQTISNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTEVVVKR(SEQ ID NO:161)。
[0464]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:AIEMTQTPFSVSAAVGGTVTIKCQASQTISNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:162)。
[0465]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变重链序列:QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCAASGFSLTGYNLVWVRQAPGKGLEWIGFISYGDTTYYASWAKGRFTISKTSTTVTLTITDLQPSDTGTYFCARETANTYDYGIffGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:163)。[0466]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCAASGFSLTGYNLVWVRQAPGKGLEWIGFISYGDTTYYASWAKGRFTISKTSTTVTLTITDLQPSDTGTYFCARETANTYDYGIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:164)。
[0467]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO: 161的可变轻链序列或SEQ ID NO: 162的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的 SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166 和 SEQ ID NO: 167 的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO: 163的可变重链序列或SEQ ID NO: 164的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 168,SEQ ID NO: 169和SEQ ID NO: 170的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的本发明的抗体或其片段包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0468]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ IDNO: 161或SEQ ID NO: 162的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个任选实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID NO: 163或SEQ ID NO: 164的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0469]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 161的可变轻链序列或SEQ IDNO: 162的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 165,SEQ ID NO: 166SEQ ID NO: 167的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0470]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 163的可变重链序列或SEQ IDNO: 164的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 168,SEQ ID NO: 169和SEQ ID NO: 170的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0471]本发明还涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO: 161的可变轻链区、SEQ ID N0:163的可变重链区、SEQ ID NO: 161的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 165,SEQ ID NO: 166和SEQ ID NO: 167)和SEQ ID NO: 163的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 168,SEQID NO:169 和 SEQ ID NO:170)。
[0472]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗-NGF抗体是Ab 17，其包含SEQ ID NO: 162和SEQ ID NO: 164或可选择地由SEQ ID NO: 162和SEQ ID NO: 164组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0473]在本发明的其它特别地优选的任选实施方案中，用于治疗或预防疾病和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Abl7而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 161的可变轻链序列和SEQID NO: 163的可变重链序列，或包括结合与Abl5所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或单价或双价抗体片段。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ IDNO: 161和/或SEQ ID NO: 163的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0474]在本文(下文)中描述的本发明的一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过Abl7的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，抗-NGF抗体例如Abl7或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NSO或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0475]杭体 Ab 18
[0476]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括具有对于NGF的结合特异性的嵌合抗体，其中抗体为Abl8或其片段(例如下文中所示的)，或包括结合与Abl`8所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本发明包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQTISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:171)。
[0477]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQTISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:172)。
[0478]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变重链序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSGYNLVWVRQAPGKGLEWVGFISYGDTTYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETANTYDYGIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:173)。
[0479]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSGYNLVWVRQAPGKGLEWVGFISY⑶TTYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETANTYDYGIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:174)。
[0480]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO: 171的可变轻链序列或SEQ ID NO: 172的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的 SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176 和 SEQ ID NO: 177 的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO: 173的可变重链序列或SEQ ID NO: 174的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 178,SEQ ID NO: 179和SEQ ID NO: 180的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的本发明的抗体或其片段包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0481]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ IDN0:171或SEQ ID NO: 172的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个任选实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID NO: 173或SEQ ID NO: 174的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0482]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 171的可变轻链序列或SEQ IDNO: 172的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 175,SEQ ID NO: 176SEQ ID NO: 177的多肽序列的`一个或多个，或可选择地由其组成。
[0483]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 173的可变重链序列或SEQ IDNO: 174的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 178,SEQ ID NO: 179和SEQ ID NO: 180的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0484]本发明还涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO: 171的可变轻链区、SEQ ID N0:173的可变重链区、SEQ ID NO: 171的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 175,SEQ ID NO: 176和SEQ ID NO: 177)和SEQ ID NO: 173的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 178,SEQID NO:179 和 SEQ ID NO:180)。
[0485]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗-NGF抗体是Ab 18，其包含SEQ ID NO: 172和SEQ ID NO: 174或可选择地由SEQ IDNO: 172和SEQ ID NO: 174组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。[0486]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体AblS而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 171的可变轻链序列和SEQ ID NO: 173的可变重链序列，或包括结合与Abl8所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或抗体片段。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 171和/或SEQ ID NO: 173的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0487]在本文(下文)中描述的本发明的一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过AblS的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，抗-NGF抗体例如Abl8或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NSO或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0488]杭体 Ab 19
[0489]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括具有对于NGF的结合特异性的嵌合抗体，其中抗体为Abl9或其片段(例如下文中所示的)，或包括结合与Abl9所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本发明包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列:AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFKGSGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYSSSSDNAFGGGTEVVVKR(SEQ ID NO:181)。
[0490]本发明还任选地 包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFKGSGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYSSSSDNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:182)。
[0491]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变重链序列:QSVEASGGRLVMPGGSLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWI⑶IYFSNEETNYATWAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:183)。
[0492]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:QSVEASGGRLVMPGGSLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWI⑶IYFSNEETNYATWAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:184)。
[0493]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO: 181的可变轻链序列或SEQ ID NO: 182的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的 SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 186 和 SEQ ID NO: 187 的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO: 183的可变重链序列或SEQ ID NO: 184的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 188,SEQ ID NO: 189和SEQ ID NO: 190的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的本发明的抗体或其片段包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0494]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ IDNO: 181或SEQ ID NO: 182的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个任选实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID NO: 183或SEQ ID NO: 184的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0495]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 181的可变轻链序列或SEQ IDNO: 182的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 185,SEQ ID NO: 186和SEQ ID NO: 187的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0496]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 183的可变重链序列或SEQ IDNO: 184的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 188,SEQ ID NO: 189SEQ ID NO: 190的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0497]本发明还涉及 用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个任选实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO: 181的可变轻链区、SEQ ID NO: 183的可变重链区、SEQ ID NO: 181的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 186 和 SEQ ID NO: 187)和 SEQ IDNO: 183 的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 188,SEQ ID N0:189和 SEQ ID NO: 190) ?
[0498]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合抗-NGF抗体是Ab 19，其包含SEQ ID NO: 182和SEQ ID NO: 184或可选择地由SEQ ID NO: 182和SEQ ID NO: 184组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0499]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Abl9而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 181的可变轻链序列和SEQID NO: 183的可变重链序列，或包括结合与Abl9所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或抗体片段。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 181和/或SEQ ID NO: 183的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0500]在本文(下文)中描述的本发明的一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过Abl9的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，抗-NGF抗体例如Abl9或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NSO或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0501]杭体Ab20
[0502]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括具有对于NGF的结合特异性的嵌合抗体，其中抗体为Ab20或其片段(例如下文中所示的)，或包括结合与Ab20所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本发明包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:191)。
[0503]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:192)。
[0504]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变重链序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEETNYATSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:193)。
`[0505]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEETNYATSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:194)。
[0506]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO: 191的可变轻链序列或SEQ ID NO: 192的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的 SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196 和 SEQ ID NO: 197 的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO: 193的可变重链序列或SEQ ID NO: 194的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 198,SEQ ID NO: 199和SEQ ID N0:200的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的本发明的抗体或其片段包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0507]本发明还任选地涉及具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的本发明的抗体片段包含SEQ IDNO: 191或SEQ ID NO: 192的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个任选实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID NO: 193或SEQ ID NO: 194的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0508]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 191的可变轻链序列或SEQ IDNO: 192的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 195,SEQ ID NO: 196和SEQ ID NO: 197的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0509]在本发明的其它任选实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO: 193的可变重链序列或SEQ ID NO: 194的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199和SEQ ID NO:200的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0510]本发明还涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO: 191的可变轻链区、SEQ ID NO: 193的可变重链区、SEQ ID NO: 191的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 195,SEQ ID N0:196和SEQ ID N0:197)和SEQ ID NO: 193的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199和SEQ ID NO: 200) ?
[0511]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗-NGF抗体是Ab20，其包含SEQ ID NO: 192和SEQ ID NO: 194或可选择地由SEQ IDNO: 192和SEQ ID NO: 194组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0512]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Ab20而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 191的可变轻链序列和SEQID NO: 193的可变重链序列。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 191和/或SEQ ID NO: 193的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0513]在本文(下文)中描述的本发明的一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过Ab20的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗-NGF抗体例如Ab20或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NS0或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0514]杭体 Ab21
[0515]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，单独地或与另一种活性剂例如NSAID或阿片类镇痛药结合地治疗疼痛和特定疼痛相关障碍的方法，其中抗体包括具有对于NGF的结合特异性的嵌合抗体，其中抗体为Ab21或其片段，或结合与Ab5所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种抗体或抗体片段(例如下文中所示的)。在一个实施方案中，本发明包括具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变轻链序列的嵌合或 人源化抗体:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKR(SEQID N0:51)。
[0516]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:401)。
[0517]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的可变重链序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:53)。
[0518]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗体，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:402)。
[0519]本发明还任选地 涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体，所述抗体包含对应于SEQ ID NO:51的可变轻链序列或SEQ ID N0:401的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO:53的可变重链序列或SEQ ID N0:402的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:59和SEQ ID N0:60的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体或其片段包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0520]本发明还任选地涉及具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:51或SEQ ID N0:401的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的本发明的抗体片段包含SEQ ID NO:53或SEQ ID N0:402的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0521]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO:51的可变轻链序列或SEQ IDN0:401的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:55, SEQ ID N0:56和SEQ ID N0:57的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0522]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO:53的可变重链序列或SEQ IDN0:402的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:59和SEQ ID N0:60的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0523]本发明还涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO:51的可变轻链区、SEQ ID NO:53的可变重链区、SEQ ID NO:51的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 55,SEQ ID NO: 56 和 SEQ ID NO: 57)和 SEQ ID NO: 53 的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO: 58, SEQ ID N0:59和SEQ ID NO:60) ?
[0524]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗-NGF抗体是Ab21，其包含SEQ ID NO:401和SEQ ID NO:402或可选择地由SEQ IDN0:401和SEQ ID N0:402组成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0525]在本发明的其它特别地任选的优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段包含具有对于NGF的结合特异性的Fab (片段抗原结合)片段，或可选择地由所述片段组成。就抗体Ab21而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 51的可变轻链序列和SEQ IDNO:53的可变重链序列或结合与Ab5所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或单价抗体片段。本发明的该实施方案还涉及所述Fab中的SEQ ID N0:51和/或SEQ IDNO:53的添加、缺失和变体(同时保持对于NGF的结合特异性)。
[0526]在本文(下文)中描述的本发明的一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过Ab21的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗-NGF抗体例如Ab21或其Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CH0、NS0或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0527]杭体片段Fabl
[0528]本发明涉及以抑制NGF与T`rkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，使用抗体片段Fabl或其片段(例如下文中所示的)治疗疼痛的方法。在一个实施方案中，本发明任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab抗体片段，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列:
[0529]DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:405)。
[0530]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab抗体片段，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTH(SEQ ID NO:406)。
[0531]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体片段，所述抗体片段包含对应于SEQ ID NO:51的可变轻链序列或SEQ ID NO:405的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:55, SEQ ID N0:56和SEQ ID N0:57的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO:53的可变重链序列或SEQ ID N0:406的重链序列的互补性决定区(CDR,或高变区)的SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:59和SEQ ID N0:60的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的本发明的抗体片段包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0532]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ IDN0:51或SEQ ID NO:405的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个任选实施方案中，本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:53或SEQ ID NO:406的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0533]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含对应于SEQ ID NO:51的可变轻链序列或SEQ IDN0:405的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56SEQ ID N0:57的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0534]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体片段包含对应于SEQ ID NO:53的可变重链序列或SEQ IDN0:406的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:59和SEQ ID N0:60的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0535]本发明还涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO:51的可变轻链区、SEQ ID NO:53的可变重链区、SEQ ID NO:51的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID `NO:55,SEQ ID N0:56 和 SEQ ID NO:57)和 SEQ ID N0:53 的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:59和SEQ ID NO:60) ?
[0536]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的嵌合或人源化抗-NGF抗体是Fabl，其包含SEQ ID NO:405和SEQ ID NO: 406，或结合与Fabl所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或抗体片段，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。在本发明的一个实施方案中，抗体片段Fabl可通过Ab21的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)产生。
[0537]杭体片段Fab2
[0538]本发明涉及以抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合的治疗有效量，使用抗体片段Fab2或其片段(例如下文中所示的)治疗疼痛的方法。在一个实施方案中，本发明包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab抗体片段，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的轻链序列的:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:407)。
[0539]本发明还任选地包括用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab抗体片段，其具有对于NGF的结合特异性并且具有包含下文中所示序列的重链序列的:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTH(SEQ ID NO:408)。[0540]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和特定疼痛相关病况的抗体片段，所述抗体片段包含对应于SEQ ID NO:51的可变轻链序列或SEQ ID NO:407的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:55, SEQ ID N0:56和SEQ ID N0:57的多肽序列的一个或多个，和/或对应于SEQ ID NO:53的可变重链序列或SEQ ID N0:408的重链序列的互补性决定区(CDR,或高变区)的SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:59和SEQ ID N0:60的多肽序列的一个或多个，或这些多肽序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体片段包含CDR、可变重链和可变轻链序列以及上文中所示的重链和轻链序列的一个或多个的组合(包括它们全部)，或可选择地由其组成。
[0541]本发明还任选地涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段。在本发明的一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:51或SEQ ID N0:407的多肽序列，或可选择地由所述多肽序列组成。在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的本发明的抗体片段包含SEQ ID N0:53或SEQ ID N0:408的多肽序列或可选择地由所述多肽序列组成。
[0542]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体片段包含对应于SEQ ID NO:51的可变轻链序列或SEQ IDN0:407的轻链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:55, SEQ ID N0:56和SEQ ID N0:57的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0543]在本发明的其它任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体片段包含对应于SEQ ID NO:53的可变重链序列或SEQ IDN0:408的重链序列的互补性决定区(CDR，或高变区)的SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59SEQ ID N0:60的多肽序列的一个或多个，或可选择地由其组成。
[0544]本发明还涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体片段，其包括本文中描述的抗体片段的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的具有对于NGF的结合特异性的抗体的片段包含下列抗体片段的I个、2个、3个或更多个(包括全部)或可选择地由其组成:SEQ ID NO: 51的可变轻链区、SEQ ID NO: 53的可变重链区、SEQ ID NO:51的可变轻链区的互补性决定区(SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57)和SEQ ID NO:53的可变重链区的互补性决定区(SEQ ID NO:58,SEQ IDNO:59 和 SEQ ID NO:60)。
[0545]在本发明的特别优选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗-NGF抗体是Fab2，其包含SEQ ID N0:407和SEQ ID N0:408，或结合与Fab2所结合的表位相同的或与之重叠的表位的另一种Fab或抗体片段，并且具有本文中所示的生物活性的至少一种。
[0546]在本文(下文)中描述的本发明的另一个任选实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的Fab片段可通过在哺乳动物细胞例如CHO、NSO或HEK293细胞、真菌、昆虫、植物或微生物系统例如酵母细胞(例如二倍体酵母例如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株中表达来产生。适当的毕赤酵母的种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。在本发明的一个实施方案中，抗体片段Fab2可通过使用在本文中在实施例中所示的方案在巴斯德毕赤酵母中表达来实现。
[0547]在另一个任选实施方案中，抗体片段可以以下列非限定形式的一个或多个形式存在:Fab、Fab’、F (ab’)2、Fv和单链Fv抗体形式。在优选实施方案中，本文中所述的抗-NGF抗体还包含含有下文中所示序列的K恒定轻链序列:
[0548]VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:412)。
[0549]在另一个优选的任选实施方案中，本文中描述的用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗-NGF抗体还包含含有下文中所示序列的Y -1恒定重链多肽序列:
[0550]ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:413)。
[0551]在另一个任选实施方案中，本发明涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的分离抗-NGF抗体，其包含选自如下序列的VhS肽序列:SEQ ID NO: 3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、103、113、123、133、143、153、163、173、183、193 或 402 或其变体，并且还包含选自如下序列的 Vl 多肽序列:SEQ ID N0:l、ll、21、31、41、51、61、71、81、91、101、lll、121、131、141、151、161、171、181、191或401或其变体，其中所述Vh或Vl多肽中的框架残基(FR残基)的一个或多个已被另一个氨基酸残基置换，从而导致特异性结合NGF的抗-NGF抗体。本发明涉及用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的这些抗体的人源化和嵌合形式。嵌合抗体包括来源于 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgG6、IgG7、IgG8、IgG9、IgGlO、IgGll、IgG12、IgG13、IgG14、IgG15、IgG16、IgG17、IgG18 或 IgG19 恒定区的 Fc。
[0552]在本发明的一个实施方案中，在本文中提及的人源化过程开始之前，抗体或Vh或Vl多肽源自或选自一个或多个兔B细胞群体。
[0553]在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗-NGF抗体及其片段不具有对于P75或TrkA的结合特异性。在本发明的其它实施方案中，涉及了用于治疗疼痛的方法，包括使用抗-NGF抗体及其片段抑制NGF与p75和/或TrkA缔合。在本发明的另一个实施方案中，涉及用于治疗疼痛的方法，包括使用抗-NGF抗体及其片段抑制NGF与TrkA和/或其多聚体的缔合和/或拮抗其生物学作用。在本发明的另一个实施方案中，涉及用于使用治疗疼痛的方法，包括使用抗-NGF抗体及其片段抑制NGF与p75和/或其多聚体的缔合以 及NGF与TrkA和/或其多聚体的缔合，和拮抗p75和TrkA的生物学作用。
[0554]如上文中所提及的，可对抗体和其部分进行翻译后修饰以添加效应物部分例如化学接头、可检测部分例如荧光染料、酶、底物、生物发光物质、放射性物质和化学发光部分或功能性部分例如链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、生物素、细胞毒素、细胞毒性剂和放射性物质。[0555]关于可检测的部分，其它示例性酶包括但不限于辣根过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和萤光素酶。其它示例性荧光物质包括但不限于罗丹明、荧光素、异硫氰酸荧光素、伞形花内酯、二氯三嗪胺、藻红蛋白和丹磺酰氯。其它示例性化学发光部分包括但不限于鲁米诺。其它示例性生物发光物质包括但不限于萤光素和水母荧光蛋白。其它示例性放射性物质包括但不限于碘125 (125I)、碳H(14C)、硫35 (35S)、氣(3H)和磷32 (32P)。
[0556]关于功能性部分，示例性细胞毒性剂包括但不限于甲氨蝶呤、氨基蝶呤、6-巯嘌呤、6-巯鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟脲嘧啶达卡巴嗪；烷化剂例如氮芥、硫喷妥苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、丝裂霉素 C、SimSun ; (CCNU)、1-甲基亚硝脲、环磷酰胺、氮芥、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C、顺二氯二氨基钼(cis-dichlorodiamine platinum) (II) (DDP)顺钼和顺钼(伯尔定);蒽环类，包括柔红霉素(先前称为道诺霉素)、多柔比星、地托比星、洋红霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌和比生群；抗生素类，包括更生霉素(放线菌素D)、博来霉素、卡奇霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC);以及抗有丝分裂剂例如长春花生物碱类、长春新碱和长春碱。其它细胞毒素剂包括紫杉醇(泰素)、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素、吉西他滨、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴乙啶、依米丁、依托泊苷、鬼白噻吩甙、秋水仙碱、二羟基蒽二酮、1-去氢睾丸素、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、丙卡巴肼、羟基脲、门冬酰胺酶、皮质类固醇、米托坦(0，P’ -(DDD))、干扰素及这些细胞毒素剂的混合物。
[0557]其它细胞毒性剂包括但不限于化学治疗剂例如卡钼、顺钼、紫杉醇、吉西他滨、卡奇霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、放线菌素D、环磷酰胺、长春新碱和博来霉素。可将来自植物和细菌的毒性酶例如蓖麻毒素、白喉毒素和假单胞菌属(Pseudomonas)毒素缀合至人源化或嵌合抗体或其结合片段，以产生细胞类型特异性杀伤试剂(Youle等，Proc.Nat' I Acad.Sc1.USA77: 5483 (1980) ；Gilliland 等，Proc.Nat' I Acad.Sc1.USA77:4539 (1980) ；Krolick 等，Proc.Nat，I Acad.Sc1.USA77:5419 (1980))。
[0558]其它细胞毒性剂包括如由Goldenberg在美国专利N0.6，653，104中描述的细胞毒性核糖核酸酶。本发明的实施方案还涉及放射免疫缀合物，其中在使用或不使用复合物形成剂的情况下将发射α、β粒子的放``射性核素稳定地偶联至抗体，或其结合片段。这样的放射性核素包括β发射体例如磷-32 (32P)、钪-47 (47Sc)、铜-67 (67Cu)、镓-67 (67Ga)、钇-88 (88Y)、钇-90 (9ciY)、碘-125 (125I)、碘-131 (131I)、钐-153 (153Sm)、镥-177 (177Lu)、铼-186 (186Re)或铼-188 (188Re)，和 α -发射体例如砹-211 (211At)、铅-212 (212Pb)、铋-212 (212Bi)或-213 (213Bi)或锕-225 (225Ac)。
[0559]其它示例性放射性物质包括但不限于碘125 (125I)、碳H(14C)、硫35 (35S)、氚(3H)和磷 32 (32P)。
[0560]关于功能性部分，示例性细胞毒性剂包括但不限于甲氨蝶呤、氨基蝶呤、6-巯嘌呤、6-巯鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟脲嘧啶达卡巴嗪；烷化剂例如氮芥、硫喷妥苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、丝裂霉素C、SimSun ； (CCNU)U-甲基亚硝脲、环磷酰胺、氮芥、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C、顺二氯二氨基钼(II) (DDP)顺钼和顺钼(伯尔定)；蒽环类，包括柔红霉素(先前称为道诺霉素)、多柔比星、地托比星、洋红霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌和比生群；抗生素类，包括更生霉素(放线菌素D)、博来霉素、卡奇霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC);以及抗有丝分裂剂例如长春花生物碱类、长春新碱和长春碱。其它细胞毒素剂包括紫杉醇(泰素)、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素、吉西他滨、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴乙啶、依米丁、依托泊苷、鬼白噻吩甙、秋水仙碱、二羟基蒽二酮、1-去氢睾丸素、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、丙卡巴肼、羟基脲、门冬酰胺酶、皮质类固醇、米托坦(O，P’ -(DDD))、干扰素及这些细胞毒素剂的混合物。
[0561]其它细胞毒性剂包括但不限于化学治疗剂例如卡钼、顺钼、紫杉醇、吉西他滨、卡奇霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、放线菌素D、环磷酰胺、长春新碱和博来霉素。可将来自植物和细菌的毒性酶例如蓖麻毒素、白喉毒素和假单胞菌属毒素缀合至人源化或嵌合抗体或其结合片段，以产生细胞类型特异性杀伤试剂(Youle,等，Proc.Nat' IAcad.Sc1.USA77:5483 (1980) ；Gilliland,等，Proc.Nat’I Acad.Sc1.USA77:4539 (1980)；Krolick,等，Proc.Nat，I Acad.Sc1.USA77:5419 (1980))。
[0562]其它细胞毒性剂包括如由Goldenberg在美国专利N0.6，653，104中描述的细胞毒性核糖核酸酶。本发明的实施方案还涉及放射免疫缀合物，其中在使用或不使用复合物形成剂的情况下将发射α、β粒子的放射性核素稳定地偶联至抗体，或其结合片段。这样的放射性核素包括β发射体例如磷-32 (32P)、钪-47 (47Sc)、铜-67 (67Cu)、镓-67 (67Ga)、钇-88 (88Y)、钇-90 (9ciY)、碘-125 (125I)、碘-131 (131I)、钐-153 (153Sm)、镥-177 (177Lu)、铼-186 (186Re)或铼-188 (188Re)和 α -发射体例如砹-211 (211At)、铅-212 (212Pb)、铋-212 (212Bi)或-213 (213Bi)或锕-225 (225Ac)。
[0563]用于将抗体或其结合片段缀合至可检测的部分等的方法在本领域是已知的，例如由 Hunter 等，Naturel44:945 (1962) ；David 等，Biochemistryl3:1014 (1974) ；Pain 等，J.Tmmunol.Meth.40:219(1981)和 Nygren, J., Histochem.and Cytochem.30:407 (1982)描述的那些方法。
[0564]本文中描述的实施方案还包括与本文中所示的抗体、抗体片段、双体抗体、SMIP、骆鸵体、纳米抗体、IgNA R、多肽、可变区和⑶R具有显著同源性的变体和等同物。这些变体和等同物可包含例如保守置换突变(即，相似氨基酸对一个或多个氨基酸的置换)。例如，保守置换是指相相同的一般种类中的另一个氨基酸对氨基酸的置换，例如用另一个酸性氨基酸置换一个酸性氨基酸，用另一个碱性氨基酸置换一个碱性氨基酸，或用另一个中性氨基酸置换一个中性氨基酸。期望进行保守氨基酸置的情形在本领域是公知的。
[0565]在另一个任选实施方案中，本发明涉及与本文中所示的抗体片段、可变区和CDR的多肽序列的任一个或多个具有至少90%或更大的序列同源性的多肽序列。更优选地，本发明涉及与本文中所示的抗体片段、可变区和CDR的多肽序列的任一个或多个具有至少95%或更大的序列同源性，更优选至少98%或更大的序列同源性，更优选至少99%或更大的序列同源性的多肽序列。用于测定核酸与氨基酸序列之间的同源性的方法对于本领域技术人员来说是公知的。
[0566]在另一个任选实施方案中，本发明还涉及还具有抗-NGF活性的本文中所示的抗体片段、可变区和CDR的上述多肽同源物。抗-NGF活性的非限定性实例示于本文中。
[0567]在另一个任选实施方案中，本发明还涉及结合前述序列的任何序列的抗独特型抗体的产生和用途。在示例性实施方案中，可给已接受抗-NGF抗体的受试者施用这样的抗独特型抗体来调节、减小或中和抗-NGF抗体的作用。这样的抗独特型抗体还可用于治疗特征在于抗-NGF抗体的存在的自身免疫疾病。这样的抗独特型抗体的其它示例性用途是用于检测本发明的抗-NGF抗体，例如以监测存在于受试者的血液或其它体液中的抗-NGF抗体的水平。
[0568]本发明还涉及抗-NGF抗体，其包括用本文中描述的其它多核苷酸序列的任何序列置换本文中描述的多肽或多核苷酸序列的任何序列。例如，但不限于其，本发明涉及包含本文中描述的可变轻链和可变重链序列的任一个组合的抗体，并且还涉及因本文中描述的其它CDR序列的任何CDR序列置换本文中描述的CDR序列的任何CDR序列而产生的抗体。
[0569]编码抗-NGF抗体多肽的多核苷酸
[0570]杭体 Abl
[0571]本发明还任选地涉及下文中所示的多核苷酸用于治疗个体的疼痛的方法(包括给所述个体施用抗体Abl多肽)中产生用于治疗或预防疼痛和疼痛相关病况的抗体Abl多肽(所述抗体多肽具有对于NGF的结合特异性，其抑制NGF与TrkA的缔合和NGF与p75的缔合)的用途。在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含下列编码SEQ ID NO:1的可变轻链多肽序列的多核苷酸序列，或可选择地由所述多核苷酸序列组成:
[0572]GCCCTTGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCAATTTAGCCTGGTATCAACAGAGACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGATGCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGTTGGCACTTACTACTGTCAAAGTGCTTTTGATAGTGATAGTACTGAAAATACTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT(SEQ ID NO:20I)。
[0573]在本发明的一个任选实施方案中，本发明的多核苷酸包含下列编码SEQ ID NO:2的轻链多肽序列的多核苷酸序列或可选择地由所述多核苷酸序列组成:
[0574]GCCCTTGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCAATTTAGCCTGGTATCAACAGAGACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGATGCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGTTGGCACTTACTACTGTCAAAGTGCTTTTGATAGTGATAGTACTGAAAATACTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQ ID NO:202)。
[0575]在本发明的另一个任选实施方案中，本发明的多核苷酸包含下列编码SEQ IDNO:3的可变重链多肽序列的多核苷酸序列或可选择地由所述多核苷酸序列组成:
[0576]CAGTCGCTGGAGGAGTCC GGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGCTTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTACTAGTATTGGTAGCACAGTCTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGCTACGATGACTATGATGAGATGACCTACTTTAACATCTGGGGCCAGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO:203)。
[0577]在本发明的一个任选实施方案中，本发明的多核苷酸包含下列编码SEQ ID NO:4的重链多肽序列的多核苷酸序列或可选择地由所述多核苷酸序列组成:
【权利要求】
1.一种产生多亚基复合物的方法，其包括: (a)提供包含含有提供所述多亚基复合物的亚基的表达的基因的真核细胞的培养物； (b)将大剂量的乙醇添加至所述培养物；和 (C)培养所述培养物以产生所述多亚基复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述大剂量乙醇相对于在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的所述相同方法增加稳定的二硫键的形成。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多亚基复合物包含一个或多个包含至少一个二硫键的多妝。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述多亚基复合物包含抗体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其相对于在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的所述相同方法降低一种或多种产物相关变体的相对丰度。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其相对于在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的所述相同方法降低产物相关变体的相对丰度，所述变体具有比所述期望的多亚基复合物更高或更低的表观分子量，如通过尺寸排阻色谱法或凝胶电泳所检测的。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其相对于在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的所述相同方法降低具有异常化学计量的复合物的相对丰度。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其相对于在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的所述相同方法降低具有异常二硫键的复合物的相对丰度。·
9.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其相对于在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的所述相同方法降低具有降低的半胱氨酸的复合物的相对丰度。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其相对于在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的所述相同方法降低具有异常糖基化的复合物的相对丰度。
11.根据权利要求4所述的方法，其调节重链间二硫键的形成或稳定性。
12.根据权利要求4或11所述的方法，其调节连接轻链与重链的二硫键的形成或稳定性。
13.根据权利要求4或11至12中任一项所述的方法，其相对于在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的所述相同方法降低一种或多种产物相关变体的相对丰度。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述产物相关变体包括H1L1、H2L1和H4L4产物相关变体的一种或多种。
15.根据权利要求4或11至14中任一项所述的方法，其相对于在所述大剂量乙醇不存在的情况下进行的所述方法增加所述抗体的纯度。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(c)之前进行步骤(b)。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中在步骤(c)后进行步骤(b)。
18.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中将步骤(b)与步骤(c)同时进行。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)导致所述培养物中的乙醇浓度在约0.01%与约4%(w/v)之间。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)导致所述培养物中的乙醇浓度在约0.01%与约4%之间、约0.02%与约3.75%之间、约0.04%与约3.5%之间、约0.08%与约3.25%之间、约0.1%与约3%之间、约0.2%与约2.75%之间、约0.3%与约2.5%之间、约0.4%与约2.25%之间、约0.5%与约1.5%之间、约0.5%与约2%之间、约0.6%与约1.75%之间、约0.7%与约1.5%或约0.8%与约1.25%之间。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)导致所述培养物中的乙醇浓度为至少约 0.01%,0.02%,0.03%,0.04%,0.05%,0.06%,0.07%,0.08%,0.09%,0.10%,0.2%、0.3%、0.4%、0.6%、0.6%、0.7%、0.8% 或 0.9%(w/v)。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)导致所述培养物中的乙醇浓度为至多约 4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.8%、1.6%、1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、1.1%、1.0%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.35%、0.3%、0.25%、0.2% 或 0.15%(w/v)。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括将乙醇添加至所述培养物，将包含乙醇的载体添加至所述培养物，将所述细胞添加至培养基或包含乙醇的载体，或替换部分所述培养基。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在I至20分钟的时间段内将所述大剂量乙醇添加至所述培养基。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括给所述细胞提供氧。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述提供氧包括搅拌所述培养物。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述提供氧包括将所述培养物与包含氧的气体混合物接触。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括将含有碳源的进料添加至所述培养物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述进料包含至少一种可发酵碳源。
30.根据权利要求28所述的方法`，其中所述进料包含葡萄糖、乙醇、柠檬酸盐、山梨醇、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、蜜二糖、乳糖、麦芽糖、鼠李糖、核糖、甘露糖、甘露醇和棉子糖的一种或多种。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤(c)期间将乙醇的浓度维持在上设置点与下设置点之间。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述下设置点为约0.01%,0.02%,0.03%,0.04%、0.05%,0.06%,0.07%,0.08%,0.09%,0.10%,0.2%、0.3%、0.4%、0.6%、0.6%、0.7%、0.8% 或0.9% (w/V)。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述上设置点为约4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.8%、1.6%、1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、1.1%、1.0%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.35%、0.3%、0.25%、0.2% 或 0.15%(w/v)。
34.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述上设置点至多为约1.5%、1.4%、1.3、1.2% 或 1.l%(w/v)。
35.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤(c)期间将乙醇浓度维持在设置点。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述设置点为约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、01.%、O 1.1%、01.2%、01.3%、01.4% 或 01.5%(w/v)。
37.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括将所述培养物中的乙醇浓度维持在约0.01%与约4%之间、约0.02%与约3.75%之间、约0.04%与约3.5%之间、约0.08%与约3.25%之间、约0.1%与约3%之间、约0.2%与约2.75%之间、约0.3%与约，2.5%之间、约0.4%与约2.25%之间、约0.5%与约2%之间、约0.6%与约1.75%之间、约0.7%与约1.5%或约0.8%与约1.25%之间。
38.根据权利要求21至27中任一项所述的方法，其中所述培养物中的乙醇浓度通过控制由所述细胞进行的乙醇产生或通过将乙醇添加至所述培养物来维持。
39.根据权利要求28所述的方法，其中控制乙醇产生的步骤包括控制葡萄糖的浓度、氧的可用度、搅拌的强度、气压、供应的空气或其它气体混合物的流速、所述培养物粘度、培养物密度、所述供应的空气或其它气体混合物中氧的浓度以及温度的一项或多项。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)与步骤(b)之间的时间少于约72小时、少于约48小时、少于约24小时、少于约12小时、少于约9小时、少于约6小时、少于约5小时、少于约4小时、少于约3小时、少于约90分钟、少于约30分钟、少于约5分钟或少于约I分钟。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)与步骤(c)之间的时间少于约10小时、少于约9小时、少于约8小时、少于约7小时、少于约6小时、少于约5小时、少于约4小时、少于约3小时、少于约2小时、少于约90分钟、少于约80分钟、少于约70分钟、少于约60分钟、少于约50分钟、少于约40分钟、少于约30分钟、少于约20分钟、少于约10分钟、少于约5分钟或少于约I分钟。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤(a)的培养物通过向所述培养物添加碳源，以及培养所述培养物直至所述碳源被耗尽来产生。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述碳源包括以下的一种或多种:甘油、葡萄糖、乙醇、柠檬酸盐、山 梨醇、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、蜜二糖、乳糖、麦芽糖、鼠李糖、核糖、甘露糖、甘露醇和棉子糖。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中碳源的耗尽通过检测所述真核细胞的代谢活动的减弱来测定。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述真核细胞的代谢活动的所述减弱通过检测所述真核细胞对氧的消耗的减少，通过检测培养物的PH的升高，通过检测湿细胞团的稳定化，或通过检测培养物中的氨浓度的增加来鉴定。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述真核细胞对氧的消耗的所述减少通过检测所述培养物中溶解氧的浓度的增加来鉴定。
47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述真核细胞包括酵母细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述酵母细胞包括甲醇营养型酵母。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述甲醇营养型酵母属于毕赤酵母属。
50.根据权利要求49所述的方法，其中毕赤酵母属的所述甲醇营养型酵母是巴斯德毕赤酵母。
51.根据权利要求49所述的方法，其中毕赤酵母属的所述甲醇营养型酵母选自:安格斯毕赤酵母、季也蒙毕赤氏酵母、甲醇毕赤酵母和因诺托毕赤氏酵母。
52.根据权利要求49所述的方法，其中提供所述多亚基复合物的表达的基因被整合到一个或多个基因组基因座中。
53.根据权利要求49所述的方法，其中所述基因组基因座的至少一个选自pGAP基因座、3’ AOX TT 基因座、PpURA5、0CHl、A0Xl、HIS4、GAP、pGAP、3’ AOX TT、ARG 和 HIS4TT 基因座。
54.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在诱导型或组成型启动子的控制下表达编码所述多亚基复合物的所述亚基的基因中的至少一个。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述诱导型启动子选自A0XUCUP1、四环素诱导型启动子、硫胺酸诱导型启动子以及FLDl启动子。
56.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在选自以下的启动子的控制下表达编码所述多亚基复合物的所述亚基的基因中的至少一个:CUP1、A0X1、ICL1、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)、FLDU ADH1、醇脱氢酶I1、GAL4、PH03、PH05以及Pyk启动子、四环素诱导型启动子、硫胺素诱导型启动子、来源于其的嵌合启动子、酵母启动子、哺乳动物启动子、昆虫启动子、植物启动子、爬行动物启动子、两栖动物启动子、病毒启动子和禽类启动子。
57.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述真核细胞是二倍体、四倍体细胞或多倍体。
58.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括从所述真核细胞或从所述培养基纯化所述多亚基复合物。
59.根据权利要求58所述的方法，其中从所述真核细胞的细胞内组分、细胞质、核质或膜纯化所述多亚基复合物。
60.根据权利要求58所 述的方法，其中所述真核细胞分泌所述多亚基复合物至所述培养基中。
61.根据权利要求60所述的方法，其中从所述培养基纯化所述多亚基复合物。
62.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多亚基复合物包括单特异性或双特异性抗体。
63.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多亚基复合物包括人抗体或人源化抗体或其片段。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述人源化抗体具有小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊或牛来源。
65.根据权利要求62所述的方法，其中所述人源化抗体具有兔来源。
66.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多亚基复合物包括单价、双价或多价抗体。
67.根据权利要求4或权利要求61至66中任一项所述的方法，其中通过蛋白A和/或蛋白G亲和从所述培养物纯化所述抗体。
68.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中最优化基因的至少一个以在所述真核细胞中表达，所述基因在所述小组的所述真核细胞的至少一个中提供所述多亚基复合物的亚基的表达。
69.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多亚基复合物包含抗体并且所述抗体的纯度通过测量由所述真核细胞产生的抗体的分数来评估，所述抗体包含在具有预期的表观流体力学半径的抗体复合物中，包含在具有预期的分子量的抗体复合物中，和/或特异性结合所述抗体的靶。
70.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多亚基复合物包含抗体并且所述抗体的产量通过测定扣除任何产物相关变体的由所述真核细胞产生的抗体的量来评估，所述变体被异常糖基化，包含在除具有预期的表观流体力学半径的复合物外的所述抗体复合物中，包含在具有预期的分子量的抗体复合物中，和/或不能特异性结合所述抗体的靶。
71.根据权利要求58或59所述的方法，其中所述抗体复合物的分子量通过非还原SDS-PAGE来测定。
72.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多亚基复合物包含抗体，所述方法还包括纯化所述抗体。
73.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养细胞产生至少100mg/L、至少 150mg/L、至少 200mg/L、至少 250mg/L、至少 300mg/L、100 至 300mg/L、100 至 500mg/L、100 至 1000mg/L、至少 1000mg/L、至少 1250mg/L、至少 1500mg/L、至少约 1750mg/L、至少约2000mg/L、至少约10000mg/L或更多的上清液抗体滴度。
74.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多亚基复合物的一个或多个亚基从超过Iv基因拷贝表达。
75.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多亚基复合物包含抗体，所述抗体从1-10个拷贝的编码所述抗体的轻链的基因和从1-10个拷贝的编码所述抗体的重链的基因表达。
76.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将提供所述多亚基复合物的表达的基因整合到所述细胞的基因组中。
77.根据权利要求1-75中任一项所述的方法，其中提供所述多亚基复合物的表达的基因包含在染色体外元件、质粒或人工染色体中。
78.根据权利要求7·6或77所述的方法，其中所述细胞包含比提供所述抗体的重链的表达的所述基因的拷贝更多的提供所述抗体的轻链的表达的所述基因的拷贝。
79.根据权利要求76或76所述的方法，其中所述细胞中编码所述抗体的重链的所述基因的拷贝数和编码所述抗体的轻链的所述基因的拷贝数各自是:2和2、2和3、3和3、3和4、3和5、4和3、4和4、4和5、4和6、5和4、5和5、5和6或5和7。
80.根据权利要求76或77所述的方法，其中所述细胞中的编码所述抗体的重链的所述基因的拷贝数和编码所述抗体的轻链的所述基因的拷贝数分别为:2和1、3和1、4和1、5和1、6和1、7和1、8和1、9和1、10和1、1和2、2和2、3和2、4和2、5和2、6和2、7和2、8 和 2、9 和 2、10 和 2、1 和 3、2 和 3、3 和 3、4 和 3、5 和 3、6 和 3、7 和 3、8 和 3、9 和 3、10和 3、1和4、2和4、3和4、4和4、5和4、6和4、7和4、8和4、9和4、10和4、1和5、2和 5、3和 5、4 和 5、5 和 5、6 和 5、7 和 5、8 和 5、9 和 5、10 和 5、1 和 6、2 和 6、3 和 6、4 和 6、5 和 6、6和6、7和6、8和6、9和6、10和6、1和7、2和7、3和7、4和7、5和7、6和7、7和7、8和7、9和7、10和7、I和8、2和8、3和8、4和8、5和8、6和8、7和8、8和8、9和8、10和8、I和9、2 和 9、3 和 9、4 和 9、5 和 9、6 和 9、7 和 9、8 和 9、9 和 9、10 和 9、1 和 10、2 和 10、3 和 10、4和 10、5 和 10、6 和 10、7 和 10、8 和 10、9 和 10,10 和 10。
81.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述步骤(c)的培养物在生产培养基中生长。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述生产培养基是基本培养基。
83.根据权利要求81所述的方法，其中所述基本培养基不存在选择剂。
84.根据权利要求81所述的方法，其中所述基本培养基不存在预形成的氨基酸或其它复合生物分子。
85.根据权利要求81所述的方法，其中所述生产培养基是复合培养基。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述复合培养基包含酵母提取物、大豆蛋白胨和其它植物蛋白胨的一种或多种。
87.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述步骤(c)的培养物生长至高细胞密度。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述高细胞密度为至少50g/L。
89.根据权利要求87所述的方法，其中所述高细胞密度为至少100g/L。
90.根据权利要求87所述的方法，其中所述高细胞密度为至少300g/L。
91.根据权利要求87所述的方法，其中所述高细胞密度为至少400g/L。
92.根据权利要求87所述的方法，其中所述高细胞密度为至少500g/L。
93.根据权利要求87所述的方法，其中所述高细胞密度为至少750g/L。
94.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将酵母细胞培养至少20个倍增，并且在至少20个倍增后维持所述多亚基复合物的高水平表达。
95.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述步骤(c)的细胞培养至少50个倍增并且在所述至少50个倍增后维持所述多亚基复合物的高水平表达。`
96.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述步骤(c)的细胞培养至少100个倍增并且在所述至少100个倍增后维持所述多亚基复合物的高水平表达。
97.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多亚基复合物的至少一个亚基包含分泌信号。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述多亚基复合物包含抗体。
99.根据权利要求97或98所述的方法或组合物，其中分泌信号包含一种或多种选自:SEQ ID NOS:414至437及其任何组合的多肽。
100.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多亚基复合物不是2010年12月I日提交的美国临时申请号61/418，832、2011年12月I日提交的PCT/US11/62963、2011年12月I日提交的美国序列号13/309，295、2011年12月I日提交的美国序列号13/309，153,2011年12月I日提交的美国序列号13/308，665和2011年12月I日提交的美国序列号13/308,831中公开的抗体中的任一种。
101.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多亚基复合物不是Abl-NGF、Ab2-NGF、Ab3-NGF、Ab4_NGF、Ab5_NGF、Ab6_NGF、Ab7_NGF、Ab8_NGF、Ab9_NGF、Ab IO-NGF,Ab11-NGF, Abl2-NGF、Abl3_NGF、Abl4_NGF、Abl5_NGF、Abl6_NGF、Abl7_NGF、Abl8_NGF、Abl9-NGF、Ab20-NGF 和 Ab21-NGF 或 Fab2 或其 Fabl 片段。
102.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多亚基复合物不包含以下抗体的任一种中包含的互补性决定区(⑶幻的至少I个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少全部 6 个:Abl-NGF、Ab2_NGF、Ab3_NGF、Ab4_NGF、Ab5_NGF、Ab6_NGF、Ab7_NGF、Ab8-NGF、Ab9-NGF、Ab 10-NGF, Ab 11-NGF, Abl2_NGF、Ab 13-NGF, Abl4_NGF、Abl5_NGF、Abl6-NGF、Abl7-NGF、Abl8_NGF、Abl9_NGF、Ab20_NGF 或 Ab21_NGF，并且所述抗体任选地具有对于NGF的结合特异性。
103.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多亚基复合物不包含如下序列或不由所述序列组成:分别地SEQ ID NO:51和401的轻链和重链多肽序列、分别地SEQ IDNO: 53和402的轻链和重链多肽序列、分别地SEQ ID NO:405和406的轻链和重链多肽序列和分别地SEQ ID NO:407和408的轻链和重链多肽序列。
104.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多亚基复合物不包含抗体，所述抗体含有SEQ ID NO:55、56、57、58、59和60的CDR的至少I个、至少2个、至少3个、至少4个、至少4个、至少5个或至少全部6个的抗体，并且任选地具有对于NGF的结合特异性。
105.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多亚基复合物不包含本文中在标题为“抗-NGF抗体及其具有 对于NGF的结合活性的结合片段”和“编码抗-NGF抗体多肽的多核苷酸”的部分中公开的抗体或抗体编码序列的任一种。
【文档编号】C12N1/19GK103827290SQ201280035868
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年5月8日 优先权日:2011年5月20日
【发明者】P·D·麦克尼尔, N·詹森, G·L·莱斯尼基, P·齐, J·A·莱瑟姆, L·F·加西亚-马丁内斯 申请人:奥尔德生物控股有限责任公司